CN103598098B - 粉葛组织培养快速育苗方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物组织培养繁殖技术领域，一种粉葛组织培养快速育苗方法，包括如下步骤：（1）预处理；（2）无菌材料体系的建立；（3）诱导培养；（4）芽的增殖；（5）生根培养；（6）炼苗移栽；本发明的粉葛组织培养快速育苗方法，应用组织培养方法，可以有效的保持优良母本的稳定性状。与常规的扦插和压条繁殖相比，组织培养能够用较少的优良母本，繁殖出大批量的种苗。在同一时间段内（60d），扦插每个母本只能繁殖出一个有效苗，组织培养的繁殖系数是扦插的20～30倍。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养繁殖技术领域，一种粉葛组织培养快速育苗方法。
背景技术
粉葛(Puerariaelobatavar.Thomsonii),为豆科(Leguminosae)葛属(Pueraria)植物。在我国有8种及2变种，主要分布于西南部、中南部至东南部，长江以北少见。粉葛的食用部分为块根，俗称“葛根”。
葛根是我国卫生部认定的药食两用的山地植物。葛根味甘，辛，性平，具有解肌退热、生津、透疹、升阳止泻之功；葛根素(异黄酮类化合物)含量高，具有降低血压、降低心肌耗氧量、减慢心率、扩张冠血状管改善正常和缺血心肌的代谢，改善脑循环和外周循环等作用。随着现代医药、食品科技的不断发展，葛根的药理、药化、临床应用、食品开发研究等发面的不断深入，其使用价值越来越引起人们的关注，被誉为“亚洲人参”。世界粮农组织等权威机构预测，全球葛根需求量将至5000万吨/年(折合2000万亩)。
此外，粉葛淀粉含量高，一些优良品种淀粉含量可高达25％，7.5kg鲜粉葛即可生产燃料乙醇1kg。单位面积土地的乙醇生产率粉葛高于玉米、甘薯等粮食作物，而且粉葛生物固氮效率高，耐贫瘠，具有充分挖掘土地潜力的优势。粉葛作为非粮食生物质新材料，避免了“与民争粮，与粮争地”的瓶颈，具有巨大的开发利用价值。
大巴山粉葛(Puerarialobata(wild)Ohwi'Dabashan')是由达州市林业科技推广站从野生葛品种中驯化的良种，2010年通过四川省林木品种审定委员会审定(登记编号为：川R-WTS-PL-023-2009)，成为秦巴山区发展粉葛产业主推的主导品种，发展面积增长迅速，对种苗需求量大。
目前大巴山粉葛的繁殖主要以压条和扦插繁殖传统方法为主，繁殖系数低，获得的种苗数量有限，无法满足当前农业生产上的需求，如何提供大量优质的种苗成为当前亟待解决的问题。
植物组织培养快速繁殖是当代农业生物技术在生产上应用最广泛、产生经济效益最大的一个领域。组织培养快速繁殖种苗具有其独特的优越性，首先繁殖系数大，能以比常规方法快数千到数百万倍的速度进行扩大繁殖，及时提供大量优质种苗，使一个新的品种能够在短时间内满足生产的需要，加速引种和良种的推广进程；使用的繁殖材料小和少；繁殖苗木整齐一致，商品性高，能够保持原品种的优良特性；可进行周年工厂化育苗，生产效率高。对一些繁殖系数低、不能用种子繁殖(无种子或种子繁殖后代出现种性的衰退)的植物品种的繁殖，利用组织培养快速繁殖更为重要。
目前，虽然已有葛属京西葛、粉葛、美国葛藤、泰国葛和野葛几个品种的组织培养育苗技术专利与报道发表，但不同物种，甚至同一物种、不同品种之间，其组织培养方法也有很大的差异性。大巴山粉葛是一个新品种，还尚无组织培养快速育苗的报道。而且，粉葛组织培养还存在这一些问题：野外取材很难保证母本的遗传品质；粉葛葛藤上绒毛多，污染率高，难以建立无菌体系；增殖率低。因此，寻求并探索大巴山粉葛组织培养快速繁殖育苗技术，是扩大大巴山粉葛种源生产，解决生产中种苗需求的迫切任务。
发明内容
本发明目的是提供一种粉葛组织培养育苗方法，利用组织培养技术，提高粉葛的繁殖系数，培育出遗传性状稳定的粉葛无性系。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种粉葛组织培养快速育苗方法，包括如下步骤：
(1)预处理将优株块根进行盆栽，放置在温室大棚中，待其发出芽藤蔓长至20cm，开始喷洒1％多菌灵溶液，每周一次，持续一个半月，藤蔓长至1m时开始取材；
(2)无菌材料体系的建立选取当年生粉葛葛藤，剪去叶片和叶柄，切割成1.0～1.5cm长带有腋芽的茎段，将带芽茎段置于自来水下冲洗30min，然后用洗衣粉液浸泡10～30min，用软刷刷洗茎段后再置流水下冲洗1～2h，在超净工作台上，将洗涤好的茎段用质量浓度为75％酒精浸泡15～20s，无菌水冲洗2～4次，然后用0.1％的氯化汞浸泡3～5min，无菌水冲洗4～6次再用2％次氯酸钠处理8～10min，无菌水冲洗4～6次，用滤纸吸干带芽茎段获得无菌材料；
(3)诱导培养将上述步骤获得的无菌带芽茎段先接种到1/2MS培养基上，黑暗条件下培养10～15d，减少褐化发生，然后转入芽诱导培养基上促进腋芽的萌发和生长，按光照和黑暗时间比为2:1交替进行诱导培养；
(4)芽的增殖芽诱导培养25±2d，腋芽萌发生长至1～1.5cm，将其全部转入增殖培养基进行反复增殖，获得大量的增殖苗后转入生根培养；
(5)生根培养从增殖培养中选取2～3cm的芽进行生根培养；
(6)炼苗移栽将生根培养的组培苗从培养室取出，将培养瓶移到温室中进行强光闭瓶练苗6～8d，然后打开瓶口，在瓶内加入PP333与多菌灵混合液，防止细菌污染以及促进壮苗，再放置7～10d，炼苗完成后，用镊子将试管苗轻轻取出，放入清水盆中，小心洗去根部琼脂，然后涝出，用多菌灵处理后移栽至营养土中，营养土上层为2cm河沙，下层为4cm珍珠岩、蛭石及腐殖质混合物，待有新叶长出后按常规苗圃育苗措施管理。
进一步的：所述粉葛选自大巴山粉葛。
进一步的：所述步骤(2)的诱导培养条件为：温度24～26℃、光强2500lx、湿度70％。
进一步的：所述步骤(3)的芽诱导培养基含有MS基础培养基+0.5～1.0mg/L6-BA+0.1～0.3mg/LIBA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L。
进一步的：所述步骤(4)的增殖培养基含有MS基础培养基+0.3～0.5mg/L6-BA+0～0.1mg/LIBA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L。
进一步的：所述步骤(5)的生根培养基含有1/2MS基础培养基+0～0.1mg/LIBA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L。
进一步的：所述培养基的pH为5.8～6.0。
进一步的：所述步骤(6)炼苗移栽时空气温度为20～25℃，湿度为85％。
本发明中，1/2MS指MS培养基中的大量元素减半，其他均保持不变。
本发明的有益技术效果是：本发明的粉葛组织培养快速育苗方法，应用组织培养方法，可以有效的保持了优良母本的稳定性状。与常规的扦插和压条繁殖相比，组织培养能够用较少的优良母本，繁殖出大批量的种苗。在同一时间段内(60d)，扦插每个母本只能繁殖出一个有效苗，组织培养的繁殖系数是扦插的的20～30倍。
具体实施方式
下面结合具体实施实例对本发明做进一步说明；
实施实例一
一种粉葛组织培养快速育苗方法，包括如下步骤：
(1)预处理将大巴山粉葛优株块根进行盆栽，放置在温室大棚中，待其发出芽藤蔓长至20cm，开始喷洒1％多菌灵溶液，每周一次，持续一个半月，藤蔓长至1m时开始取材；
(2)无菌材料体系的建立选取当年生粉葛葛藤，剪去叶片和叶柄，切割成1.0cm长带有腋芽的茎段，将带芽茎段置于自来水下冲洗30min，然后用洗衣粉液浸泡10min，用软刷刷洗茎段后再置流水下冲洗1h，在超净工作台上，将洗涤好的茎段用质量浓度为75％酒精浸泡150s，无菌水冲洗2次，然后用0.1％的氯化汞浸泡3min，无菌水冲洗4次再用2％次氯酸钠处理8min，无菌水冲洗4次，用滤纸吸干带芽茎段获得无菌材料；
(3)诱导培养将上述步骤获得的无菌带芽茎段先接种到1/2MS培养基上，黑暗条件下培养10d，减少褐化发生，然后转入芽诱导培养基(诱导培养基含有MS基础培养基+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LIBA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L)上促进腋芽的萌发和生长，按光照和黑暗时间比为2：1交替进行诱导培养，培养温度24℃、光强2500lx、湿度70％；
(4)芽的增殖在芽诱导培养23d，腋芽萌发生长至1cm，将其全部转入增殖培养基(增殖培养基含有MS基础培养基+0.3mg/L6-BA+0.1mg/LIBA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L)进行反复增殖培养，获得大量的增殖苗后转入生根培养；
(5)生根培养从增殖培养中选取2cm的芽进行生根培养(生根培养基含有1/2MS基础培养基+0.1mg/LIBA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L)；
(6)炼苗移栽将生根培养的组培苗从培养室取出，将培养瓶移到温室中进行强光闭瓶练苗6d，然后打开瓶口，再放置3d，炼苗完成后，用镊子将试管苗轻轻取出，放入清水盆中，小心洗去根部琼脂，然后涝出，用多菌灵处理后移栽至营养土中，营养土上层为2cm河沙，下层为4cm珍珠岩、蛭石及腐殖质混合物，空气温度控制在20℃，湿度为85％，待有新叶长出后按常规苗圃育苗措施管理。
上述所用的培养基均采用1mol/L的HCl和NaOH调节培养基pH为5.8～6.0。
实施实例二
一种粉葛组织培养快速育苗方法，包括如下步骤：
(1)预处理将大巴山粉葛优株块根进行盆栽，放置在温室大棚中，待其发出芽藤蔓长至20cm，开始喷洒1％多菌灵溶液，每周一次，持续一个半月，藤蔓长至1m时开始取材；
(2)无菌材料体系的建立选取当年生粉葛葛藤，剪去叶片和叶柄，切割成1.3cm长带有腋芽的茎段，将带芽茎段置于自来水下冲洗30min，然后用洗衣粉液浸泡20min，用软刷刷洗茎段后再置流水下冲洗1.5h，在超净工作台上，将洗涤好的茎段用质量浓度为75％酒精浸泡18s，无菌水冲洗3次，然后用0.1％的氯化汞浸泡4min，无菌水冲洗5次再用2％次氯酸钠处理9min，无菌水冲洗5次，用滤纸吸干带芽茎段获得无菌材料；
(3)诱导培养将上述步骤获得的无菌带芽茎段先接种到1/2MS培养基上，黑暗条件下培养13d，减少褐化发生，然后转入芽诱导培养基(诱导培养基含有MS基础培养基+0.7mg/L6-BA+0.2mg/LIBA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L)上促进腋芽的萌发和生长，按光照和黑暗时间比为2:1交替进行诱导培养，培养温度25℃、光强2500lx、湿度70％；
(4)芽的增殖在芽诱导培养25d，腋芽萌发生长至1.2cm，将其全部转入增殖培养基(增殖培养基含有MS基础培养基+0.4mg/L6-BA+0.1mg/LIBA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L)进行反复增殖培养，获得大量的增殖苗后转入生根培养；
(5)生根培养从增殖培养中选取2.5cm的芽进行生根培养(生根培养基含有1/2MS基础培养基+0.1mg/LIBA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L)；
(6)炼苗移栽将生根培养的组培苗从培养室取出，将培养瓶移到温室中进行强光闭瓶练苗7d，然后打开瓶口，再放置5d，炼苗完成后，用镊子将试管苗轻轻取出，放入清水盆中，小心洗去根部琼脂，然后涝出，用多菌灵处理后移栽至营养土中，营养土上层为2cm河沙，下层为4cm珍珠岩、蛭石及腐殖质混合物，空气温度控制在20℃，湿度为85％，待有新叶长出后按常规苗圃育苗措施管理。
上述所用的培养基均采用1mol/L的HCl和NaOH调节培养基pH为5.8～6.0。
实施实例三
一种粉葛组织培养快速育苗方法，包括如下步骤：
(1)预处理将大巴山粉葛优株块根进行盆栽，放置在温室大棚中，待其发出芽藤蔓长至20cm，开始喷洒1％多菌灵溶液，每周一次，持续一个半月，藤蔓长至1m时开始取材；
(2)无菌材料体系的建立选取当年生粉葛葛藤，剪去叶片和叶柄，切割成1.5cm长带有腋芽的茎段，将带芽茎段置于自来水下冲洗30min，然后用洗衣粉液浸泡30min，用软刷刷洗茎段后再置流水下冲洗2h，在超净工作台上，将洗涤好的茎段用质量浓度为75％酒精浸泡20s，无菌水冲洗4次，然后用0.1％的氯化汞浸泡5min，无菌水冲洗6次再用2％次氯酸钠处理10min，无菌水冲洗6次，用滤纸吸干带芽茎段获得无菌材料；
(3)诱导培养将上述步骤获得的无菌带芽茎段先接种到1/2MS培养基上，黑暗条件下培养15d，减少褐化发生，然后转入芽诱导培养基(诱导培养基含有MS基础培养基+1.0mg/L6-BA+0.3mg/LIBA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L)上促进腋芽的萌发和生长，按光照和黑暗时间比为2：1交替进行诱导培养，培养温度24℃、光强2500lx、湿度70％；
(4)芽的增殖在芽诱导培养27d，腋芽萌发生长至1.5cm，将其全部转入增殖培养基(增殖培养基含有MS基础培养基+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LIBA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L)进行反复增殖培养，获得大量的增殖苗后转入生根培养；
(5)生根培养从增殖培养中选取3cm的芽进行生根培养(生根培养基含有1/2MS基础培养基+0.1mg/LIBA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L)；
(6)炼苗移栽将生根培养的组培苗从培养室取出，将培养瓶移到温室中进行强光闭瓶练苗8d，遮阴度为70％，然后打开瓶口，再放置7d，炼苗完成后，用镊子将试管苗轻轻取出，放入清水盆中，小心洗去根部琼脂，然后涝出，用多菌灵处理后移栽至营养土中，营养土上层为2cm河沙，下层为4cm珍珠岩、蛭石及腐殖质混合物，空气温度控制在20℃，湿度为85％，待有新叶长出后按常规苗圃育苗措施管理。
上述所用的培养基均采用1mol/L的HCl和NaOH调节培养基pH为5.8～6.0。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种粉葛组织培养快速育苗方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)预处理将优株块根进行盆栽，放置在温室大棚中，待其发出芽藤蔓长至20cm，开始喷洒1％多菌灵溶液，每周一次，持续一个半月，藤蔓长至1m时开始取材；
(2)无菌材料体系的建立选取当年生粉葛葛藤，剪去叶片和叶柄，切割成1.0～1.5cm长带有腋芽的茎段，将带芽茎段置于自来水下冲洗30min，然后用洗衣粉液浸泡10～30min，用软刷刷洗茎段后再置流水下冲洗1～2h，在超净工作台上，将洗涤好的茎段用质量浓度为75％酒精浸泡15～20s，无菌水冲洗2～4次，然后用0.1％的氯化汞浸泡3～5min，无菌水冲洗4～6次，再用2％次氯酸钠处理8～10min，无菌水冲洗4～6次，用滤纸吸干带芽茎段获得无菌材料；
(3)诱导培养将上述步骤获得的无菌带芽茎段先接种到1/2MS培养基上，黑暗条件下培养10～15d，减少褐化发生，然后转入芽诱导培养基上促进腋芽的萌发和生长，按光照和黑暗时间比为2:1交替进行诱导培养；
(4)芽的增殖芽诱导培养25±2d，腋芽萌发生长至1～1.5cm，将其全部转入增殖培养基进行反复增殖，获得大量的增殖苗后转入生根培养；
(5)生根培养从增殖培养中选取2～3cm的芽进行生根培养；
(6)炼苗移栽将生根培养的组培苗从培养室取出，将培养瓶移到温室中进行强光闭瓶练苗6～8d，然后打开瓶口，在瓶内加入PP333与多菌灵混合液，防止细菌污染以及促进壮苗，再放置7～10d，炼苗完成后，用镊子将试管苗轻轻取出，放入清水盆中，小心洗去根部琼脂，然后捞出，用多菌灵处理后移栽至营养土中，营养土上层为2cm河沙，下层为4cm珍珠岩、蛭石及腐殖质混合物，待有新叶长出后按常规苗圃育苗措施管理；
所述步骤(3)的芽诱导培养基含有MS基础培养基+0.5～1.0mg/L6-BA+0.1～0.3mg/LIBA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L；
所述步骤(4)的增殖培养基含有MS基础培养基+0.3～0.5mg/L6-BA+0～0.1mg/LIBA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L；
所述步骤(5)的生根培养基含有1/2MS基础培养基+0～0.1mg/LIBA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L；
所述粉葛选自大巴山粉葛。
2.根据权利要求1所述粉葛组织培养快速育苗方法，其特征在于：所述步骤(3)的诱导培养条件为：温度24～26℃、光强2500lx、湿度70％。
3.根据权利要求1任一项所述粉葛组织培养快速育苗方法，其特征在于：所述培养基的pH为5.8～6.0。
4.根据权利要求1所述粉葛组织培养快速育苗方法，其特征在于：所述步骤(6)炼苗移栽时空气温度为20～25℃，湿度为85％。
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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Granted publication date: 20160406 Termination date: 20161119 |