CN109392708B - 岩黄连的两步成苗组培方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中药岩黄连的两步成苗组培方法，该方法以岩黄连叶片作为外植体，仅通过诱导培育和生根培育两步即可得到岩黄连的组培苗，比常规的组培省去了一个过程。利用本发明的方法可在短期内提供大量岩黄连的优质种苗，同时减少了配制培养基和转瓶的步骤，节约了大量人力物力，因此简单易行、生产成本低。而且本发明的方法是经过筛选出最佳的岩黄连组培种植技术，为建立岩黄连组培技术产业化标准奠定了基础。

Description

岩黄连的两步成苗组培方法

技术领域

本发明属于植物育苗技术领域，具体是中药岩黄连的两步成苗组培方法。

背景技术

岩黄连（Corydalis saxicola Bunting）是紫堇科紫堇属多年生草本植物，在广西多见于桂西北山区，自然生长于岩石峭壁或高山岩洞，生长温度在15℃－25℃之间，由于其生长条件较为苛刻，因而地区分布较窄，以东兰、巴马、都安、靖西、德保较多，它已成为当地民众用于消炎止痛、拔毒、治疗疥疮肿毒以及治疗肝炎、肝硬化等疾病的常用中草药。岩黄连全草含脱氢卡维丁（岩黄连碱）等活性成分，具有显著的抗菌、消炎、镇痛和强安定作用，并有抑制肿瘤细胞作用。目前岩黄连的应用越来越广泛，已经成为广西中草药中的一个瑰宝。

目前岩黄连的研究已涉及植物形态和分布、化学成分、药理作用以及其制剂的临床应用等，但在组培育苗方面研究较少。岩黄连作为民间药物，少有人工大量栽培，由于近年来的开发利用，人为过度采挖和自然生长缓慢导致其数量大量减少，难以满足市场需求和研究耗材。广西壮族自治区药用植物园在最近公开了一些岩黄连的培育方法，如在专利CN201611264732-岩黄连愈伤组织高效诱导方法中公开了一种能够高效诱导出愈伤组织且能使得愈伤组织快速增殖的诱导培养基，其培养基成分种类繁多，成本高，有些成分还具有一定的毒性，用量控制不当会增加幼苗的毒性残留，还会污染环境。又如专利CN201310537770-一种岩黄连组织培养快速繁殖方法，该方法公开了一种岩黄连的组织培养方法，但是需要经过3个步骤，耗时较长，成本较高。而专利CN201610108551-一种岩黄连的离体保存方法则是在专利CN201310537770的基础上进行改进，实现了岩黄连的组培两步成苗，可在短期内提供大量岩黄连的优质种苗，同时减少了配制培养基和转瓶的步骤，节约了大量人力物力，并有效解决了岩黄连种质资源保存及规模化育苗问题。但是整个周期仍然需要2-3个月，在培育周期和培育成本上还有待继续研究，缩短培育周期、降低培育成本，筛选出最佳的培育方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种岩黄连的两步成苗组培方法，该方法仅包括诱导培育和生根培育两步，可在短期内提供大量岩黄连的优质种苗，同时减少了配制培养基和转瓶的步骤，节约了大量人力物力，因此简单易行、生产成本低。该方法还是经过筛选出最佳的岩黄连组培种植技术，为建立岩黄连组培技术产业化标准奠定了基础。

岩黄连的两步成苗组培方法，包括以下步骤：

（1）外植体消毒：取岩黄连幼嫩健康叶片作为外植体，用自来水冲洗2遍，滤纸吸干表面水分，置于75%酒精中消毒30s，无菌水清洗2次，无菌纸吸干表面水分，移至0.1%升汞溶液消毒2min，无菌水清洗5次，无菌纸吸干表面水分。

（2）外植体预处理：切去消毒后叶片的叶缘和叶柄，再将叶片剩余部分切成约5mm×5mm规格方形或圆形或多边形的小片。

（3）诱导培育：将步骤（2）所得的小叶片移入诱导培养基中培育40天，诱导不定芽，培育条件：温度为24-28℃、光照强度为1900-2100lx、光照时间为12h/天。

（4）生根培育：将步骤（3）得到的不定芽从愈伤组织上取下，除去不定芽的枯死老叶，随后转至生根培养基中培育30天，培育条件：温度为24-28℃、光照强度为1900-2100lx、光照时间为12h/天。

所述诱导培养基为：MS +20g/L蔗糖 +4g/L卡拉胶 +0.6mg/L 6-BA +0.3mg/L IAA+0.3g/L AC，pH值为5.9；

所述生根培养基为：MS +20g/L蔗糖 +4g/L卡拉胶 +0.8mg/L NAA +0.3mg/L IBA，pH值为5.9。

所述诱导和生根培养基在被利用过并移除完嫩芽或幼苗后，立刻将其在121℃高压灭菌30-60min，在无菌条件下冷却，待温度降至100℃时将其倒出，再将其在搅拌下加入1-5mol/L的盐酸溶液，控制溶液中盐酸的浓度在0.1-0.5mol/L之间，保持温度为80-100℃反应3-5h，得到含小分子卡拉胶和小分子糖的物质；再将得到的物质与土壤或固体肥料以1:（10-20）的重量比混合施用于岩黄连的后续种植过程中。

所述岩黄连进行生根培育后还包括在室温为26℃的室内打开瓶盖，炼苗3-5天，先移栽进行营养培育壮苗生根后再移栽大田，具体步骤如下：

炼苗结束后，洗净组培苗根部的培养基，立即将幼苗移栽到河沙和营养土的重量比为1:2的营养袋中，用水浇透，搭小拱棚进行保温保湿，在小拱棚的塑料膜上面每隔10cm戳一个直径为1mm的小孔，5天后把在小拱棚的塑料膜上面每隔20cm戳一个直径为5mm的孔，12天后将原来直径为5mm的孔扩大至1cm，18天后将小拱棚拆除，一个月后带土移栽大田；小拱棚内的温度控制在22-28℃之间。

本发明的有益效果是：

1、本发明选取岩黄连叶片作为外植体，仅通过诱导培育和生根培育两步即可得到岩黄连的组培苗，比常规的组培省去了一个过程。利用本发明的方法可在短期内提供大量岩黄连的优质种苗，同时减少了配制培养基和转瓶的步骤，节约了大量人力物力，因此简单易行、生产成本低。

2、本发明使用的培养基采用卡拉胶作为凝固剂，成本比琼脂低，其培养基的透明度和弹性等方面比用琼脂好，组培苗生长也明显快于琼脂培养基的组培苗，且茎叶根生长量大，可缩短培育时间，降低生产成本。除此之外，卡拉胶可降解为小分子卡拉胶，小分子卡拉胶活性高、易于植物吸收利用。本发明使用的培养基添加的植物激素种类较少，且为常规使用的品种，成本低，较易被组培嫩芽吸收利用，组培后培养基上污染低，所含成分也较简单，可以经过灭菌降解后应用于岩黄连的后续种植。

3、本发明对外植体的消毒时间和组培各培养基的各成分含量都进行了试验和筛选，确定最佳消毒时间、诱导培养基的最适6-BA和IAA浓度、生根培养基的最适NAA和IBA浓度，选用最佳方法进行培育得到质量上等的岩黄连组培苗，为建立岩黄连组培技术产业化标准奠定了基础。本发明的培养基是专用于岩黄连培育的，经过反复试验和筛选，发现其具有很好的培育效果最终选定得到。本发明的组培苗经过炼苗、营养培育后才移栽大田，存活率高。

4、培养基是一类为植物生长发育提供营养的物质，经组织培养后，废弃的培养基仍是富含大量有机质的可利用资源，直接扔掉既浪费资源又污染环境，送去统一处理又需要耗费较多的人力和资金。本发明的培养基添加的植物激素种类较少，培育后污染较低，因此，在本发明将组培过程中移除嫩芽或幼苗后废弃的诱导和生根培养基，经过灭菌和降解处理后，再次应用到岩黄连后续的营养培育和大田培育中，既充分利用了培养基中的营养成分，使得大田培育的小苗生长得更快、更好，也免去了废弃培养基的处理，减少了其对环境的污染。

附图说明

图1是将1片方形小片刚移入诱导培养基时的图片；

图2是在诱导培养基中培育40天后愈伤分化不定芽的图片；

图3和图4均是在生根培养基中培育30天后不定芽生根的图片。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。

实施例1

岩黄连的两步成苗组培方法，包括以下步骤：

（1）外植体消毒：取岩黄连幼嫩健康叶片作为外植体，用自来水冲洗2遍，滤纸吸干表面水分，置于75%酒精中消毒30s，无菌水清洗2次，无菌纸吸干表面水分，移至0.1%升汞溶液消毒2min，无菌水清洗5次，无菌纸吸干表面水分。

（2）外植体预处理：切去消毒后叶片的叶缘和叶柄，再将叶片剩余部分切成5mm×5mm规格方形小片。

（3）诱导培育：将步骤（2）所得的小叶片移入诱导培养基中培育40天，诱导不定芽，培育条件：温度为24-28℃、光照强度为1900-2100lx、光照时间为12h/天；见图1-2。

（4）生根培育：将步骤（3）得到的不定芽从愈伤组织上取下，除去不定芽的枯死老叶，随后转至生根培养基中培育30天，培育条件：温度为24-28℃、光照强度为1900-2100lx、光照时间为12h/天；见图3-4。

所述诱导培养基为：MS +20g/L蔗糖 +4g/L卡拉胶 +0.6mg/L 6-BA +0.3mg/L IAA+0.3g/L AC，pH值为5.9；

所述生根培养基为：MS +20g/L蔗糖 +4g/L卡拉胶 +0.8mg/L NAA +0.3mg/L IBA，pH值为5.9。

所述岩黄连进行生根培育后还包括在室温为26℃的室内打开瓶盖，炼苗3-5天，先移栽进行营养培育壮苗生根后再移栽大田，具体步骤如下：

炼苗结束后，洗净组培苗根部的培养基，立即将幼苗移栽到河沙和营养土的重量比为1:2的营养袋中，用水浇透，搭小拱棚进行保温保湿，在小拱棚的塑料膜上面每隔10cm戳一个直径为1mm的小孔，5天后把在小拱棚的塑料膜上面每隔20cm戳一个直径为5mm的孔，12天后将原来直径为5mm的孔扩大至1cm，18天后将小拱棚拆除，一个月后带土移栽大田；小拱棚内的温度控制在22-28℃之间。移栽大田前记录幼苗的存活数并计算存活率，得到存活率约为99.6%；移栽大田后15天再次记录幼苗的存活数并计算存活率，得到存活率约为99.8%。

所述诱导和生根培养基在被利用过并移除完嫩芽或幼苗后，立刻将其在121℃高压灭菌30-60min，在无菌条件下冷却，待温度降至100℃时将其倒出，再将其在搅拌下加入1-5mol/L的盐酸溶液，控制溶液中盐酸的浓度在0.1-0.5mol/L之间，保持温度为80-100℃反应3-5h，得到含小分子卡拉胶和小分子糖的物质。将得到的物质与土壤或固体肥料以1:（10-20）的重量比混合施用于岩黄连的后续种植过程中；例如与大田土、腐熟农家肥以1：10：2的重量比混合作为营养培育中的营养土；若还有剩余，将其与农家肥或有机肥混合，作为大田移栽时的基肥。

为了说明废弃的培养基仍富含大量营养成分，并能在岩黄连的后续种植中应用以促进岩黄连的生长，本申请人将本发明废弃的培养基经过消毒灭菌和降解处理后，与大田土、腐熟农家肥以1：10：2的重量比混合作为营养培育中的营养土，再按河沙和营养土的重量比为1:2制作营养袋，培育岩黄连幼苗，并设置对照组，用大田土、腐熟农家肥以10：2的重量比混合作为营养培育中的营养土，按河沙和营养土的重量比为1:2制作营养袋，培育岩黄连幼苗，记录岩黄连幼苗的生长速度，具体情况如下：

由表1可以看出，在营养培育的营养土中添加废弃的培养基，可以促进岩黄连幼苗长高、长壮。

为了得到更好的组培苗，本申请人在确定消毒时间和组培各培养基的各成分含量时，还进行了试验筛选，具体包括以下内容：

（1）取岩黄连幼嫩健康叶片作为外植体，用自来水冲洗2遍，滤纸吸干表面水分，置于75%酒精中消毒30s，无菌水清洗2次，无菌纸吸干表面水分。

（2）将叶片平均分为4组，移至0.1%升汞溶液消毒，消毒时间分别是1-4min，时间到后立刻用无菌水清洗5次，无菌纸吸干表面水分。

（3）取出消毒后叶片在已灭菌的消毒纸上用切刀切去叶缘和叶柄，再将叶片剩余部分切成约5mm×5mm规格方形小片。

（4）将所得方形小片移至以MS为基本培养基同时添加蔗糖、卡拉胶、AC以及不同浓度6-BA和IAA的诱导培养基上，设置5个浓度处理组，见表2；每瓶培养基放1小片进行培育，每种培养基40瓶，放置在温度为24-28℃、光照强度为1900-2100lx、光照时间为12h/天的条件下进行诱导培育，20天后观察污染率及愈伤发生情况，记录数据，具体数据见表3。

根据表格数据对比，可以看出，在消毒时间为2min培养基3培育愈伤发生相对较好，愈伤发生率为60.0%；从消毒时间不同培养基相同的角度观察，其他消毒时间段，培养基3培养的愈伤发生率均低于2min时；从消毒时间相同培养基不同的角度观察，在同一消毒时间段，培养基3培养诱导的愈伤发生率均高于其他种类的培养基；从不同消毒时间段整体观察，2min时愈伤发生率总体较高，污染率总体较低。即，最适消毒时间为2min，诱导培养基：MS +20g/L蔗糖 +4g/L卡拉胶 +0.6mg/L 6-BA +0.3mg/L IAA +0.3g/L AC的诱导率最佳。

（5）在表3数据记录统计得出分析结果后，以消毒2min的5种培养基外植体愈伤作为实验观察对象，再培育20d后观察愈伤分化不定芽数和生长情况，记录数据，见表4。

从表4可以看出，使用培养基3培育愈伤发生相对较好，培育出来的不定芽数量多、嫩绿、茎干较粗、长势较好。

（6）将得到的不定芽从愈伤组织上取下，除去不定芽的枯死老叶，随后转至生根培养基中培育30天，培育条件：温度为24-28℃、光照强度为1900-2100lx、光照时间为12h/天；生根培养基是以MS为基本培养基同时添加蔗糖、卡拉胶、AC以及不同浓度NAA和IBA的培养基，设置5个浓度处理组（其中一个为空白对照），见表5；每瓶接1个不定芽，每种培养基8瓶；放置在温度为24-28℃、光照强度为1900-2100lx、光照时间为12h/天的条件下进行生根培育，30天后观察生根情况、平均株高和平均根长，记录数据，见表6。

由表6可知，在相同培育条件下，向MS培养基中加入NAA和IBA，不定芽生长情况比基础MS培养基好，培养基3培养的不定芽在生根、根长和株高方面均比其他组合生长得好，培养基3的生根率为75%，平均根长2.78cm，平均株高5.35cm；表明培养基：MS +20g/L蔗糖 +4g/L卡拉胶 +0.8mg/L NAA +0.3mg/L IBA较适合用于岩黄连生根培养。

经过试验筛选得出：外植体最佳消毒时间为2min，最佳诱导培养基为：MS +20g/L蔗糖 +4g/L卡拉胶 +0.6mg/L 6-BA +0.3mg/L IAA +0.3g/L AC，pH值为5.9；最佳生根培养基为：MS +20g/L蔗糖 +4g/L卡拉胶 +0.8mg/L NAA +0.3mg/L IBA，pH值为5.9。

Claims (3)

1.岩黄连的两步成苗组培方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）外植体消毒：取岩黄连幼嫩健康叶片作为外植体，用自来水冲洗2遍，滤纸吸干表面水分，置于75%酒精中消毒30s，无菌水清洗2次，无菌纸吸干表面水分，移至0.1%升汞溶液消毒2min，无菌水清洗5次，无菌纸吸干表面水分；

（2）外植体预处理：切去消毒后叶片的叶缘和叶柄，再将叶片剩余部分切成5mm×5mm规格的小片；

（3）诱导培育：将步骤（2）所得的小叶片移入诱导培养基中培育40天，诱导不定芽，培育条件：温度为24-28℃、光照强度为1900-2100lx、光照时间为12h/天；

（4）生根培育：将步骤（3）得到的不定芽从愈伤组织上取下，除去不定芽的枯死老叶，随后转至生根培养基中培育30天，培育条件：温度为24-28℃、光照强度为1900-2100lx、光照时间为12h/天；

所述诱导培养基为：MS +20g/L蔗糖 +4g/L卡拉胶 +0.6mg/L 6-BA +0.3mg/L IAA +0.3g/L AC，pH值为5.9；

所述生根培养基为：MS +20g/L蔗糖 +0.3g/L AC +4g/L卡拉胶 +0.8mg/L NAA +0.3mg/L IBA，pH值为5.9。

2.根据权利要求1所述岩黄连的两步成苗组培方法，其特征在于，所述诱导和生根培养基在被利用过并移除完嫩芽或幼苗后，立刻将其在121℃高压灭菌30-60min，在无菌条件下冷却，待温度降至100℃时将其倒出，再将其在搅拌下加入1-5mol/L的盐酸溶液，控制溶液中盐酸的浓度在0.1-0.5mol/L之间，保持温度为80-100℃反应3-5h，得到含小分子卡拉胶和小分子糖的物质；再将得到的物质与土壤或固体肥料以1:（10-20）的重量比混合施用于岩黄连的后续种植过程中。

3.根据权利要求1所述岩黄连的两步成苗组培方法，其特征在于，所述岩黄连进行生根培育后还包括在室温为26℃的室内打开瓶盖，炼苗3-5天，先移栽进行营养培育壮苗生根后再移栽大田，具体步骤如下：

炼苗结束后，洗净组培苗根部的培养基，立即将幼苗移栽到河沙和营养土的重量比为1:2的营养袋中，用水浇透，搭小拱棚进行保温保湿，在小拱棚的塑料膜上面每隔10cm戳一个直径为1mm的小孔，5天后把在小拱棚的塑料膜上面每隔20cm戳一个直径为5mm的孔，12天后将原来直径为5mm的孔扩大至1cm，18天后将小拱棚拆除，一个月后带土移栽大田；小拱棚内的温度控制在22-28℃之间。

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