CN103651121A - 一种白及分化、壮苗培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种白及分化、壮苗培养基，涉及白及种植培养技术领域，主要由以下元素在适当的pH值条件下配制而成：硝酸钾、硫酸铵440-490mg磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸锰、硫酸锌、硼酸、碘化、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、硫酸亚铁、EDTA、肌醇、硫酸硫胺素、硫酸吡哆醇、烟酸、甘氨酸、DMPT、对硝基苯酚钠、邻硝基苯酚钠、5-硝基愈创木酚钠、6-BA、NAA、PP-333、CPPU、柠檬酸、蔗糖。本发明能够提高白及种子的分化效果，有助于小苗生长、假鳞茎的快速形成能够有效提高种子的发芽率以及胚状体的生长速度。

Description

一种白及分化、壮苗培养基

技术领域：

本发明涉及白及种植培养技术领域，具体涉及一种白及分化、壮苗培养基。

背景技术：

白及为兰科白及属多年生地生兰类植物，又名：连及草、白根、冰球子、羊角七。地下块茎入药，具有收敛止血，消肿生肌。用于咯血，吐血，外伤出血，疮疡肿毒，皮肤皲裂。药理研究，白及具有对抗胃及十二指肠粘膜溃疡及穿孔、抗结核杆菌、葡萄球菌、链球菌和抗肿瘤的作用，现代研究证明，白及的块茎中含有丰富的粘液质(白及胶)、淀粉、挥发油、葡萄糖等成分。白及粘液质属于植物根茎类天然高分子多糖，可代替西黄芪胶粉与阿拉伯胶粉作为乳化剂、悬浮剂用于食品及化工领域。还可用于浆丝绸棉纱和精表装帧的浆料，白及经过科学提纯出的白及葡苷聚糖，能促进和直接参与受损组织及细胞的修复和代谢过程，应用于化妆品行业中具有较好的祛皱抗衰老作用。白及胶外用涂擦，可消除脸上痤疮般下的痕迹，让肌肤光滑无痕。用白及做成涂膜剂，用于涂于创面，治疗水火烫伤，用白及胶浆配伍黄连浸膏、水杨酸等制成软膏，可治疗手足癣。此外，白及还是卫生部指定的药食两用，可用于保健食品的物品，块茎可用于酿酒。白及又称紫兰、紫蕙，不仅株形优美，且花色艳丽，是珍稀名贵的园林绿化花卉资源。

近年来我国大部分地区的野生白及遭受过度采挖，导致其自然资源急剧减少和匮乏，市场供不应求和价格持续上涨，已经明显影响到我国医药工业、食品工业、日用化工等方面生产。但由于白及的种子极其微小且无胚乳，因此在自然状况下很难生长成苗，实生苗的栽培成为瓶颈，传统栽培主要靠地下块茎繁殖，不仅繁殖系数低，耗种量大，且生产成本高，很难满足大面积生产的需要。因此进行人工繁育已迫在眉睫。众多的种植方法在诱导白及小苗的方式是按照传统的方法进行的，这种传统的方法存在着多个不利的因素，一是需要进行的工序较多，二是成苗的时间较长，三是成苗的质量很差，不利于移栽成活。改革培养的方法和培养基是突破生产大量小苗的瓶颈的有效途径。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种可以提高白及种子的分化效果、有助于小苗生长、假鳞茎的快速形成能够有效提高种子的发芽率以及胚状体的生长速度的白及分化、壮苗培养基。

白及分化、壮苗培养基按质量份数计算由以下组分配制而成：

白及分化、壮苗培养基：

整个白及分化、壮苗导培养基的PH值为5.5—5.8。

对于白及种子萌发和成苗工作，国内有不少学者做过研究，但种子萌发后所采用的程序却各有不同，一般采用“原球茎→诱导原球茎增殖→诱导芽的分化→诱导生根”的组织培养程序，增殖主要利用诱导原球茎增殖完成，继代培养也采用原球茎；还有采用“原球茎→诱导丛生芽增殖→诱导芽的分化及生根”的组织培养程序，继代培养使用丛生芽；或直接采用“原球茎→诱导芽的分化→诱导生根”的组织培养程序和采用原球茎直接“生长分化→诱导生根”的程序等，这些方法都能获得生根苗，但在效果和投入比上差异很大，且大多仍停留在实验室阶段，真正用于生产的甚少。一般传统诱导白及小苗的方式需要进行的工序较多、二是成苗的时间较长、三是成苗的质量很差，不利于移栽成活，改革培养的方法和培养基是突破生产大量小苗的瓶颈的有效途径，我们采用的的培养程序是“原球茎分化→壮苗→假鳞茎切割→分化培养→生产苗”和“假鳞茎切割→分化培养→生产苗”的方法。实验证实：经过改造的白及原球茎诱导培养基对白及种子的萌发和小苗生长以及假鳞茎的快速形成是很适合的，种子的发芽率和胚状体的生长速度以及小苗假鳞茎形成和质量都明显的高于其他培养基，白及在整个生长发育时期，维生素B族是十分关键的物质，它们直接影响着白及胚状体、茎、叶、假鳞茎的发育质量和增殖系数，白及在琼脂固化培养基上生长的过程中，能够产生较多的酚类物质，可以导致已经形成的幼小原球茎死亡，这种现象在小苗转移分化的过程中也非常普遍，严重的影响小苗的生长，因此选择合适的抗褐化剂也是十分重要的。乙烯是制约白及组培苗在培养过程中健壮生长的一种有害物质，在培养过程中的各个时期使用适量的AgNO3作为抗衰老剂，可以有效地防止乙烯对白及组培苗生长的影响，以及防止白及假鳞茎多代转移殖体衰老的作用。

在培养过冲中将采集到成熟的白及蒴果在新洁尔灭溶液中刷洗去灰土，置超净工作台上用浓度为0.2%的升汞消毒15分钟，再用无菌水冲洗3-5次，将其用灭菌的滤纸吸干水分后，用手术刀切去果实顶部，再从果实中部纵向剖开，将种子均匀的撒播到配制好白及原球茎诱导培养基上，播种时要注意稀播，不要播得太多，留出让小苗生长的空间，播的太密，小苗生长过于纤弱，不利于后期培养。然后置入28℃，光照强度1500-2000lux，光照时间12小时的条件下进行培养。白及种子在适宜的培养条件下培养1天时，胚吸水膨大成球形，第二天胚细胞开始分裂，球形胚逐步变绿，5天后种子便开始萌发，种子萌发时形成小原球茎，原球茎细胞内出现叶绿体，继续发育15-20天时，顶端分生组织的一侧分化出1片子叶，并在原球茎下部四周呈放射状的分化出数条至数十条纤细的假根，20天后在子叶相对的一面开始形成第1片真叶。在白及原球茎诱导培养基上培养50-60天，便可以长出3-5枚小叶片，高5-7cm,并可见基部膨大呈球形假鳞茎的健壮小苗。将诱导培养60天的白及小苗及时的转移到白及分化、壮苗培养基上，在室温28℃，光照强度1500-2000lux，每天光照时间12小时条件下，培养3天后可见转移的小苗开始生长，7天后叶片和茎迅速生长，15天后，假鳞茎明显增大。30-40天假鳞茎停止增大，植株体逐步趋向成熟，50天后少部分叶片开始发黄枯萎。这个时期的组培苗可作为生产苗下地移栽或作为增殖培养的繁殖材料，将已经成熟的白及植株在无菌台上剥去茎叶，切去根须，把假鳞茎转移到新鲜的壮苗培养基上，在室温28℃，光照强度1500-2000lux，每天光照时间12小时条件下继续培养，假鳞茎在叶痕处分化出数个粗壮的不定芽，并且迅速生长，20-25天，分化的小苗可长至3-5cm高，叶片4-5片，然后在无菌台上将长出数个高3-5cm不定芽的假鳞茎进行分割，每苗带一小块假鳞茎母块，然后植入白及分化、壮苗培养基上，在室温28℃，光照强度1500-2000lux，每天光照时间12小时条件下继续培养，一个星期后，小苗迅速生长，假鳞茎也随之增大，50天后假鳞茎成熟，既可作为生产苗移栽和作为增殖繁殖材料，将再分化培养好的白及小苗带瓶放置在大棚和室温下适应7-10天，然后打开瓶盖继续炼苗3-5天。从瓶内取出小苗，用清水冲出根部多余的培养基，置塑料筐和竹匾上晾至根部发白变软，种植在人工配制的基质里或者疏松的砂质壤土里，喷洒清水定根，春秋季盖上遮阳网，防止太阳直晒，深秋时移栽要及时搭盖塑料小棚保温。移栽后的小苗很快从假鳞茎的叶痕处长出2至数个个新芽，并从新芽的基部长出新根，这时按照常规管理就行了，成活率一般高于95%以上。

白及种子在白及原球茎诱导培养基上置入合适的培养条件下培养1天时，胚吸水膨大成球形并变绿，第二天胚细胞就开始分裂，5天后种子便开始萌发，种子萌发时形成小原球茎，原球茎细胞内出现叶绿体；继续发育15-20天时，顶端分生组织的一侧分化出1片子叶，并在原球茎下部四周呈放射状的分化出数条至数十条纤细的假根，20天后在子叶相对的一面开始形成第1片真叶。培养50-60天时，便可以长成高2-3cm，3-5枚叶片，可见基部膨大呈球形假鳞茎的健壮小苗。在白及白及原球茎诱导培养基之后采用白及分化、壮苗培养基可以使种子发育后形成的白及小苗转移到MS或N6培养基上培养时，小苗在发育的过程中极易分化出丛生苗，苗体纤细瘦弱，生长缓慢，很难形成假鳞茎，当小苗转移到白及分化、壮苗培养基后，生长迅速，3天后可见转移的小苗开始生长，7天后叶片和茎迅速生长，15天后，假鳞茎明显增大。培养30天左右时，假鳞茎最大直径可以达到0.7cm,平均重0.13克，60天后可以达到下地移栽的标准。假鳞茎再次分化培养时，由叶痕出长出的不定芽非常粗壮，是种子苗不可相比的，切割再次转移培养，生长优势显得十分突出，长势旺盛，不再分化出丛生苗，在苗体基部快速的形成假鳞茎，60天后假鳞茎的平均直径为1.04cm,平均单重为0.32克。

在白及分化、壮苗培养基中使用柠檬酸能够抑制白及组培苗生长过程中酚污染。

培养基针对白及的生理特性，综合了MS和N6培养基配方的各自优点，添加了白及组培苗各发育时期所需要的有机物质和不利于生长发育有害物质的抑制剂，这些物质的参与促使了氨离子被植物体更加迅速的利用，减轻了培养基中氮浓度过高时对白及组培苗产生的毒害作用。

白及在整个生长发育时期，维生素B族是十分关键的物质，它们直接影响着白及胚状体、茎、叶、假鳞茎的发育质量和增殖系数，维生素B族中很多种类对白及组培苗的生长发育是十分重要的，硫胺素是白及组培苗发育生长过程中极为敏感的物质之一，研究中发现，野生状态下的白及根有自我合成硫胺素的作用，相应提高培养基中硫胺素的含量有利于白及组培苗的生长。

白及不论是在野生的环境下生长，还是采用组织培养的方法培育小苗进行繁殖，它的增殖系数都是很小的，生长也很缓慢。因此，培育高质量的白及组培苗投入大田生产是极为关键的。根据多年的观察，白及假鳞茎上的老根，一旦被挪动后，就会很快死亡，而且不再从这个假鳞茎上长出新根，只能从新分化芽的基部长出新根，吸收水分和养料，在这之前，新芽萌发和生长的物质全部由老的假鳞茎供给。以白及假鳞茎做为生产种苗大田生产，其实也不依靠留存的老根吸收水分和养分，假鳞茎是白及的营养储存器官，切去根须和茎叶的假鳞茎同样具有良好的新苗分化能力，很快形成一个新的健壮植株。所以，在培育白及组培苗时，刻意的去诱导生根是没有积极意义的，采用假鳞茎切割方式进行再培养，在培养基上快速的繁育出带有高质量假鳞茎的白及组培苗，是行之有效的培养方法，对实现白及工厂化育苗有着重要的意义。

不同培养基对白及种子萌发和成苗的影响

不同培养基种子苗转移培养生长状态

注明：每种培养基接种10棵，取20瓶，共200棵的平均值。

不同培养基切割苗转移培养生长状态

切割苗在白及分化、壮苗培养基上60天龄假鳞茎发育状态

分化苗在白及分化、壮苗培养基上30天龄假鳞茎发育状态

接种日期

测定日期

测定株数

最大直径

平均直径

最大单重

平均单重

12.06

01.05

200

0.7cm

0.47cm

0.21

0.13

分化苗在N6培养基上140天龄假鳞茎发育状态

综上所述本发明白及分化、壮苗培养基能够提高白及种子的分化效果、有助于小苗生长、假鳞茎的快速形成能够有效提高种子的发芽率以及胚状体的生长速度。

具体实施方式：

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体示例，进一步阐述本发明。

白及分化、壮苗培养基按质量份数计算由以下组分配制而成：

白及分化、壮苗培养基：

整个白及分化、壮苗导培养基的PH值为5.5—5.8。

对于白及种子萌发和成苗工作，国内有不少学者做过研究，但种子萌发后所采用的程序却各有不同，一般采用“原球茎→诱导原球茎增殖→诱导芽的分化→诱导生根”的组织培养程序，增殖主要利用诱导原球茎增殖完成，继代培养也采用原球茎；还有采用“原球茎→诱导丛生芽增殖→诱导芽的分化及生根”的组织培养程序，继代培养使用丛生芽；或直接采用“原球茎→诱导芽的分化→诱导生根”的组织培养程序和采用原球茎直接“生长分化→诱导生根”的程序等，这些方法都能获得生根苗，但在效果和投入比上差异很大，且大多仍停留在实验室阶段，真正用于生产的甚少。一般传统诱导白及小苗的方式需要进行的工序较多、二是成苗的时间较长、三是成苗的质量很差，不利于移栽成活，改革培养的方法和培养基是突破生产大量小苗的瓶颈的有效途径，我们采用的的培养程序是“原球茎分化→壮苗→假鳞茎切割→分化培养→生产苗”和“假鳞茎切割→分化培养→生产苗”的方法。实验证实：经过改造的白及原球茎诱导培养基对白及种子的萌发和小苗生长以及假鳞茎的快速形成是很适合的，种子的发芽率和胚状体的生长速度以及小苗假鳞茎形成和质量都明显的高于其他培养基，白及在整个生长发育时期，维生素B族是十分关键的物质，它们直接影响着白及胚状体、茎、叶、假鳞茎的发育质量和增殖系数，白及在琼脂固化培养基上生长的过程中，能够产生较多的酚类物质，可以导致已经形成的幼小原球茎死亡，这种现象在小苗转移分化的过程中也非常普遍，严重的影响小苗的生长，因此选择合适的抗褐化剂也是十分重要的。乙烯是制约白及组培苗在培养过程中健壮生长的一种有害物质，在培养过程中的各个时期使用适量的AgNO3作为抗衰老剂，可以有效地防止乙烯对白及组培苗生长的影响，以及防止白及假鳞茎多代转移殖体衰老的作用。

在培养过冲中将采集到成熟的白及蒴果在新洁尔灭溶液中刷洗去灰土，置超净工作台上用0.2%升汞消毒15min，再用无菌水冲洗3-5次，将其用灭菌的滤纸吸干水分后，用手术刀切去果实顶部，再从果实中部纵向剖开，将种子均匀的撒播到配制好白及原球茎诱导培养基上，播种时要注意稀播，不要播得太多，留出让小苗生长的空间，播的太密，小苗生长过于纤弱，不利于后期培养。然后置入28℃，光照强度1500-2000lux，光照时间12小时的条件下进行培养。白及种子在适宜的培养条件下培养1天时，胚吸水膨大成球形，第二天胚细胞开始分裂，球形胚逐步变绿，5天后种子便开始萌发，种子萌发时形成小原球茎，原球茎细胞内出现叶绿体，继续发育15-20天时，顶端分生组织的一侧分化出1片子叶，并在原球茎下部四周呈放射状的分化出数条至数十条纤细的假根，20天后在子叶相对的一面开始形成第1片真叶。在白及原球茎诱导培养基上培养50-60天，便可以长出3-5枚小叶片，高5-7cm,并可见基部膨大呈球形假鳞茎的健壮小苗。将诱导培养60天的白及小苗及时的转移到白及分化、壮苗培养基上，在室温28℃，光照强度1500-2000lux，每天光照时间12小时条件下，培养3天后可见转移的小苗开始生长，7天后叶片和茎迅速生长，15天后，假鳞茎明显增大。30-40天假鳞茎停止增大，植株体逐步趋向成熟，50天后少部分叶片开始发黄枯萎。这个时期的组培苗可作为生产苗下地移栽或作为增殖培养的繁殖材料，将已经成熟的白及植株在无菌台上剥去茎叶，切去根须，把假鳞茎转移到新鲜的壮苗培养基上，在室温28℃，光照强度1500-2000lux，每天光照时间12小时条件下继续培养，假鳞茎在叶痕处分化出数个粗壮的不定芽，并且迅速生长，20-25天，分化的小苗可长至3-5cm高，叶片4-5片，然后在无菌台上将长出数个高3-5cm不定芽的假鳞茎进行分割，每苗带一小块假鳞茎母块，然后植入白及分化、壮苗培养基上，在室温28℃，光照强度1500-2000lux，每天光照时间12小时条件下继续培养，一个星期后，小苗迅速生长，假鳞茎也随之增大，50天后假鳞茎成熟，既可作为生产苗移栽和作为增殖繁殖材料，将再分化培养好的白及小苗带瓶放置在大棚和室温下适应7-10天，然后打开瓶盖继续炼苗3-5天。从瓶内取出小苗，用清水冲出根部多余的培养基，置塑料筐和竹匾上晾至根部发白变软，种植在人工配制的基质里或者疏松的砂质壤土里，喷洒清水定根，春秋季盖上遮阳网，防止太阳直晒，深秋时移栽要及时搭盖塑料小棚保温。移栽后的小苗很快从假鳞茎的叶痕处长出2至数个个新芽，并从新芽的基部长出新根，这时按照常规管理就行了，成活率一般高于95%以上。

白及种子在白及原球茎诱导培养基上置入合适的培养条件下培养1天时，胚吸水膨大成球形并变绿，第二天胚细胞就开始分裂，5天后种子便开始萌发，种子萌发时形成小原球茎，原球茎细胞内出现叶绿体；继续发育15-20天时，顶端分生组织的一侧分化出1片子叶，并在原球茎下部四周呈放射状的分化出数条至数十条纤细的假根，20天后在子叶相对的一面开始形成第1片真叶。培养50-60天时，便可以长成高2-3cm，3-5枚叶片，可见基部膨大呈球形假鳞茎的健壮小苗。在白及白及原球茎诱导培养基之后采用白及分化、壮苗培养基可以使种子发育后形成的白及小苗转移到MS或N6培养基上培养时，小苗在发育的过程中极易分化出丛生苗，苗体纤细瘦弱，生长缓慢，很难形成假鳞茎，当小苗转移到白及分化、壮苗培养基后，生长迅速，3天后可见转移的小苗开始生长，7天后叶片和茎迅速生长，15天后，假鳞茎明显增大。培养30天左右时，假鳞茎最大直径可以达到0.7cm,平均重0.13克，60天后可以达到下地移栽的标准。假鳞茎再次分化培养时，由叶痕出长出的不定芽非常粗壮，是种子苗不可相比的，切割再次转移培养，生长优势显得十分突出，长势旺盛，不再分化出丛生苗，在苗体基部快速的形成假鳞茎，60天后假鳞茎的平均直径为1.04cm,平均单重为0.32克。

在白及分化、壮苗培养基中使用柠檬酸能够抑制白及组培苗生长过程中酚污染。

培养基针对白及的生理特性，综合了MS和N6培养基配方的各自优点，添加了白及组培苗各发育时期所需要的有机物质和不利于生长发育有害物质的抑制剂，这些物质的参与促使了氨离子被植物体更加迅速的利用，减轻了培养基中氮浓度过高时对白及组培苗产生的毒害作用。

白及在整个生长发育时期，维生素B族是十分关键的物质，它们直接影响着白及胚状体、茎、叶、假鳞茎的发育质量和增殖系数，维生素B族中很多种类对白及组培苗的生长发育是十分重要的，硫胺素是白及组培苗发育生长过程中极为敏感的物质之一，研究中发现，野生状态下的白及根有自我合成硫胺素的作用，相应提高培养基中硫胺素的含量有利于白及组培苗的生长。

白及不论是在野生的环境下生长，还是采用组织培养的方法培育小苗进行繁殖，它的增殖系数都是很小的，生长也很缓慢。因此，培育高质量的白及组培苗投入大田生产是极为关键的。根据多年的观察，白及假鳞茎上的老根，一旦被挪动后，就会很快死亡，而且不再从这个假鳞茎上长出新根，只能从新分化芽的基部长出新根，吸收水分和养料，在这之前，新芽萌发和生长的物质全部由老的假鳞茎供给。以白及假鳞茎做为生产种苗大田生产，其实也不依靠留存的老根吸收水分和养分，假鳞茎是白及的营养储存器官，切去根须和茎叶的假鳞茎同样具有良好的新苗分化能力，很快形成一个新的健壮植株。所以，在培育白及组培苗时，刻意的去诱导生根是没有积极意义的，采用假鳞茎切割方式进行再培养，在培养基上快速的繁育出带有高质量假鳞茎的白及组培苗，是行之有效的培养方法，对实现白及工厂化育苗有着重要的意义。

不同培养基对白及种子萌发和成苗的影响

不同培养基种子苗转移培养生长状态

注明：每种培养基接种10棵，取20瓶，共200棵的平均值。

不同培养基切割苗转移培养生长状态

切割苗在白及分化、壮苗培养基上60天龄假鳞茎发育状态

分化苗在白及分化、壮苗培养基上30天龄假鳞茎发育状态

接种日期

测定日期

测定株数

最大直径

平均直径

最大单重

平均单重

12.06

01.05

200

0.7cm

0.47cm

0.21

0.13

分化苗在N6培养基上140天龄假鳞茎发育状态

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (2)

1.一种白及分化、壮苗培养基，其特征在于：按照质量份数计算该培养基由以下组分配制而成：

白及分化、壮苗培养基：

2.一种利用权利要求1所述的白及分化、壮苗培养基对白及分化、壮苗的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）将诱导培养60天后的白及小苗及时的转移到白及分化、壮苗培养基上，在室温28℃、光照强度1500-2000lux、每天光照时间12小时条件下，培养3天后可见转移的小苗开始生长，7天后叶片和茎迅速生长，15天后，假鳞茎明显增大，30-40天假鳞茎停止增大，植株体逐步趋向成熟，50天后少部分叶片开始发黄枯萎；

（2）然后将已经成熟的白及植株在无菌台上剥去茎叶，切去根须，把假鳞茎转移到新鲜的白及分化、壮苗培养基上，在室温28℃、光照强度1500-2000lux、每天光照时间12小时条件下继续培养，然后假鳞茎在叶痕处分化出数个粗壮的不定芽，并且迅速生长，20-25天后分化的小苗可长至3-5cm高，叶片4-5片；

（3）然后在无菌台上将长出数个高3-5cm不定芽的假鳞茎进行分割，每苗带一小块假鳞茎母块，然后植入白及分化、壮苗培养基上，在室温28℃、光照强度1500-2000lux、每天光照时间12小时条件下继续培养，一个星期后，小苗迅速生长，假鳞茎也随之增大，50天后假鳞茎成熟，将再分化培养好的白及小苗带瓶放置在大棚和室温下适应7-10天，然后打开瓶盖继续炼苗3-5天，从瓶内取出小苗，用清水冲出根部多余的培养基，置塑料筐和竹匾上晾至根部发白变软，到此白及分化、壮苗培养基对白及的分化、壮苗培养过程结束。