CN109691389B - 一种诱导不定芽进行兰科植物种苗快速繁殖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诱导不定芽进行兰科植物种苗快速繁殖的方法，包括以下步骤：将兰科植物的外植体进行表面消毒，获得组培苗；选取健壮的组培苗，去除外围根；去除主茎，保留根及假鳞茎；将假鳞茎横切，接种于诱导培养基上，光照培养；将不定芽转接至增殖培养基上，光照培养。本发明建立了一种通过假鳞茎诱导不定芽的兰科植物种苗新型快速繁殖方法，直接成苗，前期繁殖效率和传统的繁殖相比提高了3‑8倍，结合增殖阶段，整体增殖效果可达9‑48倍。

Description

一种诱导不定芽进行兰科植物种苗快速繁殖的方法
技术领域
本发明属于植物组织培养快速繁殖技术领域，具体地说，涉及一种诱导不定芽进行兰科植物种苗快速繁殖的方法。
背景技术
兰科植物是被子植物的第二大科，集药用、观赏价值于一体，具有极高的经济、生态和科研价值。兰科植物果实一般为蒴果，种子数量极多但细小，无胚乳，在自然环境下种子萌发率极低，即使萌发后若缺少必要的共生真菌等先天条件也很难萌发成苗。再加上人类活动、气候变暖等因素，大多数野生兰科植物生存状态不容乐观，对兰科植物加大保护力度具有十分迫切的现实意义。
分株方式作为兰科植物常用的无性繁殖技术，繁殖系数低，生长需2-4年，生长周期较长，消耗量大，不能满足需求。组织培养技术效率高，能提供大量的种苗，这种方式已在兰科植物中进行广泛应用，为兰科植物开辟了新的繁殖技术。但兰科植物普遍存在生长较为缓慢的现象，一般从建立外植体到生根阶段耗时需1-2年。因此，提高繁殖效率对兰科植物的组织培养极为重要，增殖阶段在提高组培苗的繁殖效率方面起着关键的作用。现有关于增殖阶段的研究多集中于激素组合对兰科植物繁殖效果的影响，如张爱丽等(2018)比较了2,4-D、6BA、NAA、KT对不同增殖代数白及苗进行扩繁，结果表明，1、2代增殖苗适合以愈伤组织-丛生芽增殖，在MS+香蕉泥50g/L+2，4-D 0.1mg/L+KT0.5mg/L培养基上进行培养，增殖系数可达8.32和7.68，3代增殖苗以分蘖繁殖为主、愈伤组织-丛生芽增殖为辅，在MS+香蕉泥50g/L+6BA 0.1mg/L+NAA 1.5mg/L培养基上培养，增殖系数为4.73，4代以后增殖苗以分蘖增殖为主、假鳞茎繁殖为辅，在MS+香蕉泥50g/L+6BA 0.1mg/L+NAA 1.5mg/L培养基上培养，增殖系数为3.5；韦萤等(2018)比较了TDZ、6BA、IAA对白及增殖效果的影响，结果表明培养基MS+TDZ 2.0mg/L+6BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L效果最佳，增殖系数为6.17；李蕾(2018)以独蒜兰为研究材料，报道1/2MS+6BA 0.5mg/L+NAA 1.5mg/L为最佳的增殖培养基。可以看出，目前的研究主要集中于探索激素组合对诱导分生新植株的影响，但并未根据兰科植物的植株特点对组培苗本身加以利用，如能在这方面进行研究，再结合激素组合诱导新植株进行分生，将大大提高增殖阶段整体的繁殖效率。
发明内容
有鉴于此，本发明针对兰科植物增殖阶段未利用母株本身的情况，以提高整体繁殖效率为目的，将简单、有效的薄层组织诱导不定芽作为技术核心，提供了一种快速繁殖兰科植物种苗的方法。
为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
一种诱导不定芽进行兰科植物种苗快速繁殖的方法，包括以下步骤：
1)以兰科植物的假鳞茎、花梗等器官为外植体，通过表面消毒后，移至初代培养基上进行培养，光照培养。
2)选取兰科植物组培苗，在超净工作台条件下去除外围根；
3)去除主茎，保留主根及假鳞茎；
4)将假鳞茎横切，接种于诱导培养基上，光照培养；
5)将不定芽转接于增殖培养基上，光照培养。
进一步，所述的步骤1具体为：以兰科植物的假鳞茎、花梗等器官为外植体，洗衣粉水浸泡20min，自来水冲洗半小时，在超净工作台里，95％酒精浸泡外植体30s，无菌水清洗1次，0.1％升汞+1-2滴吐温灭菌8-15min，无菌水冲洗5次，初代培养基为MS+BA 1.0-3.0mg/L+NAA 0.1-1.0mg/L，放置于25±2℃的光照培养室中培养4-8周。
进一步，所述的步骤2具体为：选取6-10周苗龄的健壮兰科组培苗，保留1.0-2.0cm的主根，去除其余外围根。
进一步，所述的步骤3具体为：保留主根及以上1.0-1.5cm的膨大假鳞茎，去除其余茎和叶。
进一步，所述的步骤4具体为：将假鳞茎进行横切，每个薄层的厚度为2.0-3.0mm，接种于MS+TDZ 0.5-5.0mg/L+NAA 0.1-2.0mg/L的诱导培养基上，放置于25±2℃的光照培养室中培养10-15天。
进一步，所述的步骤5具体为：将诱导出的不定芽转接于MS+6-BA 1.0-3.0mg/L+NAA 0.2-1.0mg/L的增殖培养基上，放置于25±2℃的光照培养室中培养5-8周。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明方法建立一种新型的兰科植物种苗的快速繁殖方法，直接成苗，不通过愈伤组织阶段，没有变异的风险。
2)增殖效率高，以1棵兰科植物白及种苗为例，有1个假鳞茎，假鳞茎可切3-4个薄层，每个薄层可诱导1-2个不定芽，即共有不定芽3-8棵，增殖系数为3-6，因此，第一代繁殖的种苗数量为：9-48棵，第二代及以后代数增殖的种苗数量成几何级增加。
附图说明
图1是实施例1以薄层组织诱导不定芽技术为核心的兰科植物种苗快速繁殖过程。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明公开了通过薄层组织诱导不定芽进行兰科植物种苗快速繁殖的方法，包括以下步骤：
步骤1、以兰科植物的假鳞茎、花梗等器官为外植体，通过表面消毒后，移至初代培养基上进行培养，光照培养。
步骤2、选取6-10周苗龄健壮的兰科植物组培苗，在超净工作台条件下保留1.0-2.0cm的主根，去除其余外围根；
步骤3、保留主根及以上1.0-1.5cm的假鳞茎，去除其余茎和叶；
步骤4、将假鳞茎进行横切，每个薄层的厚度为2.0-3.0mm，接种于MS+TDZ 0.5-5.0mg/L+NAA 0.1-2.0mg/L的诱导培养基上，放置于25±2℃的光照培养室中培养10-15天。
步骤5、将诱导出的不定芽转接于MS+6-BA 1.0-3.0mg/L+NAA 0.2-1.0mg/L的增殖培养基上，放置于25±2℃的光照培养室中培养5-8周。
本方法关键点在于薄层材料的准备、激素种类和浓度配比。薄层材料的准备：保留主根及以上1.0-1.5cm的假鳞茎，将假鳞茎进行横切，每个薄层的厚度为2.0-3.0mm。不定芽的诱导激素为TDZ和NAA，浓度范围是TDZ 0.5-5.0mg/L，NAA 0.1-2.0mg/L；不定芽的增殖激素为6BA和NAA，浓度范围是6BA 1.0-3.0mg/L，NAA 0.2-1.0mg/L。在实验中，数据显示激素的种类和浓度对不定芽的诱导和增殖具有显著的影响(表1、表2)。
表1不同激素种类及浓度配比对白及薄层组织诱导不定芽的影响
Figure BDA0001941621830000051
表2不同激素配比对白及不定芽增殖的影响
Figure BDA0001941621830000061
实施例1
选取健壮白及(Bletilla striata)品种，外植体消毒后，获得组培苗，取6周苗龄的组培苗，在超净工作台条件下保留1.0-2.0cm的主根，去除其余外围根；保留主根及以上1.0-1.5cm的假鳞茎，去除其余茎和叶；将假鳞茎进行横切，每个薄层的厚度为2.0-3.0mm，接种于MS+TDZ 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L的诱导培养基上，放置于25±2℃的光照培养室中培养15天；将所得到的不定芽转接于MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 1.0mg/L的培养基上，放置于25±2℃的光照培养室中培养5周，不定芽的增殖率为3.5。
具体如图1所示，a为准备实验的一棵白及种苗，有膨大假鳞茎；b为假鳞茎的放大图；c将假鳞茎进行切割，每个薄层为2.0-3.0mm；d为薄层组织在适合的诱导培养基进行生长3天的情况，不定芽开始萌发；e为薄层组织在适合的诱导培养基生长7天的情况，不定芽明显伸长；f为薄层组织在适合的诱导培养基生长14天的情况，非常健壮，适合切下进行增殖培养；g为不定芽增殖的情况，增殖系数为3，且生根良好。
实施例2
选取健壮黄花白及(Bletilla ochracea)品种，外植体消毒后，获得组培苗，取6周苗龄的组培苗，在超净工作台条件下保留1.0-2.0cm的主根，去除其余外围根；保留主根及以上1.0-1.5cm的假鳞茎，去除其余茎和叶；将假鳞茎进行横切，每个薄层的厚度为2.0-3.0mm，接种于MS+TDZ 3.0mg/L+NAA 2.0mg/L的诱导培养基上，放置于25±2℃的光照培养室中培养15天；将所得到的不定芽转接于MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.5mg/L的培养基上，放置于25±2℃的光照培养室中培养5周，不定芽的增殖率为4。
实施例3
选取健壮独蒜兰(Pleione bulbocodioides)，外植体消毒后，获得组培苗，取10周苗龄的组培苗，在超净工作台条件下保留1.0-2.0cm的主根，去除其余外围根；保留主根及以上1.0-1.5cm的假鳞茎，去除其余茎和叶；将假鳞茎进行横切，每个薄层的厚度为2.0-3.0mm，接种于MS+TDZ 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L的诱导培养基上，放置于25±2℃的光照培养室中培养15天；将所得到的不定芽转接于MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L的培养基上，放置于25±2℃的光照培养室中培养8周，不定芽的增殖率为5。
实施例4
选取健壮杜鹃兰(Cremastra appendiculata，俗称冰球子)，外植体消毒后，获得组培苗，取8周苗龄的组培苗，在超净工作台条件下保留1.0-2.0cm的主根，去除其余外围根；保留主根及以上1.0-1.5cm的假鳞茎，去除其余茎和叶；将假鳞茎进行横切，每个薄层的厚度为2.0-3.0mm，接种于MS+TDZ 5.0mg/L+NAA 2.0mg/L的诱导培养基上，放置于25±2℃的光照培养室中培养15天；将所得到的不定芽转接于MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L的培养基上，放置于25±2℃的光照培养室中培养8周，不定芽的增殖率为3。
述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (2)

1.一种诱导不定芽进行兰科植物种苗快速繁殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）以兰科植物的假鳞茎或花梗为外植体，通过表面消毒，洗衣粉水浸泡20min，自来水冲洗半小时，在超净工作台里，95%酒精浸泡外植体30s，无菌水清洗1次，0.1%升汞+1-2滴吐温灭菌8-15min，无菌水冲洗5次将外植体转到初代培养基上进行光照培养，初代培养基为MS+BA 1.0-3.0 mg/L+ NAA 0.1-1.0 mg/L；
2）选取兰科植物6-10周苗龄的组培苗，在超净工作台条件下去除外围根；
3）去除主茎，保留主根及以上1.0-1.5 cm假鳞茎；
4）将假鳞茎横切，每个薄层厚度为2-3mm，接种于诱导培养基上，光照培养，所述的诱导培养基为：MS+TDZ 1.0-5.0 mg/L+ NAA 1.0-2.0 mg/L；
5）将不定芽转接于增殖培养基上，光照培养，所述的增殖培养基为：MS + 6-BA 1.0-3.0mg/L + NAA 0.2-1.0 mg/L；
所述兰科植物为白及或黄花白及或独蒜兰或杜鹃兰。
2.根据权利要求1所述的一种诱导不定芽进行兰科植物种苗快速繁殖的方法，其特征在于，步骤1）、步骤 4）和步骤5）中光照培养条件为25±2℃。
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