CN110367124B - 一种构建花生子叶再生体系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体公开一种构建花生子叶再生体系的方法，包括以下几个步骤：(1)预处理；(2)灭菌；(3)愈伤组织培养；(4)丛生芽诱导；(5)增殖培养；(6)壮苗培养；(7)生根培养；(8)移栽。本发明提供的构建稳定花生子叶再生体系的方法，为花生遗传转化及分子育种提供了新技术和方法。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体公开一种构建花生子叶再生体系的方法。
背景技术
花生是一年生草本豆科作物，优质食用油主要原料品种之一，民间又称“长生果”。花生作为我国重要的农作物，不仅自身营养价值丰富，而且具有很高的经济价值。
植物组织培养技术是花生品种改良、新品种繁殖、遗传转化、种质保存和抗性突变体的筛选等方面研究的基础。近些年来，已有较多通过对花生未成熟胚、子叶、茎尖、胚轴、叶片、花粉等作为外植体进行花生离体培养而获得再生植株的报道。但是，花生再生体系的建立尚不成熟，再生体系建立难度大，仍然存在不同基因型间再生差异大、畸形苗较多、再生频率低、生长慢、生根难等许多尚未解决的问题。同时，根据已公布的国内外研究结果(表1)，将其配方应用到我国所用的几种花生品种中，进行重复实验发现结果并不理想。其中，以“四粒红”花生的子叶作为外植体，按照王允&殷冬梅、Livingstone&Birch、何红卫&宾金华等培养基没有诱导出丛生芽。同时，郝浩永等(2007)报道丛生芽在1/2 MS+NAA1.0mg.L-1+0.7％琼脂培养基上生根率最高达95％以上，但按照该配方，“四粒红”花生再生苗的生根率为20-40％左右，且生根质量差，须根数少。
表1花生组织培养的研究成果
发明内容
针对上述存在问题，本发明提供一种构建稳定花生子叶再生体系的方法，为花生遗传转化及育种提供了新技术和方法。
本发明提供的构建花生子叶再生体系的方法，具体包括以下几个步骤：
(1)预处理：选取成熟“四粒红”花生种子用无菌水浸泡；
(2)灭菌：将预处理后的种子用乙醇溶液浸泡，再用HgCl2溶液消毒，然后用无菌水冲洗；
(3)愈伤组织培养：将灭菌后的种子剥离胚芽，子叶接种到愈伤组织诱导培养基上，白光照射，并补红光光照，再加盖两层报纸，使500lux<光照强度< 1000lux，在25℃条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养20天；
(4)丛生芽诱导：将步骤(3)中培养得到的材料转接种于丛生芽诱导培养基上，白光照射，并补红光光照，再加盖两层报纸，使500lux<光照强度<1000lux，在25℃条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养30天；
(5)增殖培养：将步骤(4)培养材料转接到增殖培养基中培养，在25℃、光照度2000lux-4000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养20-40天；
(6)壮苗培养：将步骤(5)培养材料转接到壮苗培养基中培养，在25℃、光照度2000lux-4000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养20-40天；
(7)生根培养：将步骤(6)中培养茎高为1.5-3cm的再生苗转接至生根培养基上诱导生根，在25℃、光照度2000lux-4000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养20-40天；
(8)移栽：待花生再生苗诱导的根长长到1.2-2.0cm时，用医用尖嘴镊子小心地将三角瓶内的琼脂分成小块，并不损伤根系；然后，用蒸馏水冲洗再生苗根系，移栽至营养钵中，覆盖塑料薄膜，在25℃、光照度4000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养7天，并保持基质湿润，由于前期培养均在高湿环境中进行，故前7天保持基质湿润可使移栽苗逐渐适应环境，提高成活率；14d后，去除覆盖材料，在25℃、光照度6000lux下自然生长。
优选地，步骤(1)中所述无菌水浸泡时间为2-4h。
优选地，步骤(2)中所述灭菌过程为：用质量分数为75％乙醇溶液浸泡30s，再用质量分数为0.1％HgCl2溶液消毒8-10min，然后用无菌水冲洗4-5次，每次 4-5min。
优选地，步骤(3)中所述愈伤组织诱导培养基的组分为：MS+2mg/L TDZ +0.8mg/L6-BA+1mg/L NAA。
优选地，步骤(4)中所述丛生芽诱导培养基的组分为：MS+TDZ 4mg/L+NAA 1mg/L+GA3 0.5mg/L。
优选地，步骤(3)和步骤(4)中加盖报纸前所述白光与所述红光光照强度均为1500lux-2000lux。
优选地，步骤(5)中所述增殖培养基的组分为：MS+4mg/L 6-BA+3mg/l GA3。
优选地，步骤(6)中所述壮苗培养基的组分为：MS+1.0mg/L NAA+4.0mg/L 6-BA+0.5mg/L GA3。
优选地，步骤(7)中所述生根培养基的组分为1/2MS+4.0mg/L NAA+ 0.4mg/L GA3。
对比现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本申请提供的构建花生子叶再生体系的方法，使用诱导培养基MS+TDZ 4mg/L+NAA 1mg/L+GA3 0.5mg/L，并结合白色日光灯、补红光光照，再加盖两层报纸的培养条件，将“四粒红”花生子叶丛生芽诱导率由原来的30％左右提高到 85％以上；其中，采用加盖两层报纸的少光培养方式，与无光或完全光照相比，可以显著促进花生子叶胚性愈伤组织的形成；
(2)刚诱导出的丛生芽，有的茎和叶片显示畸形，且增殖系数低，一般每个外植体出芽数为1-4个，将其转接到增殖培养基MS+4mg/L 6-BA+3mg/l GA3，增殖系数明显增多，培养20-40天，每个子叶出芽数均大于10；且叶片、茎生长正常。
(3)生根培养基的组分为1/2MS+4.0mg/L NAA+0.4mg/L GA3，培养20-40 天，生根率为66.67％，随着继代培养时间的延长，生根率可以达到100％，且生出的根系较粗，有利于移栽成活。
附图说明
图1是实施例3中花生子叶剥离图；
图2是实施例3中子叶不定芽诱导图；其中，A是愈伤组织，B是诱导出不定芽；
图3是实施例3中子叶增殖和壮苗图；其中，A是增殖苗，B是壮苗；
图4是实施例3中花生再生苗生根诱导图；其中，A是在培养基里生长的花生苗，B是移栽时洗出后的苗；
图5是实施例3中再生苗驯化移栽图；其中A是刚移栽时的花生苗，B是移栽35天后开花前的花生苗，C是移栽后40天开花的花生苗。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
一种构建花生子叶再生体系的方法，具体包括以下几个步骤：
(1)预处理：选取成熟的“四粒红”花生种子用无菌水浸泡2h；
(2)灭菌：将预处理后的种子用质量分数为75％的乙醇溶液浸泡30s，然后用质量分数为0.1％的HgCl2溶液消毒8min，用无菌水冲洗4次，每次4min；
(3)愈伤组织培养：将灭菌后的种子剥离胚芽，子叶从中间切开接种到愈伤组织诱导培养基上，白色日光灯照射，并补红光光照，再加盖两层报纸，使花生子叶接受到的光照度为500lux；在25℃条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养20天；
其中，加盖报纸前白光与红光光照强度均为1500lux；
愈伤组织诱导培养基的组分为：MS+2mg/L TDZ+0.8mg/L 6-BA+1mg/L NAA；
(4)丛生芽诱导：将步骤(3)中培养得到的材料转接种于丛生芽诱导培养基上，白色日光灯照射，并补红光光照，再加盖两层报纸，使培养基接受到的光照度为500lux；在25℃条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养20天；
丛生芽诱导培养基的组分为：MS+TDZ 4mg/L+NAA 1mg/L+GA3 0.5mg/L；
(5)增殖培养：将步骤(4)培养材料转接到增殖培养基中培养，增殖培养基的组分为：MS+4mg/L 6-BA+3mg/l GA3，在25℃、光照度2000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养40天；
(6)壮苗培养：将步骤(5)培养材料转接到壮苗培养基中培养，壮苗培养基的组分为：MS+1.0mg/L NAA+4.0mg/L 6-BA+0.5mg/L GA3，在25℃、光照度2000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养40天；
(7)生根培养：将步骤(6)中培养茎高为1.5cm的再生苗转接至生根培养基上诱导生根，生根培养基的组分为1/2MS+4.0mg/L NAA+0.4mg/L GA3，在 25℃、光照度2000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养40天；
(8)移栽：待花生再生苗诱导的根长长到1.2cm时，用医用尖嘴镊子小心地将三角瓶内的琼脂分成小块，并且不损伤根系；然后，用蒸馏水冲洗再生苗根系，移栽至营养钵内，覆盖塑料薄膜，将营养钵防置在培养皿中培养，在25℃、光照度4000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养7天，并保持基质湿润； 14d后，去除覆盖材料，在25℃、光照度6000lux自然生长即可。
实施例2
一种构建花生子叶再生体系的方法，具体包括以下几个步骤：
(1)预处理：选取成熟的“四粒红”花生种子用无菌水浸泡4h；
(2)灭菌：将预处理后的种子用质量分数为75％的乙醇溶液浸泡30s，然后用质量分数为0.1％的HgCl2溶液消毒10min，用无菌水冲洗5次，每次5min；
(3)愈伤组织培养：将灭菌后的种子剥离胚芽，子叶从中间切开接种到愈伤组织诱导培养基上，愈伤组织诱导培养基的组分为：MS+2mg/L TDZ+0.8mg/L 6-BA+1mg/L NAA，白色日光灯照射，并补红光光照，再加盖两层报纸，使花生子叶接受到的光照度为1000lux；在25℃条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养20天；
其中，加盖报纸前白光与红光光照强度均为2000lux；
(4)丛生芽诱导：将步骤(3)中培养得到的材料转接种于丛生芽诱导培养基上，丛生芽诱导培养基的组分为：MS+TDZ 4mg/L+NAA 1mg/L+GA3 0.5mg/L，白色日光灯照射，并补红光光照，再加盖两层报纸，使花生子叶接受到的光照度为1000lux；在25℃条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养20天；
(5)增殖培养：将步骤(4)培养材料转接到增殖培养基中培养，增殖培养基的组分为：MS+4mg/L 6-BA+3mg/l GA3，在25℃、光照度4000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养20天；
(6)壮苗培养：将步骤(5)培养材料转接到壮苗培养基中培养，壮苗培养基的组分为：MS+1.0mg/L NAA+4.0mg/L 6-BA+0.5mg/L GA3，在25℃、光照度4000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养20天；
(7)生根培养：将步骤(6)中培养茎高为3cm的再生苗转接至生根培养基上诱导生根，生根培养基的组分为1/2MS+4.0mg/L NAA+0.4mg/L GA3，在25℃、光照度4000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养40天；
(8)移栽：待花生再生苗诱导的根长长到2.0cm时，用医用尖嘴镊子小心地将三角瓶内的琼脂分成小块，并且不损伤根系；然后，用蒸馏水冲洗再生苗根系，移栽至营养钵内，覆盖塑料薄膜，将营养钵防置在培养皿中培养，在25℃、光照度4000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养7天，并保持基质湿润； 14d后，去除覆盖材料，在25℃、光照度6000lux自然生长。
实施例3
一种构建花生子叶再生体系的方法，具体包括以下几个步骤：
(1)预处理：选取成熟的“四粒红”花生种子用无菌水浸泡3h；
(2)灭菌：将预处理后的种子用质量分数为75％的乙醇溶液浸泡30s，然后用质量分数为0.1％的HgCl2溶液消毒9min，用无菌水冲洗5次，每次4min；
(3)愈伤组织培养：将灭菌后的种子剥离胚芽，如图1所示，子叶从中间切开接种到愈伤组织诱导培养基上，愈伤组织诱导培养基的组分为：MS+2mg/L TDZ+0.8mg/L 6-BA+1mg/L NAA，白色日光灯照射，并补红光光照，再加盖两层报纸，使花生子叶接受到的光照度为800lux；在25℃条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养20天，花生子叶状态如图2-A所示；
其中，加盖报纸前白光与红光光照强度均为1800lux；
(4)丛生芽诱导：将步骤(3)中培养得到的材料转接种于丛生芽诱导培养基上，丛生芽诱导培养基的组分为：MS+TDZ 4mg/L+NAA1mg/L+GA3 0.5mg/L，白色日光灯照射，并补红光光照，再加盖两层报纸，使花生子叶接受到的光照度为800lux；在25℃下，每天光照16h、暗培养8h，培养20天，丛生芽诱导状态如图2-B所示；
(5)增殖培养：将步骤(4)培养材料转接到增殖培养基中培养，增殖培养基的组分为：MS+4mg/L 6-BA+3mg/l GA3，在25℃、光照度3000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养30天，如图3-A所示；
(6)壮苗培养：将步骤(5)培养材料转接到壮苗培养基中培养，壮苗培养基的组分为：MS+1.0mg/L NAA+4.0mg/L 6-BA+0.5mg/L GA3，在25℃、光照度3000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养30天，如图3-B所示；
(7)生根培养：将步骤(6)中培养茎高为2.5cm的再生苗转接至生根培养基上诱导生根，生根培养基的组分为1/2MS+4.0mg/L NAA+0.4mg/L GA3，在 25℃、光照度3000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养30天，如图4-A 所示；
(8)移栽：待花生再生苗诱导的根长长到1.5cm时，用医用尖嘴镊子小心地将三角瓶内的琼脂分成小块，并且不损伤根系；然后，用蒸馏水冲洗再生苗根系，如图4-B所示，移栽至营养钵内，覆盖塑料薄膜，将营养钵防置在培养皿中培养，在25℃、光照度4000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养7天，并保持基质湿润；14d后，去除覆盖材料，在25℃、光照度6000lux自然生长，如图5所示。
白色日光灯照射，再加盖两层报纸，使花生子叶接受到的光照度为800lux；在25℃下，每天光照16h、暗培养8h，培养40天，统计愈伤组织诱导率和丛生芽诱导率，结果见表2-4。
表2不同浓度的TDZ和NAA0.5mg/L的培养基对花生子叶再生体系建立的影响
由表2可知，当TDZ浓度为4mg/L、NAA浓度为0.5mg/L时，愈伤组织诱导率及丛生芽诱导率均较高，分别达到88％和32％。
表3不同浓度的TDZ和NAA1.0mg/L的培养基对花生子叶再生体系建立的影响
由表3可知，当TDZ浓度为4mg/L、NAA浓度为1.0mg/L时，愈伤组织诱导率及丛生芽诱导率均较高，分别为90％及30％。
表4不同浓度的TDZ和NAA2.0mg/L的培养基对花生子叶再生体系建立的影响
由表4可知，当TDZ浓度为4mg/L、NAA浓度为2.0mg/L时，愈伤组织诱导率及丛生芽诱导率均较高，分别为90％及24％。
综上可知，当白光照射并加盖两层报纸、TDZ浓度为4mg/L、NAA浓度为 1.0mg/L时，愈伤组织诱导率及丛生芽诱导率均最高，分别为90％及30 ％。
白色日光灯照射，并补红光光照，再加盖两层报纸，使花生子叶接受到的光照度为800lux；在25℃下，每天光照16h、暗培养8h，培养20天，统计愈伤组织诱导率，结果见表5。
表5不同激素对四粒红花生子叶愈伤组织形成的影响
由表5可知，当TDZ浓度为4mg/L、NAA浓度为0 -1.0mg/L、6-BA浓度为0-0.8mg/L时，愈伤组织诱导率可达到100％。
白色日光灯照射，并补红光光照，再加盖两层报纸，使花生子叶愈伤组织接受到的光照度为800lux；在25℃下，每天光照16h、暗培养8h，培养20天，统计丛生芽诱导率，结果见表6。
表6不同激素对四粒红花生子叶丛生芽诱导的影响
由表5可知，当TDZ浓度为4mg/L、NAA浓度为1.0mg/L、GA3浓度为0.5mg/L 时，丛生芽诱导率达到85％。
对比表2-4及表5-6可知，在白光光照、补红光光照，再加盖两层报纸时，使用上述培养基花生愈伤组织诱导率及丛生芽诱导率均较高，分别可达到100％及85％。
将步骤增殖培养材料转接到壮苗培养基中培养，壮苗培养基，在25℃、光照度3000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养30天，测量苗高(生长高度)，结果见表7。
表7不同浓度GA3、6-BA和NAA对花生再生苗的壮苗影响
由表7可知，当6-BA浓度为4mg/L、NAA浓度为1.0mg/L、GA3浓度为0.5mg/L 时，花生再生苗中达到1.5cm高度的苗株有16株，且花生苗呈深绿色，伸展性佳。
将壮苗培养的再生苗高为1-3cm的再生苗转接至生根培养基上诱导生根，在 25℃、光照度3000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养30天，统计生根率，结果见表8。
表8不同浓度的6-BA、GA3和NAA对花生再生苗的生根影响
由表8可知，当NAA浓度为4.0mg/L、GA3浓度为0.4mg/L时，花生再生苗的生根率为66.67％。
本发明选出基因型“四粒红”花生子叶作为外植体得到花生不定芽，优化了不定芽诱导培养基配方，使构建的花生再生体系高效稳定，综合性能优越，不定芽诱导率高，重复性好。
需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例1～3相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (7)
1.一种构建花生子叶再生体系的方法，其特征在于，包括以下几个步骤：
(1)预处理：选取成熟“四粒红”花生种子用无菌水浸泡；
(2)灭菌：将预处理后的种子用乙醇溶液浸泡，再用HgCl2溶液消毒，然后用无菌水冲洗；
(3)愈伤组织培养：将灭菌后的种子剥离胚芽，子叶接种到愈伤组织诱导培养基上，白光照射，并补红光光照，再加盖两层报纸，使500lux<光照强度<1000lux，在25℃条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养20天；
所述愈伤组织诱导培养基的组分为：MS+2mg/L TDZ+0.8mg/L 6-BA+1mg/L NAA；
(4)丛生芽诱导：将步骤(3)中培养得到的材料转接种于丛生芽诱导培养基上，白光照射，并补红光光照，再加盖两层报纸，使500lux<光照强度<1000lux，在25℃条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养30天；
所述丛生芽诱导培养基的组分为：MS+TDZ 4mg/L+NAA 1mg/L+GA30.5mg/L；
(5)增殖培养：将步骤(4)培养材料转接到增殖培养基中培养，在25℃、光照度2000lux-4000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养20-40天；
(6)壮苗培养：将步骤(5)培养材料转接到壮苗培养基中培养，在25℃、光照度2000lux-4000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养20-40天；
(7)生根培养：将步骤(6)中培养茎高为1.5-3cm的再生苗转接至生根培养基上诱导生根，在25℃、光照度2000lux-4000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养20-40天；
(8)移栽：待花生再生苗诱导的根长长到1.2-2.0cm时，冲洗再生苗根系，移栽，在25℃、光照度4000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养14天后，在25℃、光照度6000lux条件下自然生长。
2.根据权利要求1所述的构建花生子叶再生体系的方法，其特征在于，步骤(1)中所述无菌水浸泡时间为2-4h。
3.根据权利要求1所述的构建花生子叶再生体系的方法，其特征在于，步骤(2)中所述灭菌过程为：用质量分数为75％乙醇溶液浸泡30s，再用质量分数为0.1％HgCl2溶液消毒8-10min，然后用无菌水冲洗4-5次，每次4-5min。
4.根据权利要求1所述的构建花生子叶再生体系的方法，其特征在于，步骤(3)和步骤(4)中加盖报纸前所述白光与所述红光光照强度均为1500lux-2000lux。
5.根据权利要求1所述的构建花生子叶再生体系的方法，其特征在于，步骤(5)中所述增殖培养基的组分为：MS+4mg/L 6-BA+3mg/l GA3。
6.根据权利要求1所述的构建花生子叶再生体系的方法，其特征在于，步骤(6)中所述壮苗培养基的组分为：MS+1.0mg/L NAA+4.0mg/L 6-BA+0.5mg/L GA3。
7.根据权利要求1所述的构建花生子叶再生体系的方法，其特征在于，步骤(7)中所述生根培养基的组分为1/2MS+4.0mg/L NAA+0.4mg/L GA3。
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