CN104982337B - 一种提高野外乌桕优良株系茎段再生效率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高野外乌桕优良株系茎段再生效率的方法，取野外乌桕优良株系的当年生茎段为外植体，通过消毒、诱导、增殖、伸长、生根和移栽等六个步骤获得健壮的乌桕再生植株。本发明相比现有技术具有以下优点：能保持母本植株的种质特性，取材方便、材料丰富，可以实现对野外乌桕优良单株的快繁，实现品种培育；消毒程序简单，消毒时间短，对外植体的毒害较小，且污染率低，丛生芽再生效率高，再生速度快，繁殖系数高，适用于乌桕所有的基因型，应用前景广阔。

Description

一种提高野外乌桕优良株系茎段再生效率的方法
技术领域
本发明涉及植物生物技术领域，尤其涉及的是一种提高野外乌桕优良株系茎段再生效率的方法。
背景技术
乌桕(Sapiumsebiferium)又名蜡子树、桕树，是大戟科乌桕属多年生落叶乔木，是一种适应性强，分布广，集油料生产、药用及绿化等多用途于一身的多功能树种。乌桕籽实含油率高达55％，是生产生物柴油的理想原料，为中国特有的油用经济树种；乌桕树冠圆形，树姿优美，叶形秀丽，入秋叶色或红艳，或橙黄，且伴有较强的耐寒、旱、涝及耐盐碱能力，是优良的园林绿化树种，在中国有1400年的栽培史。因此乌桕无论是作为油用经济作物，还是作为园林绿化树种，均具有重要的经济和生态价值。随着生物质能源林业和园林景观树种产业化的加快发展，乌桕的栽培前景十分广阔，市场需求量大，但缺乏高效的优质种苗繁育技术，成为制约其产业化开发的瓶颈。
乌桕为异花授粉植物，种子高度杂合，通过种子育苗存在较大的遗传变异性，很难保持母本株系的优良性状；扦插、嫁接等无性繁殖技术虽在乌桕育苗方面有报道，但普遍存在育苗过程繁琐，繁殖系数较低等问题，很难满足优良品种大规模推广的需求。采用组培快繁技术，可在短期内获得大量的、遗传背景一致的优良种苗，以满足规模化造林对乌桕优质种苗的需求。另外，在此基础上对乌桕优良品种进行相应的遗传改良研究也迫在眉睫。目前，有关乌桕组织培养方面的研究主要集中在利用种子实生苗的胚乳、叶片、下胚轴或根为外植体进行芽或愈伤组织的诱导，或以乌桕幼胚为外植体通过体细胞胚胎发生途径诱导乌桕植株的再生，然而，由于乌桕高度杂合的遗传背景特征，上述技术不适于对乌桕优良母株(种质)的保存和繁殖。近年来也有关于利用野外乌桕带腋芽的茎段为外植体，对乌桕进行快繁的研究报道，但普遍存在污染率高，褐化严重，繁殖系数低，可重复性差等问题，很难满足对乌桕优良株系进行规模化快速繁殖和品种改良的需要。因此，针对当前野外乌桕优良株系育苗所存在的诸多问题，急需开发一种提高野外乌桕优良株系茎段再生效率的方法，以满足对乌桕优良株系的快速繁殖和品种改良的需求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种提高野外乌桕优良株系茎段再生效率的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种提高野外乌桕优良株系茎段再生效率的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一、取野外乌桕优良株系的当年生茎段为外植体，经初步消毒后，在无菌操作台内进行表面消毒；
步骤二、将步骤一处理过后的外植体分切成若干切段后接种于丛生芽诱导培养基中，经过2～3周光照培养，茎段两端切口处诱导出不定芽丛；
步骤三、将带有不定芽丛的茎段转接于增殖培养基中进行芽的增殖；
步骤四、培养2～3周后转至丛生芽伸长培养基上进行芽的伸长培养；
步骤五、待芽长至2～3cm，转至生根培养基中进行生根；
步骤六、待幼苗长至3～4cm并带有2～4片真叶时，进行炼苗并移栽，获得健壮的乌桕再生植株。
作为对上述方案的进一步改进，步骤一中的当年生茎段为未木质化或半木质化的茎段，乌桕包括鸡爪桕和葡萄桕。
作为对上述方案的进一步改进，初步消毒是将茎段去叶后分装于1000ml烧杯中，于流水下冲洗10～15min，期间添加2～4ml洗涤液冲洗，并不断摇晃。
作为对上述方案的进一步改进，表面消毒是指将初步消毒后的茎段经75％的酒精擦拭后，剪切成4～6cm长度的小段；再用75％酒精进行浸泡15～25s，无菌水冲洗3～5遍；再用75％酒精进行浸泡15～25s，无菌水冲洗3～5遍；之后再经质量百分比浓度为0.1％的HgCl2消毒2～5min，最后用无菌水冲洗6～8遍，表面消毒期间需不停地摇晃。
作为对上述方案的进一步改进，步骤二中的切段是将步骤一处理完成的外植体切去两端消毒损伤部位后，再分切成长度为0.4～0.7cm大小获得的。
作为对上述方案的进一步改进，步骤二中切段接种于丛生芽诱导培养基中的方式是水平接种于丛生芽诱导培养基中。
作为对上述方案的进一步改进，步骤二中丛生芽诱导培养基为MS培养基，其中含有0.05～9.0mg/L的6-BA、0～0.02mg/L的IAA、25g/L蔗糖和7.5g/L的琼脂,丛生芽诱导培养基的pH＝5.8。
作为对上述方案的进一步改进，步骤二中丛生芽诱导培养基为MS培养基，其中含有0.7mg/L的6-BA、0.01mg/L的IAA、25g/L蔗糖和7.5g/L的琼脂,丛生芽诱导培养基的pH＝5.8。
作为对上述方案的进一步改进，步骤三中增殖培养基为MS培养基，其中含有0.05～2.0mg/L的6-BA、25g/L的蔗糖和7.5g/L的琼脂,增殖培养基的pH＝5.8。
作为对上述方案的进一步改进，步骤三中增殖培养基为MS培养基，其中含有0.45mg/L的6-BA、25g/L的蔗糖和7.5g/L的琼脂,增殖培养基的pH＝5.8。
作为对上述方案的进一步改进，步骤四中丛生芽伸长培养基为MS培养基，其中含有0.05～1.5mg/L的6-BA、0.01～0.1mg/L的IBA、25g/L的蔗糖和7.5g/L的琼脂，丛生芽伸长培养基的pH＝5.8。
作为对上述方案的进一步改进，步骤四中丛生芽伸长培养基为MS培养基，其中含有0.3mg/L的6-BA、0.02mg/L的IBA、25g/L的蔗糖和7.5g/L的琼脂，丛生芽伸长培养基的pH＝5.8。
作为对上述方案的进一步改进，步骤五中生根培养基为1/2MS培养基，其中含有0.1～0.5mg/L的IBA、0.01～0.05mg/L的NAA、20g/L的蔗糖和7.5g/L的琼脂,生根培养基的pH＝5.8。
作为对上述方案的进一步改进，步骤五中生根培养基为1/2MS培养基，其中含有0.2mg/L的IBA、0.02mg/L的NAA、20g/L的蔗糖和7.5g/L的琼脂,生根培养基的pH＝5.8。
本发明相比现有技术具有以下优点：
1、茎段为取材于野外多年生乌桕优良株系的当年生枝条，一方面能保持母本植株的种质特性，另一方面取材方便、材料丰富，可以实现对野外乌桕优良单株的快繁，实现品种培育；
2、再生过程中外植体消毒程序简单，消毒时间短，对外植体的毒害较小，且污染率低，最高污染率仅为3.4％；
3、丛生芽再生效率高，诱导率高达到100％；
4、再生速度快，繁殖系数高，为优良乌桕株系的快速繁殖和遗传改良提供了重要的技术支持；
5、此技术适用于乌桕所有的基因型，应用前景广阔，本发明的方法适用于乌桕所有的两个基因型(葡萄桕和鸡爪桕)，通过测试每个基因型都达到了很好的效果。
本发明所提供的一种提高野外乌桕优良株系茎段再生效率的方法，不仅为不同品系乌桕优良株系的快速繁殖和规模化生产提供了技术支撑，同时也为后期乌桕的品种改良奠定了基础。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
一种提高野外乌桕优良株系茎段再生效率的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一、取野外鸡爪桕优良株系的当年生茎段为外植体，茎段为未木质化或半木质化的茎段，经初步消毒后，在无菌操作台内进行表面消毒；初步消毒是将茎段去叶后分装于1000ml烧杯中，于流水下冲洗10min，期间添加2ml洗涤液冲洗，并不断摇晃。表面消毒是指将初步消毒后的茎段经75％的酒精擦拭后，剪切成4cm长度的小段；再用75％酒精进行浸泡15s，无菌水冲洗3遍；再用75％酒精进行浸泡15s，无菌水冲洗3遍；之后再经质量百分比浓度为0.1％的HgCl2消毒2min，最后用无菌水冲洗6遍，表面消毒期间需不停地摇晃。取材于野外多年生乌桕优良株系的当年生枝条，一方面能保持母本植株的种质特性；另一方面取材方便、材料丰富；可以实现对野外乌桕优良单株的快繁，实现品种培育；外植体消毒程序简单，消毒时间短，对外植体的毒害较小，且污染率低，最高污染率仅为3.4％。
步骤二、将步骤一处理过后的外植体分切成若干切段后接种于丛生芽诱导培养基中，经过2周光照培养，茎段两端切口处诱导出不定芽丛；切段是将步骤一处理完成的外植体切去两端消毒损伤部位后，再分切成长度为0.4cm大小获得的。切段接种于丛生芽诱导培养基中的方式是水平接种于丛生芽诱导培养基中。丛生芽诱导培养基为MS培养基，其中含有0.05mg/L的6-BA、25g/L蔗糖和7.5g/L的琼脂,丛生芽诱导培养基的pH＝5.8。
发明人测试了切段接种方式是竖直接种的方案：将茎段经表面消毒后，切成0.5cm大小，水平或竖直接种于装有相同诱导培养基的3种培养容器：玻璃培养皿(9×9cm)，100ml玻璃三角瓶，塑料培养瓶(7×9cm)中，放置于相同的培养条件下进行丛生芽诱导，4周后统计丛生芽诱导率及丛生芽生长情况，结果表明水平接种于诱导培养基中的茎段，两端诱导出大量的丛生芽，而竖直插入培养基中的茎段外植体仅一段长出丛生芽，芽的数量远远水平接种的外植体；且将外植体接种于培养皿中更利于丛生芽的诱导。
步骤三、将带有不定芽丛的茎段转接于增殖培养基中进行芽的增殖；增殖培养基为MS培养基，其中含有0.05mg/L的6-BA、25g/L的蔗糖和7.5g/L的琼脂,增殖培养基的pH＝5.8。
步骤四、培养2周后转至丛生芽伸长培养基上进行芽的伸长培养；丛生芽伸长培养基为MS培养基，其中含有0.05mg/L的6-BA、0.01mg/L的IBA、25g/L的蔗糖和7.5g/L的琼脂，丛生芽伸长培养基的pH＝5.8。
步骤五、待芽长至2～3cm，转至生根培养基中进行生根；生根培养基为1/2MS培养基，其中含有0.1mg/L的IBA、0.01mg/L的NAA、20g/L的蔗糖和7.5g/L的琼脂,生根培养基的pH＝5.8。
步骤六、待幼苗长至3～4cm并带有2～4片真叶时，进行炼苗并移栽，获得健壮的乌桕再生植株。
实施例2
一种提高野外乌桕优良株系茎段再生效率的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一、取野外鸡爪桕优良株系的当年生茎段为外植体，茎段为未木质化或半木质化的茎段，经初步消毒后，在无菌操作台内进行表面消毒；初步消毒是将茎段去叶后分装于1000ml烧杯中，于流水下冲洗15min，期间添加4ml洗涤液冲洗，并不断摇晃。表面消毒是指将初步消毒后的茎段经75％的酒精擦拭后，剪切成6cm长度的小段；再用75％酒精进行浸泡25s，无菌水冲洗5遍；再用75％酒精进行浸泡25s，无菌水冲洗5遍；之后再经质量百分比浓度为0.1％的HgCl2消毒5min，最后用无菌水冲洗8遍，表面消毒期间需不停地摇晃。取材于野外多年生乌桕优良株系的当年生枝条，一方面能保持母本植株的种质特性；另一方面取材方便、材料丰富；可以实现对野外乌桕优良单株的快繁，实现品种培育；外植体消毒程序简单，消毒时间短，对外植体的毒害较小，且污染率低，最高污染率仅为3.4％。
步骤二、将步骤一处理过后的外植体分切成若干切段后接种于丛生芽诱导培养基中，经过2～3周光照培养，茎段两端切口处诱导出不定芽丛；切段是将步骤一处理完成的外植体切去两端消毒损伤部位后，再分切成长度为0.7cm大小获得的。切段接种于丛生芽诱导培养基中的方式是水平接种于丛生芽诱导培养基中。丛生芽诱导培养基为MS培养基，其中含有9.0mg/L的6-BA、0.02mg/L的IAA、25g/L蔗糖和7.5g/L的琼脂,丛生芽诱导培养基的pH＝5.8。
发明人测试了切段接种方式是竖直接种的方案：将茎段经表面消毒后，切成0.5cm大小，水平或竖直接种于装有相同诱导培养基的3种培养容器：玻璃培养皿(9×9cm)，100ml玻璃三角瓶，塑料培养瓶(7×9cm)中，放置于相同的培养条件下进行丛生芽诱导，4周后统计丛生芽诱导率及丛生芽生长情况，结果表明水平接种于诱导培养基中的茎段，两端诱导出大量的丛生芽，而竖直插入培养基中的茎段外植体仅一段长出丛生芽，芽的数量远远水平接种的外植体；且将外植体接种于培养皿中更利于丛生芽的诱导。
步骤三、将带有不定芽丛的茎段转接于增殖培养基中进行芽的增殖；增殖培养基为MS培养基，其中含有2.0mg/L的6-BA、25g/L的蔗糖和7.5g/L的琼脂,增殖培养基的pH＝5.8。
步骤四、培养3周后转至丛生芽伸长培养基上进行芽的伸长培养；丛生芽伸长培养基为MS培养基，其中含有1.5mg/L的6-BA、0.1mg/L的IBA、25g/L的蔗糖和7.5g/L的琼脂，丛生芽伸长培养基的pH＝5.8。
步骤五、待芽长至2～3cm，转至生根培养基中进行生根；生根培养基为1/2MS培养基，其中含有0.5mg/L的IBA、0.05mg/L的NAA、20g/L的蔗糖和7.5g/L的琼脂,生根培养基的pH＝5.8。
步骤六、待幼苗长至3～4cm并带有2～4片真叶时，进行炼苗并移栽，获得健壮的乌桕再生植株。
实施例3
一种提高野外乌桕优良株系茎段再生效率的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一、取野外鸡爪桕优良株系的当年生茎段为外植体，茎段为未木质化或半木质化的茎段，经初步消毒后，在无菌操作台内进行表面消毒；初步消毒是将茎段去叶后分装于1000ml烧杯中，于流水下冲洗12min，期间添加3ml洗涤液冲洗，并不断摇晃。表面消毒是指将初步消毒后的茎段经75％的酒精擦拭后，剪切成5cm长度的小段；再用75％酒精进行浸泡20s，无菌水冲洗4遍；再用75％酒精进行浸泡20s，无菌水冲洗4遍；之后再经质量百分比浓度为0.1％的HgCl2消毒3min，最后用无菌水冲洗7遍，表面消毒期间需不停地摇晃。取材于野外多年生乌桕优良株系的当年生枝条，一方面能保持母本植株的种质特性；另一方面取材方便、材料丰富；可以实现对野外乌桕优良单株的快繁，实现品种培育；外植体消毒程序简单，消毒时间短，对外植体的毒害较小，且污染率低，最高污染率仅为3.4％。
步骤二、将步骤一处理过后的外植体分切成若干切段后接种于丛生芽诱导培养基中，经过2～3周光照培养，茎段两端切口处诱导出不定芽丛；切段是将步骤一处理完成的外植体切去两端消毒损伤部位后，再分切成长度为0.5cm大小获得的。切段接种于丛生芽诱导培养基中的方式是水平接种于丛生芽诱导培养基中。丛生芽诱导培养基为MS培养基，其中含有0.7mg/L的6-BA、0.01mg/L的IAA、25g/L蔗糖和7.5g/L的琼脂,丛生芽诱导培养基的pH＝5.8。
发明人测试了切段接种方式是竖直接种的方案：将茎段经表面消毒后，切成0.5cm大小，水平或竖直接种于装有相同诱导培养基的3种培养容器：玻璃培养皿(9×9cm)，100ml玻璃三角瓶，塑料培养瓶(7×9cm)中，放置于相同的培养条件下进行丛生芽诱导，4周后统计丛生芽诱导率及丛生芽生长情况，结果表明水平接种于诱导培养基中的茎段，两端诱导出大量的丛生芽，而竖直插入培养基中的茎段外植体仅一段长出丛生芽，芽的数量远远水平接种的外植体；且将外植体接种于培养皿中更利于丛生芽的诱导。
步骤三、将带有不定芽丛的茎段转接于增殖培养基中进行芽的增殖；增殖培养基为MS培养基，其中含有0.45mg/L的6-BA、25g/L的蔗糖和7.5g/L的琼脂,增殖培养基的pH＝5.8。
步骤四、培养2～3周后转至丛生芽伸长培养基上进行芽的伸长培养；丛生芽伸长培养基为MS培养基，其中含有0.3mg/L的6-BA、0.02mg/L的IBA、25g/L的蔗糖和7.5g/L的琼脂，丛生芽伸长培养基的pH＝5.8。
步骤五、待芽长至2～3cm，转至生根培养基中进行生根；生根培养基为1/2MS培养基，其中含有0.2mg/L的IBA、0.02mg/L的NAA、20g/L的蔗糖和7.5g/L的琼脂,生根培养基的pH＝5.8。
步骤六、待幼苗长至3～4cm并带有2～4片真叶时，进行炼苗并移栽，获得健壮的乌桕再生植株。
实施例4
一种提高野外乌桕优良株系茎段再生效率的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一、取野外葡萄桕优良株系的当年生茎段为外植体，茎段为未木质化或半木质化的茎段，经初步消毒后，在无菌操作台内进行表面消毒；初步消毒是将茎段去叶后分装于1000ml烧杯中，于流水下冲洗10min，期间添加2ml洗涤液冲洗，并不断摇晃。表面消毒是指将初步消毒后的茎段经75％的酒精擦拭后，剪切成4cm长度的小段；再用75％酒精进行浸泡15s，无菌水冲洗3遍；再用75％酒精进行浸泡15s，无菌水冲洗3遍；之后再经质量百分比浓度为0.1％的HgCl2消毒2min，最后用无菌水冲洗6遍，表面消毒期间需不停地摇晃。取材于野外多年生乌桕优良株系的当年生枝条，一方面能保持母本植株的种质特性；另一方面取材方便、材料丰富；可以实现对野外乌桕优良单株的快繁，实现品种培育；外植体消毒程序简单，消毒时间短，对外植体的毒害较小，且污染率低，最高污染率仅为3.4％。
步骤二、将步骤一处理过后的外植体分切成若干切段后接种于丛生芽诱导培养基中，经过2周光照培养，茎段两端切口处诱导出不定芽丛；切段是将步骤一处理完成的外植体切去两端消毒损伤部位后，再分切成长度为0.4cm大小获得的。切段接种于丛生芽诱导培养基中的方式是水平接种于丛生芽诱导培养基中。丛生芽诱导培养基为MS培养基，其中含有0.05mg/L的6-BA、25g/L蔗糖和7.5g/L的琼脂,丛生芽诱导培养基的pH＝5.8。
发明人测试了切段接种方式是竖直接种的方案：将茎段经表面消毒后，切成0.5cm大小，水平或竖直接种于装有相同诱导培养基的3种培养容器：玻璃培养皿(9×9cm)，100ml玻璃三角瓶，塑料培养瓶(7×9cm)中，放置于相同的培养条件下进行丛生芽诱导，4周后统计丛生芽诱导率及丛生芽生长情况，结果表明水平接种于诱导培养基中的茎段，两端诱导出大量的丛生芽，而竖直插入培养基中的茎段外植体仅一段长出丛生芽，芽的数量远远水平接种的外植体；且将外植体接种于培养皿中更利于丛生芽的诱导。
步骤三、将带有不定芽丛的茎段转接于增殖培养基中进行芽的增殖；增殖培养基为MS培养基，其中含有0.05mg/L的6-BA、25g/L的蔗糖和7.5g/L的琼脂,增殖培养基的pH＝5.8。
步骤四、培养2周后转至丛生芽伸长培养基上进行芽的伸长培养；丛生芽伸长培养基为MS培养基，其中含有0.05mg/L的6-BA、0.01mg/L的IBA、25g/L的蔗糖和7.5g/L的琼脂，丛生芽伸长培养基的pH＝5.8。
步骤五、待芽长至2～3cm，转至生根培养基中进行生根；生根培养基为1/2MS培养基，其中含有0.1mg/L的IBA、0.01mg/L的NAA、20g/L的蔗糖和7.5g/L的琼脂,生根培养基的pH＝5.8。
步骤六、待幼苗长至3～4cm并带有2～4片真叶时，进行炼苗并移栽，获得健壮的乌桕再生植株。
实施例5
一种提高野外乌桕优良株系茎段再生效率的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一、取野外葡萄桕优良株系的当年生茎段为外植体，茎段为未木质化或半木质化的茎段，经初步消毒后，在无菌操作台内进行表面消毒；初步消毒是将茎段去叶后分装于1000ml烧杯中，于流水下冲洗15min，期间添加4ml洗涤液冲洗，并不断摇晃。表面消毒是指将初步消毒后的茎段经75％的酒精擦拭后，剪切成6cm长度的小段；再用75％酒精进行浸泡25s，无菌水冲洗5遍；再用75％酒精进行浸泡25s，无菌水冲洗5遍；之后再经质量百分比浓度为0.1％的HgCl2消毒5min，最后用无菌水冲洗8遍，表面消毒期间需不停地摇晃。取材于野外多年生乌桕优良株系的当年生枝条，一方面能保持母本植株的种质特性；另一方面取材方便、材料丰富；可以实现对野外乌桕优良单株的快繁，实现品种培育；外植体消毒程序简单，消毒时间短，对外植体的毒害较小，且污染率低，最高污染率仅为3.4％。
步骤二、将步骤一处理过后的外植体分切成若干切段后接种于丛生芽诱导培养基中，经过2～3周光照培养，茎段两端切口处诱导出不定芽丛；切段是将步骤一处理完成的外植体切去两端消毒损伤部位后，再分切成长度为0.7cm大小获得的。切段接种于丛生芽诱导培养基中的方式是水平接种于丛生芽诱导培养基中。丛生芽诱导培养基为MS培养基，其中含有9.0mg/L的6-BA、0.02mg/L的IAA、25g/L蔗糖和7.5g/L的琼脂,丛生芽诱导培养基的pH＝5.8。
发明人测试了切段接种方式是竖直接种的方案：将茎段经表面消毒后，切成0.5cm大小，水平或竖直接种于装有相同诱导培养基的3种培养容器：玻璃培养皿(9×9cm)，100ml玻璃三角瓶，塑料培养瓶(7×9cm)中，放置于相同的培养条件下进行丛生芽诱导，4周后统计丛生芽诱导率及丛生芽生长情况，结果表明水平接种于诱导培养基中的茎段，两端诱导出大量的丛生芽，而竖直插入培养基中的茎段外植体仅一段长出丛生芽，芽的数量远远水平接种的外植体；且将外植体接种于培养皿中更利于丛生芽的诱导。
步骤三、将带有不定芽丛的茎段转接于增殖培养基中进行芽的增殖；增殖培养基为MS培养基，其中含有2.0mg/L的6-BA、25g/L的蔗糖和7.5g/L的琼脂,增殖培养基的pH＝5.8。
步骤四、培养3周后转至丛生芽伸长培养基上进行芽的伸长培养；丛生芽伸长培养基为MS培养基，其中含有1.5mg/L的6-BA、0.1mg/L的IBA、25g/L的蔗糖和7.5g/L的琼脂，丛生芽伸长培养基的pH＝5.8。
步骤五、待芽长至2～3cm，转至生根培养基中进行生根；生根培养基为1/2MS培养基，其中含有0.5mg/L的IBA、0.05mg/L的NAA、20g/L的蔗糖和7.5g/L的琼脂,生根培养基的pH＝5.8。
步骤六、待幼苗长至3～4cm并带有2～4片真叶时，进行炼苗并移栽，获得健壮的乌桕再生植株。
实施例6
一种提高野外乌桕优良株系茎段再生效率的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一、取野外葡萄桕优良株系的当年生茎段为外植体，茎段为未木质化或半木质化的茎段，经初步消毒后，在无菌操作台内进行表面消毒；初步消毒是将茎段去叶后分装于1000ml烧杯中，于流水下冲洗12min，期间添加3ml洗涤液冲洗，并不断摇晃。表面消毒是指将初步消毒后的茎段经75％的酒精擦拭后，剪切成5cm长度的小段；再用75％酒精进行浸泡20s，无菌水冲洗4遍；再用75％酒精进行浸泡20s，无菌水冲洗4遍；之后再经质量百分比浓度为0.1％的HgCl2消毒4min，最后用无菌水冲洗7遍，表面消毒期间需不停地摇晃。取材于野外多年生乌桕优良株系的当年生枝条，一方面能保持母本植株的种质特性；另一方面取材方便、材料丰富；可以实现对野外乌桕优良单株的快繁，实现品种培育；外植体消毒程序简单，消毒时间短，对外植体的毒害较小，且污染率低，最高污染率仅为3.4％。
步骤二、将步骤一处理过后的外植体分切成若干切段后接种于丛生芽诱导培养基中，经过2～3周光照培养，茎段两端切口处诱导出不定芽丛；切段是将步骤一处理完成的外植体切去两端消毒损伤部位后，再分切成长度为0.5cm大小获得的。切段接种于丛生芽诱导培养基中的方式是水平接种于丛生芽诱导培养基中。丛生芽诱导培养基为MS培养基，其中含有0.7mg/L的6-BA、0.01mg/L的IAA、25g/L蔗糖和7.5g/L的琼脂,丛生芽诱导培养基的pH＝5.8。
发明人测试了切段接种方式是竖直接种的方案：将茎段经表面消毒后，切成0.5cm大小，水平或竖直接种于装有相同诱导培养基的3种培养容器：玻璃培养皿(9×9cm)，100ml玻璃三角瓶，塑料培养瓶(7×9cm)中，放置于相同的培养条件下进行丛生芽诱导，4周后统计丛生芽诱导率及丛生芽生长情况，结果表明水平接种于诱导培养基中的茎段，两端诱导出大量的丛生芽，而竖直插入培养基中的茎段外植体仅一段长出丛生芽，芽的数量远远水平接种的外植体；且将外植体接种于培养皿中更利于丛生芽的诱导。
步骤三、将带有不定芽丛的茎段转接于增殖培养基中进行芽的增殖；增殖培养基为MS培养基，其中含有0.45mg/L的6-BA、25g/L的蔗糖和7.5g/L的琼脂,增殖培养基的pH＝5.8。
步骤四、培养2～3周后转至丛生芽伸长培养基上进行芽的伸长培养；丛生芽伸长培养基为MS培养基，其中含有0.3mg/L的6-BA、0.02mg/L的IBA、25g/L的蔗糖和7.5g/L的琼脂，丛生芽伸长培养基的pH＝5.8。
步骤五、待芽长至2～3cm，转至生根培养基中进行生根；生根培养基为1/2MS培养基，其中含有0.2mg/L的IBA、0.02mg/L的NAA、20g/L的蔗糖和7.5g/L的琼脂,生根培养基的pH＝5.8。
步骤六、待幼苗长至3～4cm并带有2～4片真叶时，进行炼苗并移栽，获得健壮的乌桕再生植株。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种提高野外乌桕优良株系茎段再生效率的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一、取野外乌桕优良株系的当年生茎段为外植体，所述当年生茎段为未木质化或半木质化的茎段，所述乌桕包括鸡爪桕和葡萄桕，经初步消毒后，在无菌操作台内进行表面消毒，所述初步消毒是将茎段去叶后分装于1000ml烧杯中，于流水下冲洗10～15min，期间添加2～4ml洗涤液冲洗，并不断摇晃；所述表面消毒是指将初步消毒后的茎段经75％的酒精擦拭后，剪切成4～6cm长度的小段；再用75％酒精进行浸泡15～25s，无菌水冲洗3～5遍；再用75％酒精进行浸泡15～25s，无菌水冲洗3～5遍；之后再经质量百分比浓度为0.1％的HgCl2消毒2～5min，最后用无菌水冲洗6～8遍，表面消毒期间需不停地摇晃；
步骤二、将步骤一处理过后的外植体分切成若干切段后接种于丛生芽诱导培养基中，经过2～3周光照培养，茎段两端切口处诱导出不定芽丛，切段是将步骤一处理完成的外植体切去两端消毒损伤部位后，再分切成长度为0.4～0.7cm大小获得的；所述切段接种于丛生芽诱导培养基中的方式是水平接种于丛生芽诱导培养基中，所述丛生芽诱导培养基为MS培养基添加0.05～9.0mg/L的6-BA、25g/L蔗糖和7.5g/L的琼脂，所述丛生芽诱导培养基的pH为5.8；
步骤三、将带有不定芽丛的茎段转接于增殖培养基中进行芽的增殖，所述增殖培养基为MS培养基添加0.05～2.0mg/L的6-BA、25g/L的蔗糖和7.5g/L的琼脂，所述增殖培养基的pH为5.8；
步骤四、培养2～3周后转至丛生芽伸长培养基上进行芽的伸长培养，所述丛生芽伸长培养基为MS培养基添加0.05～1.5mg/L的6-BA、0.01～0.1mg/L的IBA、25g/L的蔗糖和7.5g/L的琼脂，所述丛生芽伸长培养基的pH为5.8；
步骤五、待芽长至2～3cm，转至生根培养基中进行生根，所述生根培养基为1/2MS培养基添加0.1～0.5mg/L的IBA、0.01～0.05mg/L的NAA、20g/L的蔗糖和7.5g/L的琼脂，所述生根培养基的pH为5.8；
步骤六、待幼苗长至3～4cm并带有2～4片真叶时，进行炼苗并移栽，获得健壮的乌桕再生植株。
2.如权利要求1所述一种提高野外乌桕优良株系茎段再生效率的方法，其特征在于：所述步骤四中丛生芽伸长培养基为MS培养基添加0.3mg/L的6-BA、0.02mg/L的IBA、25g/L的蔗糖和7.5g/L的琼脂，所述丛生芽伸长培养基的pH为5.8。
3.如权利要求1所述一种提高野外乌桕优良株系茎段再生效率的方法，其特征在于：所述步骤五中生根培养基为1/2MS培养基添加0.2mg/L的IBA、0.02mg/L的NAA、20g/L的蔗糖和7.5g/L的琼脂，所述生根培养基的pH为5.8。
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