CN104012416A - 一种乌桕叶盘高效再生的方法 - Google Patents

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侯金艳
沈羊城
赵薇微
吴影
杨鸣雷
刘文博
毛颖基
黄胜威
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Abstract

本发明公开了一种乌桕叶盘高效再生的方法，包括如下步骤：将乌桕无菌苗的叶片切成叶盘；叶盘经丛生芽诱导培养基诱导培养后形成丛生芽；丛生芽在增殖与伸长培养基上进行芽的扩繁和伸长；待芽长至2-3cm转入生根培养基进行生根培养，25～30d后获得健壮的乌桕试管苗。本发明相比现有技术具有以下优点：本发明所提供的方法具有取材便利、材料丰富，再生效率高，培养周期短，培养基添加激素成分简单，操作方便等优点，而且本发明提供的方法可以实现对野外优良单株的快繁，能保持母本的种质特征，实现品种培育；为乌桕遗传转化奠定了基础，有利于加快乌桕遗传改良的进程，同时也为后期乌桕优良株系的快速繁殖提供技术支撑。

Description

一种乌桕叶盘高效再生的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种乌桕叶盘高效再生的方法。
背景技术
乌桕(Sapium sebiferum)是大戟科乌桕属多年生落叶乔木。乌桕对土壤的适应性较强，在红壤、黄壤、黄褐色土、紫色土、棕壤等土类，在从沙到粘不同质地的土壤，以及酸性、中性或微碱性的土壤，均能生长，且是抗盐性强的乔木树种之一。乌桕要求有较高的土壤湿度，且能耐短期积水。同时有一定的抗风性和较耐干早瘠薄。此外，乌桕对有毒氟化氢气体有较强的抗性。乌桕广泛分布于我国热带和亚热带地区，为我国特有经济树种。乌桕为多用途树种，种子外被蜡质，可用于制作肥皂、蜡烛和油漆等工业生产的原料；种子出油率高达53％，种仁榨取的液体油可用作生物柴油的原料。乌桕被列为“中国四大木本油料树种”之一；秋叶鲜红、紫色或鲜黄色，也可作庭院绿化及行道树。近年来乌桕无论是作为油料用经济作物，还是作为观赏绿化树种，均已引起广泛关注。
但目前乌桕种植普遍存在童期较长、果实产量低、缺乏优良品种等问题，大大限制了其作为能源植物进行大规模栽培和产业化应用。因此，加强其品种改良，培育短童期、高产，优质且抗虫的乌桕优良品种是当前发展乌桕生物柴油产业最为迫切的任务。目前有关乌桕的遗传基础研究薄弱，育种工作尚属空白；同时由于乌桕作为多年生木本植物，其品种培育普遍存在世代周期长，遗传学上高度杂合等问题，常规育种很难满足育种需求。以转基因技术为基础的分子育种手段在一定程度上能大大加快育种进程，但需要依赖于高效稳定的组培再生体系。同时优良株系(品种)的扩繁也需要组培扩繁技术的支撑。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，本发明运用生物技术手段，提供了一种乌桕叶盘高效再生的方法，为实现乌桕的品种改良和快速繁殖奠定基础，推进乌桕生物柴油产业的发展。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种乌桕叶盘高效再生的方法，包括如下步骤：
(1)取乌桕无菌苗的叶片，切成多个0.3×0.5cm2大小的叶盘；
(2)将多个叶盘接种于丛生芽诱导培养基上进行培养，21～28d后诱导形成丛生芽；
(3)再将丛生芽接种在相应的增殖与伸长培养基上进行芽的扩繁和伸长；
(4)待芽长至2～3cm高时，转入生根培养基进行生根培养，25～30d后获得健壮的乌桕试管苗；
其中，所述丛生芽诱导培养基、增殖与伸长培养基、生根培养基这三种培养基的基本培养基均为含有30g/L蔗糖以及7.0g/L琼脂的MS培养基，所述丛生芽诱导培养基还包括有一种或两种植物激素。
作为上述的一种乌桕叶盘高效再生的方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，所述叶片取材于通过野外乌桕植株茎段组培30～50d获得的乌桕无菌苗完全伸展的叶片。
作为上述的一种乌桕叶盘高效再生的方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，所述叶盘在丛生芽诱导培养基上的接种方式为叶盘近轴端朝上。
作为上述的一种乌桕叶盘高效再生的方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，所述丛生芽诱导培养基为：MS+0.01～3.0mg/L TDZ或0.1～2.0mg/L6-BA+0.0～2.0mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂。
作为上述的一种乌桕叶盘高效再生的方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，所述增殖与伸长培养基为：MS+0.3～1.5mg/L6-BA+0.0～0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂。
作为上述的一种乌桕叶盘高效再生的方法的优选实施方式，所述步骤(4)中，所述生根培养基为：1/2MS+0.1～3.0mg/L IBA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂。
作为上述的一种乌桕叶盘高效再生的方法的优选实施方式，所述再生培养条件为：温度25±2℃，光照强度2000～2500lx，光照时间为13～14h。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明所提供的一种乌桕叶盘高效再生的方法，采用人工诱导丛生芽再生的方式，选取乌桕无菌苗的叶片切成的叶盘为材料，通过激素调控，在离体培养条件下培养再生，具有以下突出优点:其一，叶片取材于通过野外乌桕植株茎段组培获得的乌桕无菌苗完全伸展的叶片，能保持母本的种质特征，取材方便、材料丰富，可以实现对野外优良单株的快繁，实现品种培育；其二，丛生芽再生速度快，叶盘仅需经过3～4周的诱导，即可再生出大量的丛生芽，经试验统计每个叶盘再生出的丛生芽为10-30个；其三，再生效率高，诱导率达100％；其四，整个叶盘再生培养的周期仅为75-80d，培养周期短；其五，芽的扩繁和伸长仅需在一个培养基上进行，步骤简化，操作简单；其六，再生过程中所用到的培养基仅添加了一种或两种植物激素，添加激素成分简单，节约成本，方便操作。因此，本发明提供的乌桕叶盘高效再生的方法，为乌桕遗传转化提供了支撑，有利于加快乌桕遗传改良的进程；为后期乌桕优良株系的快速繁殖提供技术支撑。
附图说明
图1是将叶片切成叶盘后的示意图。
图2是叶盘经丛生芽诱导培养基诱导培养后形成的丛生芽示意图。
图3是丛生芽经增殖与伸长培养基进行芽的扩繁和伸长后的结构示意图。
图4是丛生芽经生根培养基进行生根培养后的示意图。
图5是乌桕试管苗进行炼苗、驯化示意图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本实施例提供的一种乌桕叶盘高效再生的方法，包括如下步骤：
(1)取乌桕无菌苗的叶片，切成多个0.3×0.5cm2大小的叶盘，如图1所示；其中，叶片优选取材于通过野外乌桕植株茎段组培30～50d获得的乌桕无菌苗完全伸展的叶片；
(2)将多个叶盘接种于丛生芽诱导培养基上进行培养，叶盘在丛生芽诱导培养基上的接种方式为叶盘近轴端朝上，21～28d后诱导形成丛生芽；如图2所示；
(3)再将丛生芽接种在相应的增殖与伸长培养基上进行芽的扩繁和伸长，如图3所示；
(4)待芽长至2～3cm高时，转入生根培养基进行生根培养，25～30d后获得健壮的乌桕试管苗，生根率高达96.3％，如图4所示；最后将乌桕试管苗进行炼苗、驯化，即可获得健壮的乌桕再生植株，如图5所示。
其中，整个再生培养条件为：温度25±2℃，光照强度2000～2500lx，光照时间为13～14h。丛生芽诱导培养基、增殖与伸长培养基、生根培养基这三种培养基的基本培养基均为含有30g/L蔗糖以及7.0g/L琼脂的MS培养基。
步骤(2)中，丛生芽诱导培养基为：MS+0.01～3.0mg/L TDZ或0.1～2.0mg/L 6-BA+0.0～2.0mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂。
步骤(3)中，增殖与伸长培养基为：MS+0.3～1.5mg/L 6-BA+0.0～0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂。
步骤(4)中，生根培养基为：1/2MS+0.1～3.0mg/L IBA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂。
经试验验证，整个叶盘再生培养的周期仅为75-80d，培养周期短。再生效率高，诱导率达100％。本发明所提供的方法具有取材便利、材料丰富，再生效率高，培养周期短，培养基添加激素成分简单，操作方便等优点，而且本专利提供的方法可以实现对野外优良单株的快繁，能保持母本的种质特征，实现品种培育；为乌桕遗传转化提供了支撑，有利于加快乌桕遗传改良的进程，为后期乌桕优良株系的快速繁殖提供技术支撑。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种乌桕叶盘高效再生的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取乌桕无菌苗的叶片，切成多个0.3×0.5cm2大小的叶盘；
(2)将多个叶盘接种于丛生芽诱导培养基上进行培养，21～28d后诱导形成丛生芽；
(3)再将丛生芽接种在相应的增殖与伸长培养基上进行芽的扩繁和伸长；
(4)待芽长至2～3cm高时，转入生根培养基进行生根培养，25～30d后获得健壮的乌桕试管苗；
其中，所述丛生芽诱导培养基、增殖与伸长培养基、生根培养基这三种培养基的基本培养基均为含有30g/L蔗糖以及7.0g/L琼脂的MS培养基，所述丛生芽诱导培养基还包括有一种或两种植物激素。
2.如权利要求1所述的一种乌桕叶盘高效再生的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述叶片取材于通过野外乌桕植株茎段组培30～50d获得的乌桕无菌苗完全伸展的叶片。
3.如权利要求1所述的一种乌桕叶盘高效再生的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述叶盘在丛生芽诱导培养基上的接种方式为叶盘近轴端朝上。
4.如权利要求1所述的一种乌桕叶盘高效再生的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述丛生芽诱导培养基为：MS+0.01～3.0mg/L TDZ或0.1～2.0mg/L6-BA+0.0～2.0mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂。
5.如权利要求1所述的一种乌桕叶盘高效再生的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述增殖与伸长培养基为：MS+0.3～1.5mg/L6-BA+0.0～0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂。
6.如权利要求1所述的一种乌桕叶盘高效再生的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述生根培养基为：1/2MS+0.1～3.0mg/L IBA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂。
7.如权利要求1至6任一所述的一种乌桕叶盘高效再生的方法，其特征在于，所述再生培养条件为：温度25±2℃，光照强度2000～2500lx，光照时间为13～14h。
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