CN105706931B - 一种乌桕成熟胚乳离体直接再生植株的方法 - Google Patents

一种乌桕成熟胚乳离体直接再生植株的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种乌桕成熟胚乳离体直接再生植株的方法，包括如下步骤：(1)取乌桕成熟种子剪去种壳，经表面消毒后接种于添加生长调节剂的启培养基中，光照，进行胚乳启动培养；(2)把胚乳从乌桕种子上剥离，接种于不定芽诱导培养基中，光照，进行不定芽的诱导，获得嫩绿不定芽丛；(3)将不定芽丛切块，转接于增殖和伸长培养基中进行不定芽的增殖和伸长；(4)转入生根培养基进行生根，获得健壮的乌桕再生植株。本发明具有再生过程简单，不经过愈伤组织的诱导阶段，可以在胚乳周边表皮直接诱导出不定芽丛的优点。

Description

一种乌桕成熟胚乳离体直接再生植株的方法
技术领域
本发明涉及一种乌桕成熟胚乳离体直接再生植株的方法，属于生物技术领域。
背景技术
乌桕(Sapium sebiferum)为大戟科乌桕属多年生木本植物，广泛分布于我国热带和亚热带地区，为我国特有经济树种。乌桕树冠整齐，叶形秀丽，秋叶鲜红、紫色或鲜黄色，集观形、叶、果于一体，具有非常高的观赏价值，可作庭院绿化及行道树。此外，乌桕适应性较强，对土质要求不高，耐旱、涝、贫瘠、适宜边际土地种植，且种植模式多样，易于实现大面积规模化生产。因此，乌桕无论是作为观赏树种，还是荒山滩涂绿化树种均已引起广泛关注。但乌桕作为景观或滩涂绿化树种，普遍存在枝条稀疏，树型中空的问题，在一定程度上限制了乌桕的应用。
三倍体育种培育是植物种质创新的重要途径，在其遗传学和育种学领域具有重要的意义。三倍体植物通常具有生长迅速、生长旺盛、抗逆性强、无籽等优良性状。相对于传统的借助杂交技术创制三倍体而言，通过胚乳离体再生三倍体具有周期短、效率高等优点；同时，由于胚乳细胞的染色体2/3来自母本，1/3来自父本，作为研究性状遗传规律的材料，也颇具价值；此外，胚乳细胞在形成三倍体植株的同时，可以产生大量不同倍性的混合体和非整倍体，可为育种提供丰富的不同倍性材料。因此，通过胚乳培养获得营养生长旺盛的乌桕多倍体植株，可以克服乌桕在景观和绿化应用上的不足。
目前，关于利用乌桕胚乳为外植体，对乌桕进行离体再生的研究也有报道，但主要集中在通过愈伤组织的诱导和分化来进行植株再生研究，存在再生效率低，再生过程繁琐等问题，很难满足乌桕多倍体育种的需求。因此，针对当前乌桕胚乳倍性育种所存在的问题，急需开发一种乌桕成熟胚乳离体直接再生植株的方法，以满足乌桕倍性育种的需求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种乌桕成熟胚乳离体直接再生植株的方法。为实现乌桕的倍性育种和后期的遗传改良研究奠定基础。
本发明是通过如下技术方案实现的：一种乌桕成熟胚乳离体直接再生植株的方法，包括如下步骤：
(1)取乌桕成熟种子剪去种壳，经表面消毒后接种于添加生长调节剂的启培养基中，光照，进行胚乳启动培养；
(2)把胚乳从乌桕种子上剥离，接种于不定芽诱导培养基中，光照，进行不定芽的诱导，获得嫩绿不定芽丛；
(3)将不定芽丛切块，转接于增殖和伸长培养基中进行不定芽的增殖和伸长；
(4)转入生根培养基进行生根，获得健壮的乌桕试管苗，驯化后进行移栽。
优选地：所述步骤(1)的光照时间为6～9d；所述步骤(2)的光照时间为2～3周；所述步骤(4)中，培养3～4周后获得乌桕试管苗。
优选地：所述步骤(4)中，待芽长至2～3cm并伴有2～3个叶片时，再转入生根培养基进行生根。
优选地：所述步骤(1)的表面消毒是指在无菌操作台中，用75％的无水乙醇消毒30～45s，之后用20％的次氯酸钠溶液消毒8～12min，无菌水冲洗3～5遍，之后再经600W超声处理7～10min，种子表面消毒期间不停地摇动。
优选地：所述步骤(1)的乌桕启动培养基为包括有2.0～8.0mg/L 6-BA、0.2～1.0mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基。
优选地：所述乌桕胚乳来源于经过预培养6～9d，处于萌动状态的乌桕种子。
优选地：所述步骤(2)的不定芽诱导培养基为包括有3.0～6.0mg/L 6-BA、0.05～0.5mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基。
优选地：所述步骤(3)的切块是指将胚乳丛生芽增殖前切成(0.2～0.4)×(0.3～0.5)cm2大小的切块。
优选地：所述步骤(3)的增殖和伸长培养基为包括有1.0～2.0mg/L 6-BA、0.05～0.1mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基。
本发明相比现有技术具有以下有益效果：
(1)再生过程简单，不经过愈伤组织的诱导阶段，可以在胚乳周边表皮直接诱导出不定芽丛；
(2)进一步，本发明中采用次氯酸钠与超声结合的方法对乌桕种子进行消毒，具有消毒时间短，消毒效果好，污染率为0％；同时，可以促进种子的萌动和后期胚乳的再生等优势；
(3)进一步，不定芽再生速度快，胚乳经过6～9d的启动培养和2～3周的诱导培养，即可再生出大量的不定芽(每个胚乳20～40个)；
(4)再生频率高，胚乳不定芽的诱导率高达100％。
因此，本发明所提供的一种乌桕成熟胚乳离体直接再生植株的方法，不仅为乌桕倍性育种和遗传改良提供了技术支撑，而且对于开展乌桕性状遗传规律等基础研究具有重要意义。
附图说明
图1启动培养后剥离的乌桕成熟胚乳
图2胚乳丛生芽诱导
图3接种于增殖培养基上的胚乳丛生芽切块
图4丛生芽的增殖和伸长
图5丛生芽的生根
图6乌桕无菌苗的移栽
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
一种乌桕成熟胚乳离体直接再生植株的方法，具体如下：
(1)取乌桕成熟种子剪去种壳，于无菌操作台内进行表面消毒；表面消毒是指用75％的无水乙醇消毒30s，之后用20％的次氯酸钠溶液消毒8min，无菌水冲洗3遍，之后再经600W超声处理7min,种子表面消毒期间不停地摇动。
(2)将步骤(1)中消毒后的种子接种于添加有2.0mg/L 6-BA、0.2mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基中进行胚乳启动培养。
(3)光照培养6～9d后，把胚乳从处于萌动状态乌桕种子上剥离，接种于添加有3.0mg/L 6-BA、0.05mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基种进行不定芽诱导。
(4)光照培养2～3周后，获得嫩绿不定芽丛；将不定芽丛切成0.2×0.3cm2大小的切块，接种于添加有1.0mg/L 6-BA、0.05mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基中进行不定芽的增殖和伸长。
(5)待芽长至2～3cm并伴有2～3个叶片时，转入添加有0.3mg/L IBA的1/4MS固体生根培养基中进行生根，3～4周后获得根系健壮的乌桕试管苗，驯化后进行移栽。
实施例2
一种乌桕成熟胚乳离体直接再生植株的方法，具体如下：
(1)取乌桕成熟种子剪去种壳，于无菌操作台内进行表面消毒；表面消毒是指用75％的无水乙醇消毒40s，之后用20％的次氯酸钠溶液消毒10min，无菌水冲洗4遍，之后再经600W超声处理10min,种子表面消毒期间不停地摇动。
(2)将步骤(1)中消毒后的种子接种于添加有5.0mg/L 6-BA、0.5mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基中进行胚乳启动培养。
(3)光照培养6～9d后，把胚乳从处于萌动状态乌桕种子上剥离(图1)，接种于添加有4.5mg/L 6-BA、0.2mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基种进行不定芽诱导。
(4)光照培养2～3周后，获得嫩绿不定芽丛(图2)；将不定芽丛切成0.3×0.4cm2大小的切块(图3)，接种于添加有1.5mg/L 6-BA、0.07mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基中进行不定芽的增殖和伸长(图4)。
(5)待芽长至2～3cm并伴有2～3个叶片时，转入添加有0.3mg/L IBA的1/4MS固体生根培养基进行生根(图5)，3～4周后获得根系健壮的乌桕试管苗，驯化后进行移栽(图6)。
实施例3
一种乌桕成熟胚乳离体直接再生植株的方法，具体如下：
(1)取乌桕成熟种子剪去种壳，于无菌操作台内进行表面消毒；表面消毒是指于无菌操作台中用75％的无水乙醇消毒45s，之后用20％的次氯酸钠溶液消毒12min，无菌水冲洗5遍，之后再经600W超声处理8min,种子表面消毒期间不停地摇动。
(2)将步骤(1)中消毒后的种子接种于添加有8.0mg/L 6-BA、1.0mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基中进行胚乳启动培养。
(3)光照培养6～9d后，把胚乳从处于萌动状态乌桕种子上剥离，接种于添加有6.0mg/L 6-BA、0.5mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基种进行不定芽诱导。
(4)光照培养2～3周后，获得嫩绿不定芽丛；将不定芽丛切成0.4×0.5cm2大小的切块，接种于添加有2.0mg/L 6-BA、0.1mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基中进行不定芽的增殖和伸长。
(5)待芽长至2～3cm并伴有2～3个叶片时，转入添加有0.3mg/L IBA的1/4MS固体生根培养基进行生根，3～4周后获得根系健壮的乌桕试管苗，驯化后进行移栽。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种乌桕成熟胚乳离体直接再生植株的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)取乌桕成熟种子剪去种壳，经表面消毒后接种于添加有2.0～8.0mg/L 6-BA、0.2～1.0mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基中，光照，进行胚乳启动培养；其中，表面消毒是指在无菌操作台中，用75％的无水乙醇消毒30～45s，之后用20％的次氯酸钠溶液消毒8～12min，无菌水冲洗3～5遍，之后再经600W超声处理7～10min，种子表面消毒期间不停地摇动；
(2)预培养6～9d，把胚乳从处于萌动状态的乌桕种子上剥离，接种于添加有3.0～6.0mg/L 6-BA、0.05～0.5mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基中，光照，进行不定芽的诱导，获得嫩绿不定芽丛；
(3)将不定芽丛切块，转接于添加有1.0～2.0mg/L 6-BA、0.05～0.1mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基中进行不定芽的增殖和伸长；
(4)转入添加有0.3mg/L IBA的1/4MS固体生根培养基进行生根，获得健壮的乌桕试管苗，驯化后进行移栽。
2.根据权利要求1所述的一种乌桕成熟胚乳离体直接再生植株的方法，其特征在于：所述步骤(1)的光照时间为6～9d；所述步骤(2)的光照时间为2～3周；所述步骤(4)中，培养3～4周后获得乌桕试管苗。
3.根据权利要求1所述的一种乌桕成熟胚乳离体直接再生植株的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，待芽长至2～3cm并伴有2～3个叶片时，再转入生根培养基进行生根。
4.根据权利要求1所述的一种乌桕成熟胚乳离体直接再生植株的方法，其特征在于：所述步骤(3)的切块是指将胚乳丛生芽增殖前切成(0.2～0.4)×(0.3～0.5)cm2大小的切块。
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