CN110637725B - 一种组织培养快速繁殖木薯种苗的方法 - Google Patents
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Abstract
一种组织培养快速繁殖木薯种苗的方法,包括以下步骤:(1)外植体选择;(2)外植体消毒;(3)丛生芽诱导培养;(4)生根培养;(5)幼苗驯化等步骤。此组织培养快繁技术包括丛生芽诱导、生根培养和驯化移栽,在保证高品质种苗的基础上,诱导过程同步增殖,生根过程同步壮苗,移栽成活率达75%以上。通过本发明的诱导培养、生根培养等操作,使得催芽方式简洁快速,脱毒方式简捷有效,诱导率高达98.1%,并且再生时间短:在诱导过程同步增殖,生根过程同步壮苗,驯化移栽后,约在65~70天内获得大量的木薯种苗。在保证较高丛生芽诱导率和繁殖系数的基础上,合理调节基本培养基和蔗糖等浓度,缩短了培养时间,可以降低生产成本。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术,具体涉及一种组织培养快速繁殖木薯种苗的方法。
背景技术
木薯(Manihot esculenta Crantz)是大戟科木薯属灌木,原产于南美洲的热带地区。木薯是世界主粮之一,块根中含有丰富的淀粉,有着“淀粉之王”、“地下粮仓”等美称,与马铃薯、红薯并列称为世界三大薯类作物;同时它的单位面积提供的食物能量超过水稻、小麦、玉米和高粱,是人类主要的食用作物资源之一。木薯全年皆可种植,具有粗生易栽,耐干旱,耐贫瘠,病虫害少的优点,并且单产量较高,是一种理想的农作物。我国在19世纪20年代引种,现主要栽培于江西、广西、广东、海南、福建和四川等省份。
传统的种茎扦插繁殖方式存在繁殖率低、周期长和运输不便等问题;长期的无性繁殖导致品种严重退化,产量大幅降低,迫切需要对木薯栽培品种进行脱毒改良,建立快速繁殖体系。传统的种子繁殖方式易造成木薯后代单株之间差异较大,难以稳定保持优良性状。组织培养快繁技术是以优良无性系为外植体,通过无菌培养快速得到组培苗;该技术具有产量高,易于生产管理、且能保持原有品种的优良性状等优点,可以有效克服传统无性繁殖和种子繁殖存在的问题。
本发明采用木薯茎段为外植体,建立了快速高效的快繁体系,并有效克服传统繁殖周期长、品种严重退化以及产量大幅降低的问题,大大降低了木薯种苗培育的成本,可应用于大规模生产木薯种苗和科学研究。
发明内容
基于上述背景技术中提到的问题,本发明拟提供一种木薯的茎段组织培养快繁种苗的方法,解决现有技术存在的繁殖周期长、用种量大和品种严重退化的问题。
本发明包括以下步骤:
(1)外植体选择:选择健壮无病害、生长旺盛的植株,剪取距茎顶端约10厘米幼嫩茎段。从叶柄基部切除叶片,剪取带有腋芽的茎段,即为外植体。
(2)外植体消毒:将步骤(1)中的外植体用自来水冲洗10分钟,清除尘土和碎屑,再完全浸没于饱和洗衣粉溶液10分钟,流水冲洗30-60分钟,将洗好的茎段放入广口瓶,在无菌工作台上利用两步法脱毒,即75%酒精消毒20秒,无菌水冲洗2-3次,用0.1%升汞消毒6分钟,无菌水冲洗3-4次,置于无菌滤纸上吸干表面水分,最后将外植体剪成约1厘米茎段。
(3)丛生芽诱导培养:将步骤(2)中的外植体接种到丛生芽诱导培养基中。培养14天后获得木薯丛生芽,再切取再生芽茎段0.5-1厘米接种到丛生芽诱导培养基中,进行诱导分化、增殖培养,即诱导过程同步增殖;当扩繁系数达到10倍时,进行生根培养。温度(23-27)℃,光周期12h/d,光照强度6000lx。
(4)生根培养:将步骤(3)中获得的不定芽接种到生根培养基中,培养30天后,即可获得大量木薯试管苗,温度(23-27)℃,光周期12h/d,光照强度6000lx。
(5)幼苗驯化:取出试管苗,用自来水洗净根部残留的培养基,再用0.1%KMnO4浸泡30秒,最后用自来水清洗,将处理好的试管苗移栽至营养钵基质中驯化,将成活的幼苗移栽到大田中,即为木薯种苗。
作为优选,本发明步骤(1)过程中要优先保证木薯植株健壮块茎大、无病害,并带有幼嫩腋芽。
作为优选,本发明步骤(2)过程中要保证剪取的1厘米茎段上至少含有一个叶片。
作为优选,本发明步骤(3)中的丛生芽诱导培养基以MS培养基为基本培养基,添加20g·L-1蔗糖,7g·L-1琼脂,0.5mg·L-16-苄基氨基嘌呤,2μmol·L-1硫酸铜,pH5.8~6.0。
作为优选,本发明步骤(4)中的生根培养基以MS培养基为基本培养基,添加30g·L-1蔗糖,7g·L-1琼脂,0.1mg·L-1萘乙酸,0.6mg·L-16-苄基氨基嘌呤,2.5μmol·L-1硫酸铜,pH5.8~6.0。
本发明步骤(5)中试管苗用0.1%KMnO4浸泡30秒,可以有效降低移栽过程中幼苗伤害引起的感染。
本发明的有益效果
1、本发明催芽方式简洁快速,脱毒方式简捷有效,诱导率高达98.1%。
2、再生时间短:本发明诱导过程同步增殖,生根过程同步壮苗,驯化移栽后,约在65~70天内获得大量的木薯种苗。
3、变异低:利用丛生芽途径快繁,有效克服了愈伤组织途径变异率高的问题。
4、节约成本:本发明在保证较高丛生芽诱导率和繁殖系数的基础上,合理调节基本培养基和蔗糖等浓度,缩短了培养时间,大大降低生产成本。
附图说明
图1为组织培养快速繁殖木薯种苗全过程;
其中(A).诱导培养14天后的丛生芽,诱导过程同步增殖;(B).生根培养40天的试管苗,生根过程同步壮苗;(C).组培室大量培育的试管苗;(D).移栽成活的植株;以上标尺均是1.0厘米。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可由商业途径得到。
下述实施例中的木薯可从市场购得。
实施例1
一种组织培养快速繁殖木薯种苗的方法
一、外植体的选择和消毒
选择健壮无病害、生长旺盛并带有幼嫩腋芽的植株,剪取距茎顶端约10厘米幼嫩茎段,切除叶柄基部叶片。使用饱和洗衣粉溶液进行表面消毒,并利用两步法脱毒,剪取约1厘米的茎段,最后置于无菌滤纸上吸干表面水分。
二、木薯的丛生芽诱导培养
为获得最佳丛生芽诱导培养基,以MS培养基为基本培养基,采用3因素3水平设计正交实验(表1),14天后,统计丛生芽诱导率;根据设计,在每种培养基中接种30个茎段,每种10瓶,每瓶3个。培养条件:温度(23-27)℃,光周期12h/d,光照强度6000lx。
丛生芽诱导率(%)=(诱导出丛生芽的外植体数÷接种的外植体数)×100%
表1木薯丛生芽诱导培养基优化正交实验结果
结果表明:丛生芽诱导效果最佳培养基是以MS培养基为基本培养基,添加20g·L-1蔗糖,7g·L-1琼脂,0.5mg·L-16-苄基氨基嘌呤,2μmol·L-1硫酸铜,pH5.8~6.0。诱导过程同步增殖,诱导率是98.1%,增殖倍数为4.04。
三、木薯的生根培养
选用MS培养基为基本培养基,选用L16(45)设计进行4因素4水平的正交实验(表2)。每种培养基中转接40个上述不定芽,培养40天,观察、统计每组的生根情况。培养条件:温度(23-27)℃,光周期12h/d,光照强度6000lx。
表2木薯丛生芽生根的正交实验结果
结果表明:最佳生根培养基是以MS培养基为基本培养基,添加40g·L-1蔗糖,7g·L-1琼脂,1.6g·L-1活性炭,0.7mg·L-1萘乙酸,0.8mg·L-16-苄基氨基嘌呤,2.9mg·L-1烯效唑。生根过程同步壮苗,培养的完整植株叶片浓绿,茎部健壮,根率发达,生根率为94.87%。
三、驯化移栽
取出试管苗,用自来水洗净根部残留的培养基,再用0.1%KMnO4浸泡30秒,最后用自来水清洗,将处理好的试管苗移栽至土壤∶珍珠岩(1∶3)的混合基质中培养14天,3-4天浇水1次,保持基质湿润。移栽成活率达75%以上,试管苗越大、越粗壮,越容易成活;移栽到大田中,成活率可达90%以上。
对比例1
以木薯茎段为外植体,丛生芽诱导最佳培养基是以MS培养基为基本培养基,添加30g·L-1蔗糖,7g·L-1琼脂,1.0mg·L-16-苄基氨基嘌呤,增殖倍数是3.1。本研究丛生芽诱导效果最佳培养基是以MS培养基为基本培养基,添加20g·L-1蔗糖,7g·L-1琼脂,0.5mg·L-16-苄基氨基嘌呤,2μmol·L-1硫酸铜。本研究诱导过程同步增殖,增殖倍数为4.04,比以往提高了30.3%。本研究在培养基中添加2μmol·L-1硫酸铜,这有效促进了茎段节点愈伤组织的形成,促进丛生芽的生长。
对比例2
用MS培养基对木薯进行生根培养,生根率是93.8%,但生成的组培苗长势不佳、根系纤弱,成活率仅为30%。本研究的生根培养基是以MS培养基为基本培养基,添加40g·L-1蔗糖,7g·L-1琼脂,1.6g·L-1活性炭,0.7mg·L-1萘乙酸,0.8mg·L-16-苄基氨基嘌呤,2.9mg·L-1烯效唑。生根过程同步壮苗,培养的完整植株叶片浓绿,茎部健壮,根率发达,生根率为94.87%,成活率达75%以上。
Claims (4)
1.一种组织培养快速繁殖木薯种苗的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)外植体选择:选择健壮无病害、生长旺盛的植株,剪取距茎顶端10厘米幼嫩茎段,从叶柄基部切除叶片,剪取带有腋芽的茎段,即为外植体;
(2)外植体消毒:将步骤(1)中的外植体用自来水冲洗10分钟,清除尘土和碎屑,再完全浸没于饱和洗衣粉溶液10分钟,流水冲洗30-60分钟,将洗好的茎段放入广口瓶,在无菌工作台上采用两步法脱毒,75%酒精消毒20秒,无菌水冲洗2-3次,用0.1%升汞消毒6分钟,无菌水冲洗3-4次,置于无菌滤纸上吸干表面水分,最后将外植体剪成1厘米茎段;
(3)丛生芽诱导培养:将步骤(2)中的外植体接种到丛生芽诱导培养基中,培养14天后获得木薯丛生芽,再切取再生芽茎段0.5-1厘米接种到丛生芽诱导培养基中,进行诱导分化、增殖培养,即诱导过程同步增殖;当扩繁系数达到10倍时,进行生根培养,控制温度25±2℃,光周期12h/d,光照强度6000lx;丛生芽诱导培养基是以MS培养基为基本培养基,添加20g·L-1蔗糖,7g·L-1琼脂,0.5mg·L-1 6-苄基氨基嘌呤,2μmol·L-1 硫酸铜,pH5.8~6.0;
(4)生根培养:将步骤(3)中获得的不定芽接种到生根培养基中,培养30天后,即可获得大量木薯试管苗,温度23-27℃,光周期12h/d,光照强度6000lx;生根培养基是以MS培养基为基本培养基,添加30g·L-1蔗糖,7g·L-1琼脂,0.1mg·L-1萘乙酸,0.6mg·L-1 6-苄基氨基嘌呤,2.5μmol·L-1 硫酸铜,pH5.8~6.0;
(5)幼苗驯化:取出试管苗,用自来水洗净根部残留的培养基,再用0 .1%KMnO4浸泡30秒,最后用自来水清洗,将处理好的试管苗移栽至营养钵基质中驯化,将成活的幼苗移栽到大田中,即为木薯种苗。
2.根据权利要求1所述的一种组织培养快速繁殖木薯种苗的方法,其特征在于,步骤(1)所述述木薯品种为华南205。
3.根据权利要求1所述的一种组织培养快速繁殖木薯种苗的方法,其特征在于,步骤(2)所述1厘米茎段上至少含有一个叶片。
4.根据权利要求1所述的一种组织培养快速繁殖木薯种苗的方法,其特征在于,所述营养钵基质为土壤和珍珠岩,体积比是1:3;驯化14天,将成活的幼苗移栽到大田中,即为木薯种苗。
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