CN113207686B - 一种基于种皮愈伤组织分化的香椿再生技术 - Google Patents

一种基于种皮愈伤组织分化的香椿再生技术 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于种皮愈伤组织分化的香椿再生技术,其特征在于包括无菌种子获得、种皮愈伤组织的诱导、种皮愈伤组织的生长、种皮愈伤组织的分化、幼苗生根诱导培养、炼苗、移栽等步骤,本发明通过采用创造性的工艺步骤、技术参数等因素,能够获得97.5%以上的生根苗成活率。本发明至少具有下列有益效果:①繁殖系数高、速度快;②能实现良种规模化生产,满足大棚或温室栽培需要;③能保持原优质品系全部的遗传特性、实现该品种种质的一致性、便于推广栽培优良品种;④香椿功能基因研究和转基因分子育种提供了技术支撑。本发明具有良好的应用价值。

Description

一种基于种皮愈伤组织分化的香椿再生技术
【技术领域】
本发明涉及植物的再生技术,特别是一种基于种皮愈伤组织分化的香椿再生技术。
【背景技术】
香椿(Toona sinensis(A.Juss)Roem),楝科(Meliaceae)香椿属(Toona Roem),多年生落叶大乔木,中国特有树种,是我国传统菜用木本蔬菜,其嫩芽清香宜人,营养丰富,医膳兼用,居名特优蔬菜之首,为千家万户所珍爱。嫩芽生长过程中分泌驱虫物质,无农药污染,为名符其实的绿色食品,香椿嫩芽化学成分和营养物质丰富,其食用、营养和药用价值极高,是典型的“药食同源”木本蔬菜,国外称为“中国绿色保健蔬菜”。
由于香椿具有重要的食用、营养、药用、经济价值,我国很多地方已开始大面积栽培。香椿种子是一个高度杂合体,优质香椿种子数量有限。现有技术中,种子繁殖后代单株之间出现严重的性状分离,后代通过扦插育苗、埋根、分蘖等方法繁殖系数低、速度慢,这些繁殖方法不利于快速繁殖、推广栽培优良品种。建立无性快速繁殖技术体系,保持原优质品系全部的遗传特性,实现该品种种质的一致性,是香椿种苗研究中急需解决的技术问题。
以优质红香椿种子的种皮为研究对象,研究多种不同因素对香椿种皮愈伤组织诱导、分化的影响,建立基于香椿种皮愈伤组织的诱导、再生、生根培养和炼苗移栽等植株高效快速再生技术体系,为香椿的生物技术改良和优良品系的快速繁殖奠定基础。本技术为快繁名贵优良香椿品种,实现良种规模化生产,满足大棚或温室栽培需要,加快优质香椿品种的应用提供了强有力技术支撑。
【发明内容】
本发明的目的是克服现有技术中的上述缺陷,提供一种繁殖系数高、速度快、能保持原优质品系全部的遗传特性、实现该品种种质的一致性、便于推广栽培优良品种的基于种皮愈伤组织分化的香椿再生技术。
为实现上述目的,本发明提供的一种基于种皮愈伤组织分化的香椿再生技术,其特征在于包括如下步骤:
1)无菌种子获得:香椿种子去翅后,用清水冲洗1-2h后,浸泡于无菌水中12h,再用70%医用酒精浸泡3-5min,后用无菌水冲洗3-5次,沥干表面水分;
2)种皮愈伤组织的诱导:将步骤1)处理后的种子在诱导培养基中,在黑暗、温度24℃、空气湿度70%条件下,培养1w后,移至空气湿度70%、光照13h/黑暗11h、光照温度26℃/黑暗温度24℃、光照强度10-20μmol photons/m2/s的培养条件下,每2w继代一次,得到种皮愈伤组织,即愈伤组织Ⅰ;
3)种皮愈伤组织的生长:将步骤2)中的愈伤组织I继代至愈伤生长培养基中,在空气湿度70%、在光照13h/黑暗11h,光照温度25℃/黑暗温度23℃,光照强度30-50μmolphotons/m2/s条件下,生长形成松散愈伤组织,即愈伤组织Ⅱ;
4)种皮愈伤组织的分化:将步骤3)中的愈伤组织Ⅱ移至装有愈伤组织分化培养基的容器中,用膜封口,在光照13h/黑暗11h,光照温度27℃/黑暗温度25℃,光照强度40-60μmol photons/m2/s条件下,每隔2w继代一次,先形成不定芽,然后形成再生植株;
5)幼苗生根诱导培养:将步骤4)中的3-5cm的再生植株,清除茎基部愈伤组织,将茎基部垂直插入生根培养基中,在空气湿度70%,光照13h/黑暗11h,光照温度27℃/黑暗温度25℃,光照强度40-60μmol photons/m2/s条件下,用膜将培养容器封口培养1w后,清理再生植株茎部叶片,只留下2-3片,茎基部用刀片垂直横切后,在200mg/L IBA溶液中浸泡10-15min,沥干后,茎基部垂直插入生根培养基,同条件下培养,形成香椿幼苗;
6)炼苗:选择株高3-4cm,展开叶5-7片的香椿幼苗,培养容器在室外自然条件下放置2d后,揭开培养瓶封口膜,练苗4-5d后,移栽;
7)移栽:冲洗干净香椿幼苗根部,移栽到蛭石、泥炭、珍珠岩质量比为3:1:1混合的基质中,用遮阳网遮阴并保持空气湿度在70-80%,7-10d后去掉遮阳网,遮阳期间用40%多菌灵悬浮剂用无菌水按体积稀释800-1000倍后定期喷洒杀菌1次/周,共计2-3次;
所述MS培养基、MMS培养基均含有成分为大量元素KNO3、NH4NO3、MgSO7H2O、KH2PO4、CaCl2H2O;微量元素MnSO4H2O、ZnSO7H2O、H3BO3、KI、Na2MoO7H2O、CuSO4.5H2O、CoCl2.6H2O;铁盐Na2-EDTA、FeSO4.4H2O;有机物甘氨酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫铵素、烟酸、肌醇;碳源蔗糖;
所述MS培养基中上述成分浓度(mg/L)依次为1900、1650、370、170、440、22.3、8.6、6.2、0.83、0.25、0.025、0.025、74.6、55.6、2.0、0.5、0.1、0.5、100、30000;
所述MMS培养基中上述成分浓度(mg/L)依次为2100、1430、270、150、320、12、5.7、4.2、0.5、0.2、0.025、0.025、37.3、27.8、1.5、0.5、0.15、0.6、80、30000;
所述1/2MS培养基中,所述成分大量元素浓度均为MS培养基的1/2,其余成分浓度与MS培养基相同;
所述3/4MS培养基中,所述成分大量元素浓度均为MS培养基的3/4,其余成分浓度与MS培养基相同;
所述诱导培养基为MMS+0.01mg/LTDZ+0.3mg/L IAA+0.01mg/L 2,4-D+质量百分比3%蔗糖+质量百分比0.8%琼脂;所述愈伤生长培养基为MMS+0.5mg/L6-BA+0.1mg/L 2,4-D+质量百分比3%蔗糖+质量百分比0.8%琼脂;所述愈伤组织分化培养基为3/4MS+1.5mg/L6-BA+0.001mg/L TDZ+0.1mg/L IAA+质量百分比3%蔗糖+质量百分比0.8%琼脂;所述生根培养基为1/2MS+质量百分比3%蔗糖+质量百分比0.8%琼脂。
本发明至少具备以下有益效果:①繁殖系数高、速度快;②能实现良种规模化生产,满足大棚或温室栽培需要;③能保持原优质品系全部的遗传特性、实现该品种种质的一致性、便于推广栽培优良品种;④香椿功能基因研究和转基因分子育种提供了技术支撑。
【附图说明】
图1为种皮愈伤组织(箭头所指)图;
图2为在愈伤组织生长培养基中培养2周的种皮愈伤组织图;
图3为愈伤组织在分化培养基中培养2周后形成的不定芽图;
图4为愈伤组织分化培养基培养3-4周后形成的叶片图;
图5为再生植株图。
【具体实施方式】
为了更好地理解本发明,下面结合附图,详细描述实施例。应理解,本实施例仅用于说明本发明,而不能限制本发明的范围。
除特别说明外,本实施例所采用的技术手段为本领域的常规技术手段。
实施例1本发明方法实施例之一
1)无菌种子获得
香椿种子去翅后,用清水冲洗1h后,浸泡于无菌水中12h,再用70%医用酒精浸泡3min,后用无菌水冲洗5次,在无菌滤纸上沥干种子表面水分,备用;
2)种皮愈伤组织的诱导
上述步骤中的种子在诱导培养基(基本培养基MMS+0.01mg/LTDZ+0.3mg/L IAA+0.01mg/L 2,4-D+质量百分比的3%蔗糖+质量百分比0.8%琼脂)中,在黑暗、温度24℃、空气湿度70%条件下,培养1w后,移至空气湿度70%、光照13h/黑暗11h、光照温度26℃/黑暗温度24℃、光照强度10-20μmol photons/m2/s的培养条件下,每2w继代一次。2w后,种皮愈伤组织开始形成,愈伤组织呈现白色为主捎带少许绿色、松散状(图1,图中箭头所示),愈伤组织诱导率100%。在本条件下诱导后培养了4w的愈伤组织备用;
3)种皮愈伤组织的生长
将上述步骤中的愈伤组织继代至愈伤生长培养基(基本培养基MMS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L 2,4-D+质量百分比3%的蔗糖+质量百分比0.8%的琼脂)中,在空气湿度70%、在光照13h/黑暗11h,光照温度25℃/黑暗温度23℃,光照强度30-40μmol photons/m2/s条件下,生长1-2w形成松散愈伤组织(大约20-30%的松散愈伤组织呈现绿色、70-80%的松散愈伤组织呈现淡黄色)(图2),备用;
4)种皮愈伤组织的分化
将上述步骤中的松散愈伤组织移至含有愈伤组织分化培养基(3/4MS+1.5mg/L 6-BA+0.001mg/L TDZ+0.1mg/L IAA+质量百分比3%的蔗糖+质量百分比0.8%的琼脂)的培养瓶中,用膜封口,在光照13h/黑暗11h,光照温度27℃/黑暗温度25℃,光照强度40-50μmolphotons/m2/s条件下,每隔2w继代一次;愈伤组织在分化培养基中培养2-3w后,不定芽开始分化形成(图3),一个愈伤组织一般可形成4-6个丛芽(图4),第6-7周,茎逐步伸长生长,再生茎生长出复叶(图5);愈伤组织分化率95%以上。生长到3-5cm的再生植株备用于生根诱导(图5);
5)幼苗生根诱导培养
将上所述条件下3-5cm的再生植株,清除茎基部愈伤组织,将茎基部垂直插入生根培养基(1/2MS+质量百分比3%的蔗糖+质量百分比0.8%的琼脂)中,在空气湿度70%,光照13h/黑暗11h,光照温度27℃/黑暗温度25℃,光照强度40-50μmol photons/m2/s条件下,用膜将培养容器封口培养1w后,清理再生植株茎部叶片,只留下2-3片,茎基部用刀片垂直横切后,在200mg/L IBA溶液中浸泡10min,沥干后,茎基部垂直插入生根培养基,,在空气湿度70%,光照13h/黑暗11h,光照温度27℃/黑暗温度25℃,光照强度40-50μmol photons/m2/s条件下,培养1-2w后,茎基部开始形成不定根,2-3w后,茎基部形成不定根3-7条;再生植株生根率100%;
6)炼苗
待香椿幼苗在生根培养基中生长3w后,选择株高3-4cm,展开叶5-7片的植株,培养瓶在室外自然条件下放置2d后,揭开培养瓶封口膜,练苗4d后,移栽;
7)移栽
清除香椿幼苗根部周围琼脂后,用自来水冲洗干净再生植株根部的培养基,移栽到蛭石、泥炭、珍珠岩质量比为3:1:1混合的基质中,用遮阳网遮阴并保持空气湿度在80%,7d后去掉遮阳网,遮阳期间用40%多菌灵悬浮剂用无菌水按体积稀释800倍后定期喷洒杀菌1次/周,共计3次,生根苗成活率达97.7%。
实施例2本发明方法实施例之二
本实施例与实施例1操作步骤一样,区别仅在于各参数有所不同,具体如下:
1)无菌种子获得
香椿种子去翅后,用清水冲洗2h后,浸泡于无菌水中12h,再用70%医用酒精浸泡5min,后用无菌水冲洗3次,在无菌滤纸上沥干种子表面水分,备用;
2)种皮愈伤组织的诱导
上述步骤中的种子在诱导培养基(同实施例1)中,在黑暗、温度24℃、空气湿度70%条件下,培养1w后,移至空气湿度70%、光照13h/黑暗11h、光照温度26℃/黑暗温度24℃、光照强度10-20μmol photons/m2/s的培养条件下,每2w继代一次。2w后,种皮愈伤组织开始形成,愈伤组织呈现白色为主捎带少许绿色、松散状,愈伤组织诱导率100%;在本条件下诱导后培养了4w的愈伤组织备用;
3)种皮愈伤组织的生长
将上述步骤中的愈伤组织继代至愈伤生长培养基(同实施例1)中,在空气湿度70%、在光照13h/黑暗11h,光照温度25℃/黑暗温度23℃,光照强度40-50μmol photons/m2/s条件下,生长1-2w形成松散愈伤组织(大约20-30%的松散愈伤组织呈现绿色、70-80%的松散愈伤组织呈现淡黄色),备用;
4)种皮愈伤组织的分化
将上述步骤中的松散愈伤组织移至含有愈伤组织分化培养基(同实施例1)的培养瓶中,用膜封口,在光照13h/黑暗11h,光照温度27℃/黑暗温度25℃,光照强度50-60μmolphotons/m2/s条件下,每隔2w继代一次。愈伤组织在分化培养基中培养2-3w后,不定芽开始分化形成,一个愈伤组织一般可形成4-6个丛芽,第6-7周,茎逐步伸长生长,再生茎生长出复叶;愈伤组织分化率95%以上。生长到3-5cm的再生植株备用于生根诱导;
5)幼苗生根诱导培养
将上所述条件下3-5cm的再生植株,清除茎基部愈伤组织,将茎基部垂直插入生根培养基(同实施例1)中,在空气湿度70%,光照13h/黑暗11h,光照温度27℃/黑暗温度25℃,光照强度40-50μmol photons/m2/s条件下,用膜将培养容器封口培养1w后,清理再生植株茎部叶片,只留下2-3片,茎基部用刀片垂直横切后,在200mg/L IBA溶液中浸泡15min,沥干后,茎基部垂直插入生根培养基,,在空气湿度70%,光照13h/黑暗11h,光照温度27℃/黑暗温度25℃,光照强度40-50μmol photons/m2/s条件下,培养1-2w后,茎基部开始形成不定根,2-3w后,茎基部形成不定根3-7条;再生植株生根率100%;
6)炼苗
待香椿幼苗在生根培养基中生长4w后,选择株高3-4cm,展开叶5-7片的植株,培养瓶在室外自然条件下放置2d后,揭开培养瓶封口膜,练苗4d后,移栽;
7)移栽
清除香椿幼苗根部周围琼脂后,用自来水冲洗干净再生植株根部的培养基,移栽到蛭石、泥炭、珍珠岩质量比为3:1:1混合的基质中,用遮阳网遮阴并保持空气湿度在80%,7-10d后去掉遮阳网,遮阳期间用40%多菌灵悬浮剂用无菌水按体积稀释1000倍后定期喷洒杀菌1次/周,共计2次,生根苗成活率达97.5%。
实施例3本发明方法实施例之三
本实施例与实施例1或2操作步骤一样,区别仅在于各参数有所不同,具体如下:
1)无菌种子获得
香椿种子去翅后,用清水冲洗1.5h后,浸泡于无菌水中12h,再用70%医用酒精浸泡4min,后用无菌水冲洗3次,在无菌滤纸上沥干种子表面水分,备用;
2)种皮愈伤组织的诱导
上述步骤中的种子在诱导培养基(同实施例1)中,在黑暗、温度24℃、空气湿度70%条件下,培养1w后,移至空气湿度70%、光照13h/黑暗11h、光照温度26℃/黑暗温度24℃、光照强度10-20μmol photons/m2/s的培养条件下,每2w继代一次。2w后,种皮愈伤组织开始形成,愈伤组织呈现白色为主捎带少许绿色、松散状,愈伤组织诱导率100%;在本条件下诱导后培养了4w的愈伤组织备用;
3)种皮愈伤组织的生长
将上述步骤中的愈伤组织继代至愈伤生长培养基(同实施例1)中,在空气湿度70%、在光照13h/黑暗11h,光照温度25℃/黑暗温度23℃,光照强度40-50μmol photons/m2/s条件下,生长1-2w形成松散愈伤组织(大约20-30%的松散愈伤组织呈现绿色、70-80%的松散愈伤组织呈现淡黄色),备用;
4)种皮愈伤组织的分化
将上述步骤中的松散愈伤组织移至含有愈伤组织分化培养基(同实施例1)的培养瓶中,用膜封口,在光照13h/黑暗11h,光照温度27℃/黑暗温度25℃,光照强度50-60μmolphotons/m2/s条件下,每隔2w继代一次。愈伤组织在分化培养基中培养2-3w后,不定芽开始分化形成,一个愈伤组织一般可形成4-6个丛芽,第6-7周,茎逐步伸长生长,再生茎生长出复叶;愈伤组织分化率95%以上。生长到3-5cm的再生植株备用于生根诱导;
5)幼苗生根诱导培养
将上所述条件下3-5cm的再生植株,清除茎基部愈伤组织,将茎基部垂直插入生根培养基(同实施例1)中,在空气湿度70%,光照13h/黑暗11h,光照温度27℃/黑暗温度25℃,光照强度50-60μmol photons/m2/s条件下,用膜将培养容器封口培养1w后,清理再生植株茎部叶片,只留下2-3片,茎基部用刀片垂直横切后,在200mg/L IBA溶液中浸泡12min,沥干后,茎基部垂直插入生根培养基,,在空气湿度70%,光照13h/黑暗11h,光照温度27℃/黑暗温度25℃,光照强度50-60μmol photons/m2/s条件下,培养1-2w后,茎基部开始形成不定根,2-3w后,茎基部形成不定根3-7条;再生植株生根率100%;
6)炼苗
待香椿幼苗在生根培养基中生长3w后,选择株高3-4cm,展开叶5-7片的植株,培养瓶在室外自然条件下放置2d后,揭开培养瓶封口膜,练苗4d后,移栽;
7)移栽
清除香椿幼苗根部周围琼脂后,用自来水冲洗干净再生植株根部的培养基,移栽到蛭石、泥炭、珍珠岩质量比为3:1:1混合的基质中,用遮阳网遮阴并保持空气湿度在75%,8d后去掉遮阳网,遮阳期间用40%多菌灵悬浮剂用无菌水按体积稀释900倍后定期喷洒杀菌1次/周,共计3次,生根苗成活率达97.6%。
实施例4对比实施例之一
1)无菌苗的获得
先用实施例1中步骤1)的方法获得无菌种子,后将种子置于含质量百分比0.8%琼脂的MS培养基中,在空气湿度70%,光照13h/黑暗11h,光照温度26℃/黑暗温度24℃,光照强度40-60μmol photons/m2/s的培养条件下,连续培养3w,香椿种子萌发生长出无菌幼苗;
2)外植体的获得
将上述步骤中获得的香椿无菌幼苗的根茎叶分别作为外植体。将叶片切成1.5毫米见方的小块、将茎和根切成1.5毫米长,分别作为外植体,置于诱导培养基中;
3)愈伤组织的诱导
上述步骤中的外植体按照实施例1步骤2)的条件。第4w外植体愈伤组织开始形成,呈现绿色、质地坚硬,2w后,将愈伤组织移至愈伤组织生长培养基中继代培养;
4)愈伤组织的生长
将上述步骤中的愈伤组织按照实施例1步骤3)的条件生长1-2w。生长2w后,愈伤组织褐化现象严重;
5)愈伤组织分化培养
将上述步中生长了1-2w的愈伤组织按照实施例1步骤4)的条件继代。3w后,愈伤组织与培养基接触部分开始褐化,7-8w后基部愈伤组织80-90%褐化,连续6代以上,不能分化出不定芽。
本实施例说明,以香椿种子繁殖的无菌根茎叶为为外植体,利用本发明的愈伤组织诱导条件、愈伤组织生长条件、愈伤组织分化条件,不能诱导愈伤组织分化,即不能诱导植株的再生。
实施例5对比实施例之二
1)无菌外植体的获得
挑选自然状态下生长的健壮香椿幼叶,用清水冲洗30min后,1%次氯酸钠处理1.5min,后用70%酒精处理3min,再用无菌水清洗4~5次后,切成1.5毫米见方的小块,作为外植体,置于诱导培养基中;
2)愈伤组织的诱导
上述步骤中的外植体按照实施例1步骤2)的条件处理。2-3w外植体愈伤组织开始形成,呈现绿色、质地坚硬,4w后,将愈伤组织移至愈伤组织生长培养上继代培养;
3)愈伤组织的生长
将上述步骤中的愈伤组织按照实施例1步骤3)的条件,生长2w后,愈伤组织褐化现象严重;
4)愈伤组织分化培养
将上述条件下生长了2-4w的愈伤组织按照实施例1步骤4)的条件继代,1w后,愈伤组织与培养基接触部分开始褐化,3w后基部愈伤组织全部褐化,连续继代6代以上,愈伤组织不能分化出不定芽。
本实施例说明,以自然生长状态的香椿茎叶消毒后作为外植体,利用本发明的愈伤组织诱导条件、愈伤组织生长条件、愈伤组织分化条件,不能诱导愈伤组织分化,即不能诱导植株的再生。
实施例6对比实施例之三
1)无菌种子的获得
将香椿种子用清水冲洗1-2h后,浸泡于无菌水中12h,再用70%医用酒精浸泡3-5min,后用无菌水冲洗3-5次,在无菌滤纸上沥干种子表面水分;
2)种皮愈伤组织的诱导
每皿接种10粒种子,每次处理4皿,重复3次,按照现有技术1(许丽琼,涂炳坤.香椿叶片组织培养和快繁技术的研究[J].湖北农业科学,2007,46(1):24-26)中记载的方法,将种子在MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L KT+0.5mg/L NAA+质量百分比的3%蔗糖+质量百分比0.8%中,在黑暗23℃、空气湿度70%条件下,培养1w后,移至空气湿度70%,光照13h/黑暗11h,光照温度26℃/黑暗温度24℃,光照强度10-20μmol photons/m2/s的培养条件下,每隔两周继代一次。连续继代3-4代,种皮部分无法形成愈伤组织。
本实施例说明,按照上述现有技术1中记载的愈伤组织诱导条件,不能诱导种皮愈伤组织的形成。
实施例7对比实施例之四
1)无菌种子的获得
将香椿种子用清水冲洗1-2h后,浸泡于无菌水中12h,再用70%医用酒精浸泡3-5min,后用无菌水冲洗3-5次,在无菌滤纸上沥干种子表面水分;
2)种皮愈伤组织的诱导
每皿接种10粒种子,每次处理4皿,重复3次,30d后统计愈伤组织诱导率。按照现有技术2(王春林,杨群英,薛爱红,王远程.香椿组织培养与快速繁殖的研究[J].园艺学报,1994,21(4):406-407)中记载的方法,将种子在B5+2.5mg/L 6-BA+2.5mg/L NAA+质量百分比的3%蔗糖+质量百分比0.8%中,在黑暗23℃、空气湿度70%条件下,培养1w后,移至空气湿度70%,光照13h/黑暗11h,光照温度26℃/黑暗温度24℃,光照强度10-20μmol photons/m2/s的培养条件下,每隔两周继代一次。每隔两周继代一次。连续继代3-4代,种皮部分无法形成愈伤组织。
本实施例说明,按照上述现有技术2中记载的愈伤组织诱导条件,不能诱导种皮愈伤组织的形成。
实施例8对比实施例之五
1)无菌种子的获得
将香椿种子用清水冲洗1-2h后,浸泡于无菌水中12h,再用70%医用酒精浸泡3-5min,后用无菌水冲洗3-5次,在无菌滤纸上沥干种子表面水分;
2)种皮愈伤组织的诱导
每皿接种10粒种子,每次处理4皿,重复3次,30d后统计愈伤组织诱导率。按照现有技术3(周玉玲,余慧琳,刘广卿,李艳萍,张福娟,姜曙光,孙凤岭.红香椿组织培养和快速繁殖研究[J].中国农学通报,2009,25(10):116-119)中记载的方法,将种子在MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L ZT+0.1mg/LNAA+0.1mg/LIBA+质量百分比的3%蔗糖+质量百分比0.8%的琼脂中,在黑暗23℃、空气湿度70%条件下,培养1w后,移至空气湿度70%,光照13h/黑暗11h,光照温度26℃/黑暗温度24℃,光照强度10-20μmol photons/m2/s的培养条件下,每隔两周继代一次。每隔2w继代一次。连续继代3-4代,种皮部分无法形成愈伤组织。
本实施例说明,按照上述现有技术3中记载的愈伤组织诱导条件,不能诱导种皮愈伤组织的形成。
实施例9对比实施例之六
1)无菌种子获得
将香椿种子清水冲洗1-2h后,浸泡于无菌水中12h,再用70%医用酒精浸泡3-5min,后用无菌水冲洗3-5次,在无菌滤纸上沥干种子表面水分;
2)种皮愈伤组织的诱导
每皿接种10粒种子,每次处理4皿,重复3次,按照本申请人专利(ZL201610947913.3)中记载的方法,将种子在基本培养基MMS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/L 2,4-D+0.1mg/L TDZ+质量百分比的3%蔗糖+质量百分比0.8%的琼脂中,在黑暗23℃、空气湿度70%条件下,培养1w后,移至空气湿度70%,光照13h/黑暗11h,光照温度26℃/黑暗温度24℃,光照强度10-20μmol photons/m2/s的培养条件下,每隔两周继代一次。每隔两周继代一次。连续继代3-4代,种子种皮部分无法形成愈伤组织。
本实施例说明,以本申请人上述专利(ZL201610947913.3)中的愈伤组织诱导条件,不能诱导种皮愈伤组织的形成。
在以上实施例中,所述的培养基成分如下:
Figure BDA0003032882930000131

Claims (1)

1.一种基于种皮愈伤组织分化的香椿再生方法,其特征在于包括如下步骤:
1)无菌种子获得:香椿种子去翅后,用清水冲洗1-2h后,浸泡于无菌水中12h,再用70%医用酒精浸泡3-5min,后用无菌水冲洗3-5次,沥干表面水分;
2)种皮愈伤组织的诱导:将步骤1)处理后的种子在诱导培养基中,在黑暗、温度24℃、空气湿度70%条件下,培养1w后,移至空气湿度70%、光照13h/黑暗11h、光照温度26℃/黑暗温度24℃、光照强度10-20μmol photons/m2/s的培养条件下,每2w继代一次,得到种皮愈伤组织,即愈伤组织Ⅰ;
3)种皮愈伤组织的生长:将步骤2)中的愈伤组织I继代至愈伤生长培养基中,在空气湿度70%、在光照13h/黑暗11h,光照温度25℃/黑暗温度23℃,光照强度30-50μmol photons/m2/s条件下,生长形成松散愈伤组织,即愈伤组织Ⅱ;
4)种皮愈伤组织的分化:将步骤3)中的愈伤组织Ⅱ移至装有愈伤组织分化培养基的容器中,用膜封口,在光照13h/黑暗11h,光照温度27℃/黑暗温度25℃,光照强度40-60μmolphotons/m2/s条件下,每隔2w继代一次,先形成不定芽,然后形成再生植株;
5)幼苗生根诱导培养:将步骤4)中的3-5cm的再生植株,清除茎基部愈伤组织,将茎基部垂直插入生根培养基中,在空气湿度70%,光照13h/黑暗11h,光照温度27℃/黑暗温度25℃,光照强度40-60μmol photons/m2/s条件下,用膜将培养容器封口培养1w后,清理再生植株茎部叶片,只留下2-3片,茎基部用刀片垂直横切后,在200mg/L IBA溶液中浸泡10-15min,沥干后,茎基部垂直插入生根培养基,同条件下培养,形成香椿幼苗;
6)炼苗:选择株高3-4cm,展开叶5-7片的香椿幼苗,培养容器在室外自然条件下放置2d后,揭开培养瓶封口膜,练苗4-5d后,移栽;
7)移栽:冲洗干净香椿幼苗根部,移栽到蛭石、泥炭、珍珠岩质量比为3:1:1混合的基质中,用遮阳网遮阴并保持空气湿度在70-80%,7-10d后去掉遮阳网,遮阳期间用40%多菌灵悬浮剂用无菌水按体积稀释800-1000倍后定期喷洒杀菌1次/周,共计2-3次;
所述诱导培养基为MMS+0.01mg/LTDZ+0.3mg/L IAA+0.01mg/L 2,4-D+质量百分比3%蔗糖+质量百分比0.8%琼脂;所述愈伤生长培养基为MMS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L 2,4-D+质量百分比3%蔗糖+质量百分比0.8%琼脂;所述愈伤组织分化培养基为3/4MS+1.5mg/L6-BA+0.001mg/L TDZ+0.1mg/L IAA+质量百分比3%蔗糖+质量百分比0.8%琼脂;所述生根培养基为1/2MS+质量百分比3%蔗糖+质量百分比0.8%琼脂;
所述MS培养基、MMS培养基均含有成分为大量元素KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CaCl2·2H2O;微量元素MnSO4·4H2O、ZnSO7H2O、H3BO3、KI、Na2MoO4·7H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O;铁盐Na2-EDTA、FeSO4·4H2O;有机物甘氨酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫铵素、烟酸、肌醇;碳源蔗糖;
所述MS培养基中上述成分浓度以mg/L计依次为1900、1650、370、170、440、22.3、8.6、6.2、0.83、0.25、0.025、0.025、74.6、55.6、2.0、0.5、0.1、0.5、100、30000;
所述MMS培养基中上述成分浓度以mg/L计依次为2100、1430、270、150、320、12、5.7、4.2、0.5、0.2、0.025、0.025、37.3、27.8、1.5、0.5、0.15、0.6、80、30000;
所述1/2MS培养基中,所述成分大量元素浓度均为MS培养基的1/2,其余成分浓度与MS培养基相同;
所述3/4MS培养基中,所述成分大量元素浓度均为MS培养基的3/4,其余成分浓度与MS培养基相同。
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