CN110432149A - 一种兼用于胡麻花药和子房愈伤组织诱导的培养基和培养方法 - Google Patents

一种兼用于胡麻花药和子房愈伤组织诱导的培养基和培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种兼用于胡麻花药和子房愈伤组织诱导的培养基，本发明还提供一种兼用于胡麻花药和子房愈伤组织诱导的培养方法，包括以下步骤：(1)配制上述的愈伤组织诱导培养基并灭菌；(2)种植胡麻杂交F1或F2代材料，采集花蕾并将花蕾进行预处理；(3)接种；(4)愈伤组织诱导培养。本发明所采用的胡麻愈伤组织诱导培养基配方和培养方法，可兼用于胡麻花药和未受精子房愈伤组织的诱导，且愈伤组织诱导率不低于以往单独采用花药培养或未受精培养所获得的结果。因此本发明能够显著提高胡麻单倍体诱导效率、降低成本，有助于将单倍体诱导技术规模化应用于胡麻种质资源创制和育种中。

Description

一种兼用于胡麻花药和子房愈伤组织诱导的培养基和培养 方法
技术领域
本发明属于组织培养技术领域，具体涉及一种兼用于胡麻花药和子房愈伤组织诱导的培养基和培养方法。
背景技术
单倍体是指体细胞染色体组数等于本物种配子染色体组数的个体。单倍体可通过雄核发育(花药培养和小孢子培养)、雌核发育途径(未受精卵培养和未受精子房培养等)、种内或种间杂交产生。单倍体经染色体加倍后可立刻形成稳定的纯系材料，而不需要如常规杂交育种后代一样经过多代的分离后才能稳定，因此单倍体育种具有缩短育种周期并提高育种效率等优点，目前已成为与分子育种和基因工程并列的三大现代生物技术育种技术之一。迄今为止，胡麻单倍体的诱导主要利用花药培养技术，仅有少数采用未成熟受精培养技术，且往往在进行胡麻单倍体诱导时将两者分开进行。
由于愈伤组织诱导培养基和培养方法是花药培养中最为关键的因素，直接影响后续愈伤组织形成、分化及花药培养效率。目前尚未有兼用于胡麻花药培养和未受精子房培养的培养基和培养方法，整体而言胡麻单倍体诱导效率较低，耗费的人力和财力也较多，难以规模化应用于胡麻种质资源创制和胡麻育种中。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种兼用于胡麻花药和子房愈伤组织诱导的培养基和培养方法。本发明提供的培养基的配方组成和培养方法特别针对胡麻花药和未受精子房愈伤组织诱导的通用性和高效性，具有胡麻愈伤组织诱导率高、愈伤组织的状态好、后期分化率高等优点，对于提高胡麻单倍体诱导效率、促进单倍体诱导技术在胡麻种质资源创制和胡麻育种中的应用具有重要意义。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
本发明提供一种兼用于胡麻花药和子房愈伤组织诱导的培养基，所述培养基的配方为：KNO3 2700-2850mg/L，NH4SO4 400-500mg/L，CaCl2·2H2O 150-180mg/L，MgSO4·7H2O160-200mg/L，KH2PO4 380-420mg/L，FeSO4·7H2O 20-30mg/L，MnSO4·4H2O 3.5-5.0mg/L，ZnSO4·7H2O 2.5-3.5mg/L，H2BO3 1-1.5mg/L，KI 1-2mg/L，甘氨酸1.5-2.5mg/L，烟酸0.8-1.2mg/L，盐酸硫胺素1-2mg/L，盐酸吡哆醇1-2mg/L，还原型谷胱甘肽20-30mg/L，谷氨酰胺0.8-1.0g/L，肌醇0.08-0.10g/L，PAA 8.0-10.0mg/L，BAP 0.8-1mg/L，NAA 0.8-1mg/L，蔗糖25-30g/L，麦芽糖25-30g/L，琼脂5.5-6.5g/L，溶剂为蒸馏水。
作为优选，所述培养基的配方为：KNO3 2800mg/L，NH4SO4 450mg/L，CaCl2·2H2O165mg/L，MgSO4·7H2O 180mg/L，KH2PO4 400mg/L，FeSO4·7H2O 25mg/L，MnSO4·4H2O4.25mg/L，ZnSO4·7H2O 3.0mg/L，H2BO3 1.25mg/L，KI 1.5mg/L，甘氨酸2.0mg/L，烟酸1.0mg/L，盐酸硫胺素1.5mg/L，盐酸吡哆醇1.5mg/L，还原型谷胱甘肽25mg/L，谷氨酰胺0.9g/L，肌醇0.09g/L，PAA 9.0mg/L，BAP 0.9mg/L，NAA 0.9mg/L，蔗糖27.5g/L，麦芽糖27.5g/L，琼脂6.0g/L，溶剂为蒸馏水。
本发明还提供一种兼用于胡麻花药和子房愈伤组织诱导的培养方法，包括以下步骤：
(1)配制上述的愈伤组织诱导培养基并灭菌；
(2)种植胡麻杂交F1或F2代材料，采集花蕾并将花蕾进行预处理；
(3)接种；
(4)愈伤组织诱导培养。
作为优选，步骤(1)和步骤(2)的顺序互调。
作为优选，步骤(2)中，所述将花蕾进行预处理的具体方法为：将采来的胡麻花蕾放置于冰箱中预处理3-5天，冰箱温度保持在2-4℃；再将花蕾置于30-33℃的培养箱中预处理1天，之后进行接种。
作为优选，步骤(3)中，所述接种的具体方法为：在无菌条件下，将预处理后的胡麻花蕾先用体积比为75％的酒精浸泡消毒，再置于3-5％的次氯酸钠溶液中消毒；然后从胡麻花蕾中取出花药和未受精子房，接种到步骤(1)所述的愈伤组织诱导培养基。
作为优选，所述用体积比为75％的酒精浸泡消毒的时间为30-40秒；所述用3-5％的次氯酸钠溶液消毒的时间为5-8分钟。
作为优选，步骤(4)中，所述愈伤组织诱导培养的具体方法为：将接种好的培养容器置于31-33℃的培养箱或培养室中，在黑暗条件下培养5-7天；之后将温度调至23-25℃在黑暗条件下继续培养，待愈伤组织长至2-3mm时转接至愈伤组织分化培养基上进行分化培养。
作为优选，步骤(4)中，所述愈伤组织诱导培养的具体方法为：将接种好的培养瓶置于31℃的培养箱或培养室中，在黑暗条件下培养6天，之后将温度调至24℃在黑暗条件下继续培养，待愈伤组织长至2.5mm时转接至愈伤组织分化培养基上进行分化培养。
愈伤组织诱导是进行单倍体诱导培养的关键环节之一，也是整个单倍体培养能否成功的最重要的基础。本发明所采用的胡麻愈伤组织诱导培养基配方和培养方法，可兼用于胡麻花药和未受精子房愈伤组织的诱导，且愈伤组织诱导率不低于以往单独采用花药培养或未受精培养所获得的结果。因此本发明能够显著提高胡麻单倍体诱导效率、降低成本，有助于将单倍体诱导技术规模化应用于胡麻种质资源创制和育种中。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为胡麻花药诱导后形成愈伤组织。
图2为胡麻未受精子房诱导形成愈伤组织。
图3为分化形成再生苗。
图4为胡麻再生苗生根。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
一种兼用于胡麻花药和子房愈伤组织诱导的培养基和培养方法，步骤如下：
1、愈伤组织诱导培养基配方如下：
KNO3 2700-2850mg/L，NH4SO4 400-500mg/L，CaCl2·2H2O 150-180mg/L，MgSO4·7H2O 160-200mg/L，KH2PO4 380-420mg/L，FeSO4·7H2O 20-30mg/L，MnSO4·4H2O 3.5-5.0mg/L，ZnSO4·7H2O 2.5-3.5mg/L，H2BO3 1-1.5mg/L，KI 1-2mg/L，甘氨酸1.5-2.5mg/L，烟酸0.8-1.2mg/L，盐酸硫胺素1-2mg/L，盐酸吡哆醇1-2mg/L，谷胱甘肽(还原型)20-30mg/L，谷氨酰胺0.8-1.0g/L，肌醇0.08-0.10g/L，PAA(中文名为苯乙酸)8.0-10.0mg/L，BAP(中文名为6-苄基腺膘呤)0.8-1mg/L，NAA(中文名为萘乙酸)0.8-1mg/L，蔗糖25-30g/L，麦芽糖25-30g/L，琼脂5.5-6.5g/L，溶剂为蒸馏水。
2、培养方法：
(1)供试基因型的选择：
供试材料选择胡麻杂交F1或F2代材料，或者胡麻杂交种陇亚杂1号、2号和3号等。
(2)供试材料的种植和管理：
供试材料可种植于温室和田间，选择的地块应为上年未种植胡麻的田地，播种前按正常整地、施肥和浇水。按行长1m、行距0.2m、每行按80-120粒播均匀撒播。出苗后在四周搭建防虫网，及时预防白粉病和蚜虫。
(3)培养基配制和灭菌：
培养基的配制和灭菌应在采蕾前1-2天进行。培养基按照配方配制好以后，用0.8-1.0M的NaOH溶液调节pH值在5.5-6.2之间。将愈伤组织诱导培养基分装在50ml的三角瓶中，每瓶装入培养基18-22ml；装入高压灭菌锅中，在压力为0.10-0.15MPa下灭菌20-25分钟，取出冷却后备用。
培养基于接种前几日配制，其所含的各种成分经过几天的相互作用，接种后能够更为稳定。
(4)采蕾：
采蕾时应选择健壮、未感染病虫害的胡麻植株上的花蕾，在晴天上午9-10点时选择蕾长为4.5-8.5mm的花蕾，用小剪刀将花柄剪断后，将同一份材料的花蕾装入自封袋或保鲜袋中，置于冰盒中，带回实验室。在此过程中应注意避免对花蕾造成损伤。
(5)花蕾预处理：
将采来的胡麻花蕾放置于冰箱中预处理3-5天，冰箱温度保持在2-4℃。再将花蕾置于30-33℃的培养箱中预处理1天，之后进行接种。
接种前将花蕾放于30-33℃下预处理1天的好处是：高温预处理作为一种逆境，有利于抑制正常的发育途径，启动花蕾中花药和未受精子房中与促进脱分化相关信号通路和代谢物质的生成，进一步促进愈伤组织或胚的形成。
(6)接种：
在超净工作台无菌条件下，将预处理后的胡麻花蕾从自封袋或保鲜袋中取出后用体积比为75％的酒精浸泡30-40秒，用预冷的温度为2-4℃无菌水冲洗3-5遍；之后将花蕾置于3-5％的次氯酸钠溶液中5-8分钟进行消毒，消毒完成后用预冷的温度为2-4℃无菌水冲洗5遍，之后将花蕾置于高压灭菌过的铺有滤纸的培养皿中吸干花蕾表面水分。用灭菌消毒过的尖头小镊子轻轻从胡麻花蕾中取出花药和未受精子房，分开接种至愈伤组织诱导培养基上，每瓶培养基接种30-60枚花药或20-30枚未受精子房。
选择上述灭菌方法的好处是：这样可以在不损伤花药和未受精子房的情况下获得最好的灭菌效果，灭菌全面、接种后污染率很低。
(7)愈伤组织诱导培养：
将接种好的培养瓶置于31-33℃的培养箱或培养室中，在黑暗条件下培养5-7天。之后将温度调至23-25℃在黑暗条件下继续培养。一般2周以后可见淡黄色颗粒状的愈伤组织，待愈伤组织长至2-3mm时转接至愈伤组织分化培养基上进行分化培养。
选择上述诱导培养的条件的理由为：初期的高温培养有助于抑制胡麻花药和未受精子房正常的发育途径，从而转向脱分化途径，进而形成愈伤组织或胚状体。后期的暗培养的作用为：在脱分化途径启动之后，就不再需要高温了，如果持续高温的话形成的愈伤组织质量比较差，后期分化成苗就极为困难，因此此时23-25℃暗培养可保证胡麻花药和未受精子房能够形成质量较好的愈伤组织或胚状体。
愈伤组织分化培养基可以为：植物组织培养基本培养基MS+IAA 1mg/L+NAA 1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH调为5.8。
实施例1
一种兼用于胡麻花药和子房愈伤组织诱导的培养基和培养方法，步骤如下：
1、愈伤组织诱导培养基配方如下：
KNO3 2800mg/L，NH4SO4 450mg/L，CaCl2·2H2O 165mg/L，MgSO4·7H2O 180mg/L，KH2PO4 400mg/L，FeSO4·7H2O 25mg/L，MnSO4·4H2O 4.25mg/L，ZnSO4·7H2O 3.0mg/L，H2BO31.25mg/L，KI 1.5mg/L，甘氨酸2.0mg/L，烟酸1.0mg/L，盐酸硫胺素1.5mg/L，盐酸吡哆醇1.5mg/L，谷胱甘肽(还原型)25mg/L，谷氨酰胺0.9g/L，肌醇0.09g/L，PAA 9.0mg/L，BAP0.9mg/L，NAA 0.9mg/L，蔗糖27.5g/L，麦芽糖27.5g/L，琼脂6.0g/L，溶剂为蒸馏水。
2、培养方法：
(1)供试材料的选择：
供试材料选择杂交组合“陇亚10号×D418”的F1代材料，其中“陇亚10号”为胡麻审定品种，“D418”为自育胡麻品系。
(2)供试材料的种植和管理：
供试材料可种植于温室和田间，选择的地块应为上年未种植胡麻的田地，播种前按正常整地、施肥和浇水。按行长1m、行距0.2m、每行按100粒播均匀撒播。出苗后在四周搭建防虫网，及时预防白粉病和蚜虫。
(3)培养基配制和灭菌：
愈伤组织诱导培养基的配制和灭菌应在采蕾前1天进行。培养基按照配方配制好以后，用1.0M的NaOH溶液调节pH值为5.8。将愈伤组织诱导培养基分装在50ml的三角瓶中，每瓶装入培养基20ml；装入高压灭菌锅中，在压力为0.12MPa下灭菌20分钟，取出冷却后备用。
(4)采蕾：
采蕾时应选择健壮、未感染病虫害的胡麻植株上的花蕾，在晴天上午9-10点时选择蕾长为4.5-8.5mm的花蕾，用小剪刀将花柄剪断后，将同一份材料的花蕾装入自封袋，置于冰盒中，带回实验室。在此过程中应注意避免对花蕾造成损伤。
(5)花蕾预处理：
将采来的胡麻花蕾放置于冰箱中预处理4天，冰箱温度保持在3℃。再将花蕾置于32℃的培养箱中预处理1天，之后进行接种。
(6)接种：
在超净工作台无菌条件下，将预处理后的胡麻花蕾从自封袋取出后用体积比为75％的酒精浸泡35秒，用预冷的温度为3℃无菌水冲洗3遍；之后将花蕾置于5％的次氯酸钠溶液中6分钟进行消毒，消毒完成后用预冷的温度为3℃无菌水冲洗5遍，之后将花蕾置于高压灭菌过的铺有滤纸的培养皿中吸干花蕾表面水分。用灭菌消毒过的尖头小镊子轻轻从胡麻花蕾中取出花药和未受精子房，分开接种至愈伤组织诱导培养基上，每瓶培养基接种50枚花药或25枚未受精子房。共计接种337枚花药、292枚未受精子房。
(7)愈伤组织诱导培养：
将接种好的培养瓶置于31℃的培养箱中，在黑暗条件下培养6天。之后将温度调至24℃在黑暗条件下继续培养。2周以后可见淡黄色颗粒状的愈伤组织，待愈伤组织长至2.5mm时转接至愈伤组织分化培养基上进行分化培养。分化培养整个完成后统计了花药和未受精子房培养所获得的愈伤组织数和分化再生苗数。
3、设置两个对照，其中对照1按颉瑞霞等(见参考文献1)所述最佳愈伤组织培养基配方(MS基本培养基+KT 1.0mg/L+NAA 1.0mg/L+蔗糖60g/L+琼脂5.5g/L，pH调为5.8)和培养条件(采集直径为1.3-1.54mm，长度为4.3-5.1mm的花蕾，在4℃低温预处理1天，接种前将预处理过的花药用75％酒精浸泡30秒，再用0.1％升汞消毒2-3min，用无菌蒸馏水冲洗4次，然后将花药接种在愈伤诱导组织培养基上，先在23-25℃黑暗条件下培养7天，然后转移至23-25℃，光照强度为1500-2000Lx，10h/14h光/暗条件下培养)进行诱导培养。
对照2按孙上峰等(见参考文献2)所述最佳愈伤组织培养基配方(MS基本培养基+蔗糖25g/L+琼脂8.0g/L，pH调为5.8)和培养条件(高糖预培养2天后接种，室温23±2℃暗培养)进行培养。
以上对照未特别注明之处与本发明实施例1相同。
4、整个单倍体诱导培养完成后，计算单倍体诱导相关指标：
花药愈伤组织诱导率(％)＝产生的愈伤组织块数/接种花药数×100％；
未受精子房愈伤组织诱导率(％)＝产生的愈伤组织块数/接种未受精子房数×100％；
花药再生苗分化率(％)＝分化花药再生苗数/转分化花药愈伤组织数×100％；
未受精子房再生苗分化率(％)＝分化未受精子房再生苗数/转分化花药愈伤组织数×100％。
结果见表1。
表1本发明与对照组对诱导胡麻愈伤组织形成和再生苗分化能力的比较
实施例2
一种兼用于胡麻花药和子房愈伤组织诱导的培养基和培养方法，步骤如下：
1、愈伤组织诱导培养基配方如下：
KNO3 2800mg/L，NH4SO4 450mg/L，CaCl2·2H2O 165mg/L，MgSO4·7H2O 180mg/L，KH2PO4 400mg/L，FeSO4·7H2O 25mg/L，MnSO4·4H2O 4.25mg/L，ZnSO4·7H2O 3.0mg/L，H2BO31.25mg/L，KI 1.5mg/L，甘氨酸2.0mg/L，烟酸1.0mg/L，盐酸硫胺素1.5mg/L，盐酸吡哆醇1.5mg/L，谷胱甘肽(还原型)25mg/L，谷氨酰胺0.9g/L，肌醇0.09g/L，PAA 9.0mg/L BAP0.9mg/L，NAA 0.9mg/L，蔗糖27.5g/L，麦芽糖27.5g/L，琼脂6.0g/L，溶剂为蒸馏水。
2、培养方法：
(1)供试材料的选择：
供试材料选择杂交组合“陇亚10号×D418”的F2代材料，其中“陇亚10号”为胡麻审定品种，“D418”为自育胡麻品系。
(2)供试材料的种植和管理：
供试材料可种植于温室和田间，选择的地块应为上年未种植胡麻的田地，播种前按正常整地、施肥和浇水。按行长1m、行距0.2m、每行按80粒播均匀撒播。出苗后在四周搭建防虫网，及时预防白粉病和蚜虫。
(3)培养基配制和灭菌：
愈伤组织诱导培养基的配制和灭菌应在采蕾前2天进行。培养基按照配方配制好以后，用1.0M的NaOH溶液调节pH值为5.8。将愈伤组织诱导培养基分装在50ml的三角瓶中，每瓶装入培养基20ml；装入高压灭菌锅中，在压力为0.12MPa下灭菌20分钟，取出冷却后备用。
(4)采蕾：
采蕾时应选择健壮、未感染病虫害的胡麻植株上的花蕾，在晴天上午9-10点时选择蕾长为4.5-8.5mm的花蕾，用小剪刀将花柄剪断后，将同一份材料的花蕾装入自封袋，置于冰盒中，带回实验室。在此过程中应注意避免对花蕾造成损伤。
(5)花蕾预处理：
将采来的胡麻花蕾放置于冰箱中预处理3天，冰箱温度保持在4℃。再将花蕾置于30℃的培养箱中预处理1天，之后进行接种。
(6)接种：
在超净工作台无菌条件下，将预处理后的胡麻花蕾从自封袋取出后用体积比为75％的酒精浸泡30秒，用预冷的温度为4℃无菌水冲洗3遍；之后将花蕾置于3％的次氯酸钠溶液中8分钟进行消毒，消毒完成后用预冷的温度为2℃无菌水冲洗5遍，之后将花蕾置于高压灭菌过的铺有滤纸的培养皿中吸干花蕾表面水分。用灭菌消毒过的尖头小镊子轻轻从胡麻花蕾中取出花药和未受精子房，分开接种至愈伤组织诱导培养基上，每瓶培养基接种30枚花药或20枚未受精子房。共计接种286枚花药、219枚未受精子房。
(7)愈伤组织诱导培养：
将接种好的培养瓶置于33℃的培养室中，在黑暗条件下培养5天。之后将温度调至23℃在黑暗条件下继续培养。2周以后可见淡黄色颗粒状的愈伤组织，待愈伤组织长至3mm时转接至愈伤组织分化培养基上进行分化培养。分化培养整个完成后统计了花药和未受精子房培养所获得的愈伤组织数和分化再生苗数。
3、设置两个对照，其中对照3按张举仁(见参考文献3)所述最佳愈伤组织培养基配方(MMS基本培养基6-BA1.0μM+KT 2.0μM+2,4-D 2.5μM+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L，pH调为5.7)和培养条件(接种前在70％的乙醇、0.1％的升汞、2％的次氯酸钠中依次处理1、5、7分钟，无菌水冲洗3遍，然后将花药接种在愈伤诱导培养基上，在25-28℃、光照强度为1200Lx，12-13h/11-12h光/暗条件下培养)进行诱导培养。
对照4按Burbulis等(见参考文献4)所述最佳愈伤组织培养基配方【MS改良培养基(其中NH4NO3 165mg/L)+BAP 2mg/L+NAA 1mg/L+蔗糖60g/L+琼脂8.0g/L，pH调为5.8)和培养条件(接种前将花蕾用70％的乙醇冲洗1分钟，然后在2％的次氯酸钠溶液中灭菌10分钟，再用无菌水冲洗3遍，接种在愈伤组织诱导培养基后，在27/24℃光/暗培养下培养)进行诱导培养。
以上对照未特别注明之处与本发明实施例2相同。
4、整个单倍体诱导培养完成后，计算单倍体诱导相关指标：
花药愈伤组织诱导率(％)＝产生的愈伤组织块数/接种花药数×100％；
未受精子房愈伤组织诱导率(％)＝产生的愈伤组织块数/接种未受精子房数×100％；
花药再生苗分化率(％)＝分化花药再生苗数/转分化花药愈伤组织数×100％；
未受精子房再生苗分化率(％)＝分化未受精子房再生苗数/转分化花药愈伤组织数×100％。
结果见表2。
表2本发明与对照组对诱导胡麻愈伤组织形成和再生苗分化能力的比较
培养基配方及培养方法 本发明 对照3 对照4
接种花药数/枚 286 203 245
接种子房数/枚 219 188 222
形成的花药愈伤组织数/个 131 87 102
形成的未受精子房愈伤组织数/个 164 95 113
花药愈伤组织诱导率/％ 45.8 42.86 41.63
未受精子房愈伤组织诱导率/％ 74.89 50.53 50.9
花药再生苗数/个 76 17 23
未受精子房再生苗数/个 39 22 23
花药再生苗分化率/％ 58.02 19.54 22.55
未受精子房再生苗分化率/％ 23.78 23.16 20.35
实施例3
一种兼用于胡麻花药和子房愈伤组织诱导的培养基和培养方法，步骤如下：
1、愈伤组织诱导培养基配方如下：
KNO3 2850mg/L，NH4SO4 400mg/L，CaCl2·2H2O 150mg/L，MgSO4·7H2O 200mg/L，KH2PO4 380mg/L，FeSO4·7H2O 30mg/L，MnSO4·4H2O 3.5mg/L，ZnSO4·7H2O 2.5mg/L，H2BO31.5mg/L，KI 1mg/L，甘氨酸1.5mg/L，烟酸1.2mg/L，盐酸硫胺素1mg/L，盐酸吡哆醇1mg/L，谷胱甘肽(还原型)20mg/L，谷氨酰胺1.0g/L，肌醇0.08g/L，PAA 10.0mg/L BAP 0.8mg/L，NAA0.8mg/L，蔗糖30g/L，麦芽糖25g/L，琼脂6.5g/L，溶剂为蒸馏水。
2、培养方法：
(1)供试材料的选择：
供试材料选择陇亚杂1号。
(2)供试材料的种植和管理：
供试材料可种植于温室和田间，选择的地块应为上年未种植胡麻的田地，播种前按正常整地、施肥和浇水。按行长1m、行距0.2m、每行按120粒播均匀撒播。出苗后在四周搭建防虫网，及时预防白粉病和蚜虫。
(3)培养基配制和灭菌：
愈伤组织诱导培养基的配制和灭菌应在采蕾前2天进行。培养基按照配方配制好以后，用0.8M的NaOH溶液调节pH值为6.2。将愈伤组织诱导培养基分装在50ml的三角瓶中，每瓶装入培养基18ml；装入高压灭菌锅中，在压力为0.10MPa下灭菌25分钟，取出冷却后备用。
(4)采蕾：
采蕾时应选择健壮、未感染病虫害的胡麻植株上的花蕾，在晴天上午9-10点时选择蕾长为4.5-8.5mm的花蕾，用小剪刀将花柄剪断后，将同一份材料的花蕾装入自封袋，置于冰盒中，带回实验室。在此过程中应注意避免对花蕾造成损伤。
(5)花蕾预处理：
将采来的胡麻花蕾放置于冰箱中预处理5天，冰箱温度保持在2℃。再将花蕾置于33℃的培养箱中预处理1天，之后进行接种。
(6)接种：
在超净工作台无菌条件下，将预处理后的胡麻花蕾从自封袋取出后用体积比为75％的酒精浸泡40秒，用预冷的温度为2℃无菌水冲洗5遍；之后将花蕾置于4％的次氯酸钠溶液中5分钟进行消毒，消毒完成后用预冷的温度为4℃无菌水冲洗5遍，之后将花蕾置于高压灭菌过的铺有滤纸的培养皿中吸干花蕾表面水分。用灭菌消毒过的尖头小镊子轻轻从胡麻花蕾中取出花药和未受精子房，分开接种至愈伤组织诱导培养基上，每瓶培养基接种60枚花药或30枚未受精子房。共计接种343枚花药、226枚未受精子房。
(7)愈伤组织诱导培养：
将接种好的培养瓶置于32℃的培养室中，在黑暗条件下培养7天。之后将温度调至24℃在黑暗条件下继续培养。2周以后可见淡黄色颗粒状的愈伤组织，待愈伤组织长至2mm时转接至愈伤组织分化培养基上进行分化培养。分化培养整个完成后统计了花药和未受精子房培养所获得的愈伤组织数和分化再生苗数。
实施例4
一种兼用于胡麻花药和子房愈伤组织诱导的培养基和培养方法，步骤如下：
1、愈伤组织诱导培养基配方如下：
KNO3 2700mg/L，NH4SO4 500mg/L，CaCl2·2H2O 180mg/L，MgSO4·7H2O 160mg/L，KH2PO4 420mg/L，FeSO4·7H2O 20mg/L，MnSO4·4H2O 5.0mg/L，ZnSO4·7H2O 3.5mg/L，H2BO31mg/L，KI 2mg/L，甘氨酸2.5mg/L，烟酸0.8mg/L，盐酸硫胺素2mg/L，盐酸吡哆醇2mg/L，谷胱甘肽(还原型)30mg/L，谷氨酰胺0.8g/L，肌醇0.10g/L，PAA 8.0mg/L，BAP 1mg/L，NAA1.0mg/L，蔗糖25g/L，麦芽糖30g/L，琼脂5.5g/L，溶剂为蒸馏水。
2、培养方法：
(1)供试材料的选择：
供试材料选择陇亚杂2号。
(2)供试材料的种植和管理：
供试材料可种植于温室和田间，选择的地块应为上年未种植胡麻的田地，播种前按正常整地、施肥和浇水。按行长1m、行距0.2m、每行按90粒播均匀撒播。出苗后在四周搭建防虫网，及时预防白粉病和蚜虫。
(3)培养基配制和灭菌：
愈伤组织诱导培养基的配制和灭菌应在采蕾前1天进行。培养基按照配方配制好以后，用0.9M的NaOH溶液调节pH值为5.5。将愈伤组织诱导培养基分装在50ml的三角瓶中，每瓶装入培养基22ml；装入高压灭菌锅中，在压力为0.15MPa下灭菌20分钟，取出冷却后备用。
(4)采蕾：
采蕾时应选择健壮、未感染病虫害的胡麻植株上的花蕾，在晴天上午9-10点时选择蕾长为4.5-8.5mm的花蕾，用小剪刀将花柄剪断后，将同一份材料的花蕾装入自封袋，置于冰盒中，带回实验室。在此过程中应注意避免对花蕾造成损伤。
(5)花蕾预处理：
将采来的胡麻花蕾放置于冰箱中预处理5天，冰箱温度保持在2℃。再将花蕾置于33℃的培养箱中预处理1天，之后进行接种。
(6)接种：
在超净工作台无菌条件下，将预处理后的胡麻花蕾从自封袋取出后用体积比为75％的酒精浸泡40秒，用预冷的温度为2℃无菌水冲洗5遍；之后将花蕾置于4％的次氯酸钠溶液中5分钟进行消毒，消毒完成后用预冷的温度为4℃无菌水冲洗5遍，之后将花蕾置于高压灭菌过的铺有滤纸的培养皿中吸干花蕾表面水分。用灭菌消毒过的尖头小镊子轻轻从胡麻花蕾中取出花药和未受精子房，分开接种至愈伤组织诱导培养基上，每瓶培养基接种60枚花药或30枚未受精子房。共计接种233枚花药、175枚未受精子房。
(7)愈伤组织诱导培养：
将接种好的培养瓶置于32℃的培养室中，在黑暗条件下培养7天。之后将温度调至24℃在黑暗条件下继续培养。2周以后可见淡黄色颗粒状的愈伤组织，待愈伤组织长至2mm时转接至愈伤组织分化培养基上进行分化培养。分化培养整个完成后统计了花药和未受精子房培养所获得的愈伤组织数和分化再生苗数。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种兼用于胡麻花药和子房愈伤组织诱导的培养基，其特征在于：所述培养基的配方为：KNO3 2700-2850mg/L，NH4SO4 400-500mg/L，CaCl2·2H2O 150-180mg/L，MgSO4·7H2O160-200mg/L，KH2PO4 380-420mg/L，FeSO4·7H2O 20-30mg/L，MnSO4·4H2O 3.5-5.0mg/L，ZnSO4·7H2O 2.5-3.5mg/L，H2BO3 1-1.5mg/L，KI 1-2mg/L，甘氨酸1.5-2.5mg/L，烟酸0.8-1.2mg/L，盐酸硫胺素1-2mg/L，盐酸吡哆醇1-2mg/L，还原型谷胱甘肽20-30mg/L，谷氨酰胺0.8-1.0g/L，肌醇0.08-0.10g/L，PAA 8.0-10.0mg/L，BAP 0.8-1mg/L，NAA 0.8-1mg/L，蔗糖25-30g/L，麦芽糖25-30g/L，琼脂5.5-6.5g/L，溶剂为蒸馏水。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述培养基的配方为：KNO3 2800mg/L，NH4SO4 450mg/L，CaCl2·2H2O 165mg/L，MgSO4·7H2O 180mg/L，KH2PO4 400mg/L，FeSO4·7H2O 25mg/L，MnSO4·4H2O 4.25mg/L，ZnSO4·7H2O 3.0mg/L，H2BO3 1.25mg/L，KI 1.5mg/L，甘氨酸2.0mg/L，烟酸1.0mg/L，盐酸硫胺素1.5mg/L，盐酸吡哆醇1.5mg/L，还原型谷胱甘肽25mg/L，谷氨酰胺0.9g/L，肌醇0.09g/L，PAA 9.0mg/L，BAP 0.9mg/L，NAA 0.9mg/L，蔗糖27.5g/L，麦芽糖27.5g/L，琼脂6.0g/L，溶剂为蒸馏水。
3.一种兼用于胡麻花药和子房愈伤组织诱导的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)配制权利要求1或2所述的愈伤组织诱导培养基并灭菌；
(2)种植胡麻杂交F1或F2代材料，采集花蕾并将花蕾进行预处理；
(3)接种；
(4)愈伤组织诱导培养。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(1)和步骤(2)的顺序互调。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述将花蕾进行预处理的具体方法为：将采来的胡麻花蕾放置于冰箱中预处理3-5天，冰箱温度保持在2-4℃；再将花蕾置于30-33℃的培养箱中预处理1天，之后进行接种。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述接种的具体方法为：在无菌条件下，将预处理后的胡麻花蕾先用体积比为75％的酒精浸泡消毒，再置于3-5％的次氯酸钠溶液中消毒；然后从胡麻花蕾中取出花药和未受精子房，接种到步骤(1)所述的愈伤组织诱导培养基。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述用体积比为75％的酒精浸泡消毒的时间为30-40秒；所述用3-5％的次氯酸钠溶液消毒的时间为5-8分钟。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述愈伤组织诱导培养的具体方法为：将接种好的培养容器置于31-33℃的培养箱或培养室中，在黑暗条件下培养5-7天；之后将温度调至23-25℃在黑暗条件下继续培养，待愈伤组织长至2-3mm时转接至愈伤组织分化培养基上进行分化培养。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述愈伤组织诱导培养的具体方法为：将接种好的培养瓶置于31℃的培养箱或培养室中，在黑暗条件下培养6天，之后将温度调至24℃在黑暗条件下继续培养，待愈伤组织长至2.5mm时转接至愈伤组织分化培养基上进行分化培养。
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