CN111642396A - 一种适用于垂果亚麻花药和子房的培养基以及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适用于垂果亚麻花药和子房的培养基以及培养方法，属于野生亚麻生物技术领域。该培养方法包括基因型选择、外植体低温处理、外植体表面消毒、愈伤组织诱导、愈伤组织分化、不定芽伸长和生根培养。本发明以垂果亚麻的花药和未受精子房为材料，建立了一套适合垂果亚麻的单倍体再生植株培养体系，直接获得了垂果亚麻的单倍体植株，为亚麻的单倍体育种提供一定的参考价值，同时，对亚麻遗传改良的种质资源保存和新品种选育都具有一定意义，也是保存野生遗传资源的一种手段，为今后的科研工作提供帮助。
Description
技术领域
本发明属于野生亚麻生物技术领域，尤其涉及一种适用于垂果亚麻花药和子房的培养基以及培养方法。
背景技术
垂果亚麻(L.nutans Maxim)属于亚麻科亚麻属，属于野生类型，与目前生产上的亚麻同属不同种。垂果亚麻为多年生草本植物，花期长，蒴果开裂，种子不饱满，发芽率低，多生长于沙质草原和干山坡，具有抗逆性强，丰产性好等优点。由于垂果亚麻具有优良的遗传物质，因此，是亚麻育种重要目标基因的遗传来源，也是种质创新和改造的基础，同时，更是亚麻新品种选育及种质资源创新不可多得的珍贵资源。
单倍体育种可以大大缩短育种年限，加快育种进程，在植物遗传育种理论和实践研究中具有广泛地应用前景。材料的外植体污染问题直接影响愈伤诱导率，从而影响完整再生植株的获得。目前尚未有兼用于垂果亚麻花药和子房培养再生植株的获取方法。整体而言，亚麻单倍体诱导效率较低，难以直接应用于亚麻种质资源创制和亚麻新品种选育。垂果亚麻虽然花期长，但由于蒴果开裂，不易获得种子，且种子常败育，因此常有挖采现象出现。目前，随着人们对野生亚麻生长环境的破坏以及自由挖采，野生亚麻资源受到了不同程度地破坏。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种适用于垂果亚麻花药和子房的培养基以及培养方法。本发明以垂果亚麻的花药和未受精子房为材料，建立了一套适合垂果亚麻的单倍体再生植株培养体系，直接获得了垂果亚麻的单倍体植株，为亚麻的单倍体育种提供一定的参考价值，同时，对亚麻遗传改良的种质资源保存和新品种选育都具有一定意义，也是保存野生遗传资源的一种手段，为今后的科研工作提供帮助。
为达上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种适用于垂果亚麻花药和子房的培养基，包括愈伤组织固体诱导培养基、愈伤组织固体分化培养基、不定芽伸长培养基、不定芽生根培养基，上述培养基的组分如下：
(1)愈伤组织固体诱导培养基：添加1.0mg/L KT和2.0mg/L 2,4-D的MS培养基，其中蔗糖浓度为50-60g/L，琼脂5.5g/L。
(2)愈伤组织固体分化培养基：添加0.05mg/L NAA和1mg/L 6-BA的MS培养基，其中蔗糖20-30g/L，琼脂7g/L。
(3)不定芽伸长培养基：添加1.5mg/L 6-BA和0.5mg/L IAA的MS培养基。
(4)不定芽生根培养基：添加1mg/L IBA和0.2mg/L NAA的1/2MS培养基。
一种使用上述培养基的垂果亚麻花药和/或子房的培养方法，其步骤如下：
(1)供试基因型的选择
供试材料选择健康、无病害的垂果亚麻植株。
(2)供试材料的选取
供试材料野外生长，无需进行人工干预管理。垂果亚麻的花期长，一般垂果亚麻在5-8月均可见花蕾，可在开花期间采集。
(3)采蕾
采蕾时应选择健壮、未感染病虫害的亚麻植株上的花蕾，在晴天上午9-10点时选择蕾长为2-10mm的花蕾，用小剪刀将花柄剪断后，将同一份材料的花蕾装入自封袋或保鲜袋中，置于冰盒中，带回实验室。在此过程中应注意避免对花蕾造成损伤。
(4)外植体的选择
经显微镜镜检，选取小孢子处于单核中期至靠边期的垂果亚麻花药所对应花蕾用于后续培养。
(5)外植体的预处理
将材料放于自封袋内，放置于3-5℃冰箱预处理2-3天。再将花蕾置于30±1℃左右的培养箱中预处理10-14h，之后进行消毒处理。
(6)外植体的表面消毒
选择花蕾长度为3-5mm，于无菌操作台中，先用75％酒精处理30s～45s，再用20％次氯酸钠处理2-10min，无菌水冲洗4-6次。
(7)愈伤组织的诱导培养
用无菌滤纸将步骤(6)中花蕾表面的水分吸干，拨开花蕾取下花药和子房，接种于愈伤组织固体诱导培养基中，放入黑暗培养箱进行培养，温度为22±2℃，待愈伤长至2-3mm，然后转移至光照强度为1500-2000Lx，8-12h/d光照、12-16h/d黑暗，温度为23～25℃的条件下培养一个月左右获取愈伤组织。
(8)愈伤组织的分化培养
将膨大的愈伤组织切成小块，接种于愈伤组织分化培养基中进行分化培养，光照强度为1500-2000Lx，8-12h/d光照、12-16h/d黑暗，温度为22±2℃，经过一短时间的光照培养，分化出不定芽。
(9)不定芽的伸长培养
待不定芽长至0.5-1cm后，接种于不定芽伸长培养基上，进行不定芽的伸长培养，光照强度为1500-2000Lx、8-12h/d光照、12-16h/d黑暗、温度为23±2℃，并获得垂果亚麻幼苗。
(10)不定芽的生根培养
光照培养3周左右，将伸长培养获得的垂果亚麻幼苗接种于生根培养基中进行生根培养，光照强度为1500-2000Lx、8-12h/d光照、12-16h/d黑暗、温度为23±2℃，一段时间后即可获得垂果亚麻再生植株。
进一步的，所述步骤(6)中选择的花蕾长度为3mm。
更进一步的，所述步骤(6)中20％次氯酸钠处理时间为2min。
更进一步的，所述步骤(7)中光照时长为10h/d，黑暗时长为14h/d。
更进一步的，所述步骤(8)中光照时长为10h/d，黑暗时长为14h/d。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了垂果亚麻外植体的培养方法以及培养基，通过愈伤组织的诱导、分化，最终获得完整植株的方法；本发明建立了一种适合垂果亚麻的简单、快速、稳定的花药和未受精子房的消毒方法，并通过其愈伤组织培养建立了一套垂果亚麻的离体再生体系，为垂果亚麻的单倍体育种提供参考，同时，对亚麻的遗传改良和新品种的选育提供一定的参考价值。
附图说明
图1为实施例1中垂果亚麻外植体的培养流程图。
图2为实施例1中小孢子处于单核靠边期的花药镜检图。
图3为实施例1中花药愈伤组织的诱导图。
图4为实施例1中未受精子房愈伤组织的诱导图。
图5为实施例1中分化形成的再生苗图。
图6为实施例1中垂果亚麻再生苗的生根图。
图7为实施例5中垂果亚麻2周诱导的愈伤图。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供了一种兼用于花药和子房培养获得垂果亚麻再生植株的方法，如图1所示，包括如下步骤：
(1)供试基因型的选择
供试材料选择健康、无病害的垂果亚麻植株。
(2)供试材料的选取
供试材料野外生长，无需进行人工干预管理。垂果亚麻的花期长，一般垂果亚麻在5-8月均可见花蕾，可在开花期间采集。
(3)采蕾
采蕾时应选择健壮、未感染病虫害的亚麻植株上的花蕾，在晴天上午9-10点时选择蕾长为2-10mm的花蕾，用小剪刀将花柄剪断后，将同一份材料的花蕾装入自封袋或保鲜袋中，置于冰盒中，带回实验室。在此过程中应注意避免对花蕾造成损伤。
(4)外植体的选择
经显微镜镜检，选取小孢子处于单核中期至靠边期的垂果亚麻花药所对应花蕾用于后续培养，其中，小孢子处于单核靠边期的花药如图2所示。
(5)外植体的预处理
将材料放于自封袋内，放置于4℃冰箱预处理2-3天，再将花蕾置于30℃左右的培养箱中预处理12h，之后进行消毒处理。
(6)外植体的表面消毒
选择花蕾长度为3mm，于无菌操作台中，先用75％酒精处理30s～45s，再用20％次氯酸钠处理2-10min，无菌水冲洗4-6次。
(7)愈伤组织的诱导培养
用无菌滤纸将步骤(6)中花蕾表面的水分吸干，拨开花蕾取下花药和子房，接种于愈伤组织固体诱导培养基中，放入黑暗培养箱进行培养，温度为22±2℃，待愈伤长至2-3mm，然后转移至光照强度为1500～2000Lx,10h/d光照、14h/d黑暗，温度为23～25℃的条件下培养。经1个月左右的光照培养获取愈伤组织，如图3、4所示；其中，愈伤组织固体诱导培养基为添加有KT 1.0mg/L和2.4-D 1.0mg/L的MS培养基，其中蔗糖浓度60g/L，琼脂5.5g/L。每个培养皿接种20枚花药或10枚未受精子房。共计接种140枚花药、70枚未受精子房。
(8)愈伤组织的分化培养
将图3、4所示的膨大的愈伤组织切成小块，接种于分化培养基中进行愈伤组织的分化培养，光照强度为1500～2000Lx,10h/d光照、14h/d黑暗，温度为22±2℃，经过一个月的光照培养，分化出如图5所示的不定芽。其中，分化培养基为添加NAA0.05mg/L和6-BA1mg/L的MS培养基，蔗糖25g/L，琼脂7g/L。
(9)不定芽的伸长培养
待不定芽长至0.5-1cm后，接种于不定芽伸长培养基上，进行不定芽的伸长培养，培养条件为光照强度1500-2000Lx、8-12h/d光照、12-16h/d黑暗、温度为23±2℃，培养3-4周后即可获得垂果亚麻幼苗，不定芽伸长培养基具体为添加有6-BA1.5mg/L和IAA 1mg/L的MS培养基。
(10)不定芽的生根培养
光照培养3周后，将伸长培养获得的垂果亚麻幼苗接种于生根培养基中进行生根培养，光照强度为1500-2000Lx、8-12h/d光照、12-16h/d黑暗、温度为23±2℃，1个月后获得如图6所示的垂果亚麻再生植株，其中生根培养基具体为添加有IBA 1mg/L和NAA0.2mg/L的1/2MS培养基。
实施例2
对实施例1中垂果亚麻花药培养过程中采用的20％次氯酸钠的处理时间经过一定的实验研究，其过程及结果如下：
将酒精处理过的花蕾继续用20％次氯酸钠进行表面消毒，作用时间分别为2min、5min、10min，放入黑暗培养箱进行培养，温度为22±2℃，待愈伤长至2-3mm，然后转移至光照强度为1500～2000Lx，10h/d光照、14h/d黑暗，温度为23～25℃的条件下培养，经一个月的光照培养后，统计愈伤组织的诱导率及愈伤组织的长势，结果如表1所示。
表120％次氯酸钠不同处理时间对垂果亚麻花药愈伤组织诱导的影响
由表1可知，用20％次氯酸钠对垂果亚麻花蕾进行不同时间的表面消毒处理，对垂果亚麻花药愈伤组织诱导率和长势具有显著的影响：花蕾长度为3mm、20％次氯酸钠处理时间为2min时，愈伤组织的诱导率高达95.4％、污染率仅为3％，且愈伤组织为淡黄色，质地疏松，利于后期的分化研究。
实施例3
本实施例针对不同浓度2,4-D对垂果亚麻愈伤组织诱导的影响进行实验，过程如下：
将经表面消毒后的外植体接种于添加不同浓度2,4-D的MS培养基中进行愈伤组织的诱导和增殖，培养条件为：光照强度为1500-2000Lx、10h/d光照、14h/d黑暗，温度为22±2℃。一个月后统计愈伤组织的诱导率和愈伤组织的长势，结果如表2所示。
表2不同浓度2,4-D对垂果亚麻愈伤组织诱导的影响
由表2可知，不同浓度2,4-D对垂果亚麻愈伤组织诱导率具有显著影响，将花药和子房接种于含有KT1.0mg/L和2,4-D2.0mg/L的MS培养基上，花药和子房愈伤组织的诱导率分别为97.3％和87.2％，且愈伤组织为淡黄色，质地疏松，利于后期的分化研究。
实施例4
本实施例针对不同浓度IAA对垂果亚麻不定芽伸长的影响进行实验，过程如下：
将分化出0.5-1.0cm左右的不定芽接种于添加有不同浓度IAA的培养基中进行不定芽伸长的分化实验，培养条件为：光照强度为1500-2000Lx、10h/d光照、14h/d黑暗、温度为22±2℃。培养3周后统计不定芽的伸长情况，结果如表3所示。
表3不同浓度IAA对垂果亚麻不定芽伸长的影响
由表3所示，将IAA浓度控制在0.5mg/L左右时，对垂果亚麻花药和子房的不定芽伸长率及平均芽长具有显著影响，其花药不定芽伸长率高达92.1％、平均芽长为3.9cm，子房的不定芽伸长率为88.2％、平均芽长为4.4cm。
实施例5
本实施例采用实施例1中的培养过程，并将实施例2-4中得出的最优参数应用到本实施例中，包括：花蕾长度3mm、20％次氯酸钠处理时间2min；将花药接种于含有KT 1.0mg/L和2,4-D 2.0mg/L的MS培养基上；采用添加6-BA 1.5mg/L和IAA0.5mg/L的MS培养基作为不定芽的伸长培养。经2周诱导培养花药破裂可见淡黄色愈伤组织(图7)，转接于芽分化培养基培养2周后获得不定芽丛，花药诱导率和发芽率均高达98％。与实施例1中诱导培养及分化培养均为3周左右相比，缩短了培养周期。
对比例1
本对比例针对不同培养基对垂果亚麻花药培养的影响进行试验，过程如下：
将经表面消毒后的外植体分别接种于添加KT1.0mg/L和2,4-D2.0mg/L的MS、1/2MS、WPM培养基中进行愈伤组织的诱导，蔗糖为50g/L，琼脂为6g/L，pH＝5.8。培养条件为：光照强度为1500-2000Lx、10h/d光照、14h/d黑暗，温度为22±2℃，一个月后统计愈伤组织的诱导率和长势，结果如表4所示。
表4不同培养基对垂果亚麻花药培养的影响
| 培养基类型 | 花药愈伤诱导率(％) | 愈伤状态 |
| MS | 98.4 | 淡黄色、质地疏松 |
| 1/2MS | 56.3 | 乳白色、水泽状 |
| WPM | 78.5 | 乳白色、质地疏松 |
由上表可知，本发明采用的添加KT 1.0mg/L和2,4-D 2.0mg/L的MS培养基更加适合垂果亚麻花药培养，诱导效率极高。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.一种适用于垂果亚麻花药和子房的培养基，其特征在于，包括如下种类的培养基：
(1)愈伤组织固体诱导培养基：添加1.0mg/L KT和2.0mg/L 2,4-D的MS培养基，其中蔗糖浓度为50-60g/L，琼脂适量；
(2)愈伤组织固体分化培养基：添加0.05mg/LNAA和1mg/L 6-BA的MS培养基，其中蔗糖20-30g/L，琼脂适量；
(3)不定芽伸长培养基：添加1.5mg/L 6-BA和0.5mg/L IAA的MS培养基；
(4)不定芽生根培养基：添加1mg/LIBA和0.2mg/LNAA的1/2MS培养基。
2.一种使用如权利要求1所述培养基的垂果亚麻花药和/或子房的培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)采蕾
采集健壮、未感染病虫害的亚麻植株上蕾长为2-10mm的花蕾；
(2)外植体的选择
选取小孢子处于单核中期至靠边期的垂果亚麻花药所对应花蕾用于后续培养；
(3)外植体的预处理
将采集的材料放置于3-5℃冰箱预处理2-3天，再将花蕾置于30±1℃的培养箱中预处理10-14h，之后进行消毒处理；
(4)外植体的表面消毒
(5)愈伤组织的诱导培养
用无菌滤纸将步骤(4)中花蕾表面的水分吸干，拨开花蕾取下花药和/或子房，接种于愈伤组织固体诱导培养基中，放入黑暗培养箱进行培养，温度为22±2℃，待愈伤长至2-3mm，然后转移至光照强度为1500～2000Lx，8-12h/d光照、12-16h/d黑暗，温度为23～25℃的条件下培养30±3天获取愈伤组织；
(6)愈伤组织的分化培养
将膨大的愈伤组织切成小块，接种于愈伤组织分化培养基中进行分化培养，光照强度为1500-2000Lx，8-12h/d光照、12-16h/d黑暗，温度为22±2℃，经过一短时间的光照培养，分化出不定芽；
(7)不定芽的伸长培养
待不定芽长至0.5-1cm后，接种于不定芽伸长培养基上，进行不定芽的伸长培养，并获得垂果亚麻幼苗，光照强度为1500-2000Lx，8-12h/d光照、12-16h/d黑暗、温度为23±2℃；
(8)不定芽的生根培养
光照培养18-24天，将伸长培养获得的垂果亚麻幼苗接种于生根培养基中进行生根培养，光照强度为1500-2000Lx，8-12h/d光照、12-16h/d黑暗、温度为23±2℃，一段时间后即可获得垂果亚麻再生植株。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)培养箱中的预处理时间为12h。
4.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(4)中的消毒方法为：选择花蕾长度为3-5mm，于无菌操作台中，先用75％酒精处理30s～45s，再用20％次氯酸钠处理2-10min，无菌水冲洗4-6次。
5.如权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(4)中花蕾长度为3mm。
6.如权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(4)中20％次氯酸钠处理时间为2min。
7.如权利要求6所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(5)中光照时长为10h/d，黑暗时长为14h/d。
8.如权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(6)中光照时长为10h/d，黑暗时长为14h/d。
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| GR01 | Patent grant | ||
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