CN115517170A - 一种甘肃贝母离体培养直接发生小鳞茎的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甘肃贝母离体培养直接发生小鳞茎的方法，包括初代培养中的外植体的预处理、外植体的灭菌、外植体培养和继代培养，以及打破小鳞茎休眠和小鳞茎生根培养。本发明能够通过直接发生途经，以休眠芽或休眠芽萌发产生的无菌苗茎段为外植体不经愈伤组织直接形成小鳞茎，而且此小鳞茎可继代培养再次产生更多的小鳞茎，以达到快速繁殖的目的。相比之下，本发明的诱导途径遗传变异小且耗时短，是较为理想的繁殖方式。
Description
技术领域
本发明属于作物繁育技术领域，具体涉及一种甘肃贝母离体培养直接发生小鳞茎的方法。
背景技术
甘肃贝母(Fritillaria przewalskii Maxim.)属百合科多年生草本植物，是中药川贝母(Fritillariae Cirrhosae Bulbs)的基源植物之一，分布于甘肃南部、四川西部、青海东部和南部、陕西西部,生长在海拔2800-4400 m的灌丛中或草地上。入药部位为地下鳞茎, 具有清热润肺、化痰止咳等功效，具有极高的药用价值，因此市场需求量大，价格高昂，每公斤高达3000-3400元。甘肃贝母喜阴、寒、湿，忌高温和强光直射,对环境的要求十分苛刻。甘肃贝母主要以种子繁殖为主，但种子存在形态和生理双重休眠，而且实生苗生长非常缓慢，生长周期长，一般从播种到开花需要4-5年的时间。这些自身生长习性导致其人工栽培很困难，造成资源严重紧缺。人为的过渡采挖导致甘肃贝母野生资源的蕴藏量急剧下降，早在1987年国务院就将川贝母的野生基原植物甘肃贝母列为国家三级濒危保护药用植物。所以人工保护和栽培种植就势在必行。
组织培养技术不受季节等条件的限制，可实现短时期内迅速扩大植物的数量，获得较高的经济效益。我国学者进行了大量的贝母组织培养发明工作，主要集中在川贝母、浙贝母、土贝母、伊贝母、暗紫贝母、安徽贝母等的, 而关于甘肃贝母的组织培养发明鲜见报道。其次，大多数发明通过愈伤组织诱导产生鳞茎，生长周期长、遗传变异率高，增殖速度慢。本试验以休眠芽及其茎段为外植体直接诱导获得再生鳞茎并再生植株，该途径不经过愈伤组织阶段，遗传稳定性高、繁殖速度快，是离体快速繁殖的理想途径。在国外，单子叶植物如百合、洋葱、鸢尾、石蒜等地下营养贮藏器官的组织培养繁殖技术已应用于生产实践。因此有必要建立甘肃贝母离体快速繁殖技术体系，为濒危药用植物野生资源的保护和人工栽培种植提供技术支撑，为解决贝母生长缓慢的问题开辟新的途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种甘肃贝母离体培养直接发生小鳞茎的方法，以解决上述问题。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种甘肃贝母离体培养直接发生小鳞茎的方法，包括如下步骤：
步骤一、初代培养：
（1）外植体的预处理：
将储存于4℃的甘肃贝母鳞茎取出，用软毛刷轻轻将鳞茎表面刷洗干净，弃去最外层鳞茎，保留内层鳞片及休眠芽，流水冲洗20-30min；
（2）外植体的灭菌：
将预处理干净的材料先用75%乙醇浸泡10-30s，再用0.1%升汞浸泡30-60s，期间不断震荡，无菌水冲洗3-5次，最后在无菌滤纸上吸干材料表面水分；
（3）外植体培养：
将灭菌后的休眠芽和内层鳞片分别接种于1/2MS+6-BA0.5-1.0mg/L+NAA0.1-1.0mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH5.8的培养基中，接种后将培养物置于20℃的恒温培养箱中黑暗培养7-8周，诱导出试管鳞茎；
或将灭菌后的休眠芽接种于1/2MS+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH5.8的培养基中，在20℃、光照强度1000-2000lux条件下光照12h/d至萌发形成无菌苗，将无菌苗的茎段切成0.2-1cm的小段接种于1/2MS+6-BA0.2-1.0mg/L+NAA0.1-1.0mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH5.8的培养基中，诱导产生小鳞茎；
步骤二、继代培养：
将步骤一得到的再生鳞茎取出，先分为4-6mm的大瓣和2-4mm的中瓣，将大瓣横切，中瓣纵切，然后分别接种于培养基中，接种后将培养物置于10℃的恒温培养箱中黑暗培养14d，再转入20-25℃的恒温培养箱中黑暗培养16d，获得小鳞茎；
步骤三、打破小鳞茎休眠：
将步骤二得到的小鳞茎置于4℃下储藏40d-60d打破休眠，萌发产生黄色嫩芽；
步骤四、小鳞茎生根培养：
将步骤三的到的小鳞茎转入生根培养基1/2MS+NAA0.1mg/L+IAA0.5mg/+1.5%蔗糖+0.7%琼脂pH5.8，20℃、光照强度1500-2200lx下光照12h/d，5-9d黄色嫩芽迅速转绿，30d后小鳞茎基部有根产生。
为了进一步实现本发明，步骤二的中所述再生鳞茎的大瓣和中瓣的培养基采用1/2MS+6-BA0.2-1.0mg/L+NAA0.1-1.0mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH5.8。
本发明相较于现有技术的有益效果为：
本发明将甘肃贝母组培以休眠芽、内层鳞片为外植体，或使用休眠芽萌发产生的茎段为外植体，具有灭菌方便，污染率低、容易建立无菌培养体系，再加之材料幼嫩、分化能力强、容易诱导获得小鳞茎和培养效果好，且不占用药用部位的优点。在植物组织培养发明中, 无菌外植体的获得是决定组培成功的前提，绝大多数贝母组织培养以鳞茎为外植体，但鳞茎多生于地下，很难灭菌彻底，污染率较高,这也是限制系统深入开展贝母离体快繁发明的重要因素。
虽然植物组织培养中健康无病植株的任何组织、器官，甚至细胞、原生质体都有培养成功的报道。如茎尖、茎段、块茎、鳞茎、球茎、表皮、皮层、维管束、髓细胞、树木的形成层，以及生殖器官中的花托、花瓣、花药、花粉、子房、胚珠、胚、胚乳、胚柄、子叶、上胚轴、下胚轴、叶片、叶柄、叶枕和根等都可以作为外植体培养。但是由于不同植物以及同一株植物在不同发育阶段和时期所取的同一种组织和器官在组织培养过程中，其脱分化和再分化的难易程度不同，因此，其诱导成功率也不同。即便是同一株植物不同部位的器官、组织，其脱分化和再分化的潜能也不同。另外，诱导成植株后的繁殖速度也有差别，因此，选择适宜的外植体是植物组织培养能否成功的关键因素。
本发明能够通过直接发生途经，以休眠芽或休眠芽萌发产生的无菌苗茎段为外植体不经愈伤组织直接形成小鳞茎，而且此小鳞茎可继代培养再次产生更多的小鳞茎，以达到快速繁殖的目的。相比之下，本发明的诱导途径遗传变异小且耗时短，是较为理想的繁殖方式。
以休眠芽萌发的幼苗的2-10mm长的茎段作为繁殖材料，也可以诱导茎段一端直接产生小鳞茎。发明发现，2mm的茎段增殖率与5mm和10mm的增殖率无显著差异，因此采用2mm的茎段可获得更多的无菌外植体。
在贝母组织培养中多采用20℃恒温培养，该温度条件下虽然可以诱导小鳞茎发生，但小鳞茎分化增殖的速度十分缓慢约需60-90天左右，本发明采用低温预处理显著提高了鳞茎分化增殖的速度，培养30天即可分化产生大量的小鳞茎。同时配合使用适宜的基本培养基和激素配比，小鳞茎不经过愈伤组织阶段从鳞片的切口处直接产生，分化率高且遗传稳定。
在小鳞茎继代扩繁时，以小鳞茎的鳞瓣横切和纵切均可诱导产生新的小鳞茎。此外采用4℃低温处理试管鳞茎40d左右即可打破休眠，休眠芽抽生成苗，采用其茎段作为继代繁殖的材料，可进一步提高繁殖效率。
附图说明
图1为不同外植体55d诱导小鳞茎的情况：a为萌发休眠芽；b为茎段；c为叶片；d为内层鳞片；e为休眠芽；
图2为不同茎段大小培养30d诱导小鳞茎的情况：a为2mm茎段；b为5mm茎段；c为1cm茎段；
图3为不同培养基茎段30d生长情况：a为Bmy1；b为Bmy4；c为BmJ1；d为BmJ2；
图4为不同物理性质培养基对小鳞茎诱导增殖的影响：a为固体培养；b为液体培养；
图5为不同培养温度对小鳞茎诱导增殖的影响：a为25℃处理；b为20℃处理；
图6为不同切割方式对小鳞茎继代增殖的影响：a为横切上部、b为大瓣横切下部、c为中瓣纵切、d为鳞茎的继代扩繁；
图7为再生鳞茎成苗及生根：a为萌动抽芽；b为生根；c为成苗。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。
一种甘肃贝母离体培养直接发生小鳞茎的方法，包括如下步骤：
步骤一、初代培养：
（1）外植体的预处理：
将储存于4℃的甘肃贝母鳞茎取出，用软毛刷轻轻将鳞茎表面刷洗干净，弃去最外层鳞茎，保留内层鳞片及休眠芽，流水冲洗20-30min；
（2）外植体的灭菌：
将预处理干净的材料先用75%乙醇浸泡10-30s，再用0.1%升汞浸泡30-60s，期间不断震荡，无菌水冲洗3-5次，最后在无菌滤纸上吸干材料表面水分；
（3）外植体培养：
将灭菌后的休眠芽和内层鳞片分别接种于1/2MS+6-BA0.5-1.0mg/L+NAA0.1-1.0mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH5.8的培养基中，接种后将培养物置于20℃的恒温培养箱中黑暗培养7-8周，诱导出试管鳞茎；
或将灭菌后的休眠芽接种于1/2MS+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH5.8的培养基中，在20℃、光照强度1000-2000lux条件下光照12h/d至萌发形成无菌苗，将无菌苗的茎段切成0.2-1cm的小段接种于1/2MS+6-BA0.2-1.0mg/L+NAA0.1-1.0mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH5.8的培养基中，诱导产生小鳞茎；
步骤二、继代培养：
将步骤一得到的再生鳞茎取出，先分为4-6mm的大瓣和2-4mm的中瓣，将大瓣横切，中瓣纵切，然后分别接种于1/2MS+6-BA0.2-1.0mg/L+NAA0.1-1.0mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH5.8培养基中，接种后将培养物置于10℃的恒温培养箱中黑暗培养14d，再转入20-25℃的恒温培养箱中黑暗培养16d，获得小鳞茎；
步骤三、打破小鳞茎休眠：
将步骤二得到的小鳞茎置于4℃下储藏40d-60d打破休眠，萌发产生黄色嫩芽；
步骤四、小鳞茎生根培养：
将步骤三的到的小鳞茎转入生根培养基1/2MS+NAA0.1mg/L+IAA0.5mg/+1.5%蔗糖+0.7%琼脂pH5.8，20℃、光照强度1500-2200lx下光照12h/d，5-9d黄色嫩芽迅速转绿，30d后小鳞茎基部有根产生。
1 试验材料：
本试验所选用的甘肃贝母(Fritillaria przewalskii Maxim.)采挖于甘肃漳县，于4℃冰箱覆土保存，备用。
2 试验方法和结果：
2.1初代培养
2.1.1外植体的预处理
将储存于4℃的甘肃贝母鳞茎取出，用软毛刷轻轻将鳞茎表面刷洗干净，弃去最外层鳞茎，保留内层鳞片及休眠芽，流水冲洗20-30min。
2.1.2外植体的灭菌
植物组织培养的材料不同，培养效果不同，查阅文献发现贝母组织培养使用最多的外植体是外层鳞茎，但外层鳞茎结构特殊且生长于地下，鳞茎表面携带大量微生物，其灭菌难度非常大，材料的污染率高，成活率低。
本发明将预处理干净的材料先用70%乙醇浸泡，再用0.1%升汞浸泡，期间不断震荡，无菌水冲洗3-5次，最后在无菌滤纸上吸干材料表面水分，用镊子轻轻剥取灭菌后的内层鳞片和休眠芽，分别接种于1/2MS+3%蔗糖+0.7%琼脂，pH5.8的培养基中。每个处理接种10瓶，每瓶3个外植体，接种后将培养基置于20℃的恒温培养箱中黑暗培养1周。观察外植体的生长状况并记录休眠芽和内层鳞片污染率，筛选适宜的材料灭菌方法。
污染率（%）=（污染数／接种总数）×100％
以75%乙醇和0.1%的升汞为灭菌剂，通过不同灭菌时间处理，筛选最佳组合。由表1可知，各处理对内层鳞片灭菌效果差异不明显，但休眠芽灭菌效果存在差异，用75%乙醇灭菌30s，0.1%升汞灭菌1min，无菌水冲洗3-5次，休眠芽的污染率为0，是休眠芽适宜的灭菌方法。
2.1.3不同种类的外植体对诱导小鳞茎的影响
外植体的种类对贝母组织培养有重要影响，本试验以内层鳞片、休眠芽、茎段和叶片（取自休眠芽接种于1/2MS培养基萌发产生的幼苗）4种不同的外植体，接种于Bmy4培养基中，培养条件同2.1.2，观察统计外植体的诱导率、增殖倍数和小鳞茎生长情况。
诱导率=(产生再生鳞茎外植体个数/接种数)×100％
增殖倍数=再生鳞茎总数/接种外植体总数
由表2可知，休眠芽与内层鳞片、茎段的小鳞茎的诱导率无显著性差异，但与叶片之间诱导率差异显著。休眠芽与其它外植体的增殖倍数存在显著性差异，内层鳞片、茎段和叶片的增殖倍数均无显著性差异。其中，休眠芽的诱导率和增殖倍数最高，分别为92.2%和2.932。因此，休眠芽诱导效果最好，其次为内层鳞片和茎段，叶片诱导效果一般。此外，在试验中发现休眠芽、茎段、内层鳞片为外植体接种30d后在外植体基部产生白色小突起，逐渐长成小鳞茎，且再生鳞茎大小多集中在2mm-5mm，形态完整饱满，与自然状态下生长的贝母十分相似（见图1）。因此，休眠芽、内层鳞片、茎段都可以作为较好的外植体选择。
2.1.4不同培养基对休眠芽诱导小鳞茎的影响
设置4种不同激素配比的培养基，分别为(Bmy1:1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH5.8);(Bmy2: 1/2MS+BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH5.8);(Bmy3:1/2MS+6-BA0.5mg/L +NAA0.5mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH5.8);(Bmy4:1/2MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH5.8)，将休眠芽分别接种于上述4种培养基中诱导小鳞茎，其中1/2MS均为大量元素减半。培养条件同2.1.2。
休眠芽在培养30d以后开始逐渐诱导产生小鳞茎，培养60天左右统计其小鳞茎数量及大小（直径），统计结果如表3所示。各处理小鳞茎诱导率均为100%，增殖倍数无显著性差异，其中Bmy1和Bmy4小鳞茎增殖倍数最高，分别为2.0和2.30，小鳞茎的大小多集中于2-3mm之间。因此，1/2MS+6-BA1.0 mg/L+NAA1.0 mg/L和1/2MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.1 mg/L的固体培养基上更适合甘肃贝母休眠芽的诱导分化。
2.1.5不同茎段大小对甘肃贝母直接再生鳞茎的影响
由不同外植体试验发现休眠芽萌发产生的幼苗茎段也是良好的外植体，茎段作为外植体具有材料易得、可分割为多个外植体、无污染等优点。故探究不同外植体大小对小鳞茎诱导的影响。
将获得的无菌茎段在超净工作台上切割为2mm、5mm、1cm左右大小，分别接种于Bmy1培养基，培养条件2.1.2。
由表4和图2可知不同茎段大小对贝母诱导再生小鳞茎无显著性差异，因此，为了获得更多的外植体，提高繁殖效率，可以选用2mm茎段为外植体。
2.1.6不同培养基对茎段诱导小鳞茎的影响
选择4种不同激素配比的培养基，分别为(BmJ1:1/2MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.5mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH5.8);(BmJ2: 1/2MS+KT1.0mg/L+NAA0.5mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH5.8);(Bmy1:1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH5.8);(Bmy4:1/2MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH5.8)，将1cm左右的无菌茎段分别接种于上述4种培养基中，培养条件2.1.2。
由表5和图3可知，不同激素配比的培养基诱导小鳞茎有显著性差异，Bmy1、Bmy4和BmJ1的培养效果显著性高于BmJ2，说明6-BA和NAA配合更有利于小鳞茎的直接产生。其中Bmy1和BmJ1均为茎段诱导小鳞茎的适宜培养基。
2.2继代培养
目前，大多文献都采用固体培养基和恒温培养条件，有关液体培养和变温试验鲜见报道，故本试验设计了不同的培养方式，进行固液对照以及变温处理，以观察对贝母组织培养小鳞茎增殖的影响。
2.2.1培养基物理状态对继代培养的影响
以4℃存储的再生鳞茎为外植体，分别接种于固体培养基（Bmy1）和液体培养基中（Bmy1不加琼脂）。固体培养基培养条件同2.1.2，液体培养基为20℃、110r/min、黑暗培养，及时观察生长情况并做好记录。
表6和图4可以看出固体培养的效果较好，增殖倍数和诱导率均较高，在培养过程中发现液体培养基逐渐变黄，基本无再生小鳞茎，故在培养30d后停止了液体培养。因此，固体培养基是适宜的小鳞茎诱导的培养基。
2.2.2温度对继代培养的影响
将再生鳞茎接种于固体培养基Bmy1中。将接种好的材料先放置于10℃恒温培养箱黑暗培养两周，再分别转入20℃和25℃的恒温培养箱黑暗培养，按时观察生长状况并做好记录。
由表7看两处理间存在显著性差异，10-25℃处理的再生鳞茎培养30d即在基部产生大量1mm左右的白色小鳞茎，而10-20℃的处理在30d时只有部分在基部产生小鳞茎，培养到55d时进入了鳞茎增殖高峰，产生较多再生鳞茎。10-25℃处理诱导率可达到100%，增殖倍数高达4.967。由此说明，较大的温度变化有利于甘肃贝母继代扩繁。并且从图5a发现对贝母外植体进行适当的低温处理，再转入正常温度培养，相较直接放入20℃培养，其褐化现象也不明显。
2.2.3切割方式对继代增殖的影响
经培养发现25℃温度处理培养效果较好，故将此培养材料进行继代扩繁，将再生鳞茎分为大（4-6mm）、中（2-4mm）、小（1mm左右），将大瓣横切，中瓣纵切，分别接种于Bmy1培养基。先将上述材料放于10℃恒温培养箱黑暗培养两周，再转接于25℃恒温培养箱黑暗培养，定时观察并做好统计。
由表8可知继代培养过程中，鳞片切割方式对组织培养有一定的影响，大瓣横切下部诱导效果较好，可在基部直接产生小鳞茎。试验发现大瓣横切上部、纵切中瓣由于其形态学下部有伤口产生，尤其纵切中瓣易产生少量愈伤，多为黄色愈伤组织，有轻度褐化（见图6）。从诱导率和增殖倍数来看，继代培养中瓣纵切，大瓣横切都可以进行较好的继代扩繁。
2.3小鳞茎萌发及生根成苗
由于再生小鳞茎存在休眠现象，故采用4℃低温处理打破休眠。当50d时小鳞茎上抽出黄色嫩芽，转入生根培养基Bmg2:(1/2MS+NAA0.1mg/L+IAA0.5mg/+1.5%蔗糖+0.7%琼脂pH5.8)中生根成苗，培养条件为20℃、光照12h/d，光照强度1500-2200lx。
继代增殖获得的小鳞茎置于在4℃种子保存柜中储藏50d后，鳞茎中间抽出嫩芽，开始萌动。将其转入生根培养基（1/2MS+NAA0.1mg/L+IAA0.5mg/+1.5%蔗糖+0.7%琼脂pH5.8）中，于20℃下培养，1周左右芽迅速转绿并伸长生长形成幼苗，30d后小鳞茎基部开始有根产生（见图7）。
Claims (2)
1.一种甘肃贝母离体培养直接发生小鳞茎的方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤一、初代培养：
（1）外植体的预处理：
将储存于4℃的甘肃贝母鳞茎取出，用软毛刷轻轻将鳞茎表面刷洗干净，弃去最外层鳞茎，保留内层鳞片及休眠芽，流水冲洗20-30min；
（2）外植体的灭菌：
将预处理干净的材料先用75%乙醇浸泡10-30s，再用0.1%升汞浸泡30-60s，期间不断震荡，无菌水冲洗3-5次，最后在无菌滤纸上吸干材料表面水分；
（3）外植体培养：
将灭菌后的休眠芽和内层鳞片分别接种于1/2MS+6-BA0.5-1.0mg/L+NAA0.1-1.0mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH5.8的培养基中，接种后将培养物置于20℃的恒温培养箱中黑暗培养7-8周，诱导出试管鳞茎；或将灭菌后的休眠芽接种于1/2MS+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH5.8的培养基中，在20℃、光照强度1000-2000lux条件下光照12h/d至萌发形成无菌苗，将无菌苗的茎段切成0.2-1cm的小段接种于1/2MS+6-BA0.2-1.0mg/L+NAA0.1-1.0mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH5.8的培养基中，诱导产生小鳞茎；
步骤二、继代培养：
将步骤一得到的再生鳞茎取出，先分为4-6mm的大瓣和2-4mm的中瓣，将大瓣横切，中瓣纵切，然后分别接种于培养基中，接种后将培养物置于10℃的恒温培养箱中黑暗培养14d，再转入20-25℃的恒温培养箱中黑暗培养16d，获得小鳞茎；
步骤三、打破小鳞茎休眠：
将步骤二得到的小鳞茎置于4℃下储藏40d-60d打破休眠，萌发产生黄色嫩芽；
步骤四、小鳞茎生根培养：
将步骤三得到的小鳞茎转入生根培养基1/2MS+NAA0.1mg/L+IAA0.5mg/+1.5%蔗糖+0.7%琼脂pH5.8，20℃、光照强度1500-2200lx下光照12h/d，5-9d黄色嫩芽迅速转绿，30d后小鳞茎基部有根产生。
2.如权利要求1所述甘肃贝母离体培养直接发生小鳞茎的方法，其特征在于：步骤二中所述再生鳞茎的大瓣和中瓣的培养基采用1/2MS+6-BA0.2-1.0mg/L+NAA0.1-1.0mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH5.8。
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