CN104957037A - 甘肃贝母试管小鳞茎培育的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甘肃贝母试管小鳞茎培育的方法，以解决现有贝母培养方法存在的诱导率低、培养周期长、步骤繁琐的问题。它包括以下步骤：选择外植体将贝母掰成鳞瓣和鳞心，对外植体消毒，然后对外植体进行诱导，具体诱导方法是，将灭菌后的外植体接种于诱导培养基中，在温度为16-25℃，黑暗条件下培养，在鳞心或鳞瓣的基部诱导出原球茎；对于鳞心，诱导培养基包括如下配方:1/2MS基本培养液、蔗糖50-80g/L、活性炭2-5g/L、琼脂5-6g/L、精氨酸500-2000mg/L、玉米素（ZT）1-5mg/L、油菜素内酯（BR）0.1-0.5mg/L、茉莉酸甲酯（MEJA）1-5mg/L；对于鳞瓣，激素配方不同于鳞心，培养基的pH值为5.5-6.5。本发明方法具有繁殖速度快、培养周期短、扩繁率高、方便移栽、既可作种鳞茎栽培、又可作商品使用的特点。
Description
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体的说，是通过细胞工程的手段直接培育试管小鳞茎的方法。
背景技术
甘肃贝母(Fritillaria przewalskii)为百合科贝母属植物的干燥鳞茎,主产甘肃、青海、四川等省,与川贝母(F. cirrhosa)、暗紫贝母(F. unibracteata)和梭砂贝母(F. delavayi)通称川贝母,为多年生草本。
甘肃贝母属早春短命植物，株高20—45 cm，地上部分生长期短，仅60—90 d。从种子萌发到开花结果一般需要4—6年，种子存在形态和生理双重后熟作用，打破休眠困难，自然萌发率和繁殖效率很低。
人工栽培很困难，生长周期长，商品药材全靠采挖野生资源，连年过度采挖，资源日趋减少并面临枯竭。因此，利用组织培养繁殖和保护甘肃贝母资源具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种甘肃贝母试管小鳞茎培育的方法，以解决现有贝母培养方法存在的诱导率低、培养周期长、步骤繁琐的问题。
本发明技术方案如下：一种甘肃贝母试管小鳞茎培育的方法，包括以下步骤：选择外植体将贝母掰成鳞瓣和鳞心，对外植体消毒，然后对外植体进行诱导，具体诱导方法是，将灭菌后的外植体接种于诱导培养基中，在温度为16-25℃，黑暗条件下培养，在鳞心或鳞瓣的基部诱导出原球茎；
对于鳞心，诱导培养基包括如下配方: 1/2MS基本培养液、蔗糖50-80g/L、活性炭2-5g/L、琼脂5-6g/L、精氨酸500-2000mg/L、玉米素（ZT）1-5mg/L、油菜素内酯（BR）0.1-0.5mg/L、茉莉酸甲酯（MEJA）1-5mg/L；
对于鳞瓣，诱导培养基包括如下配方: 1/2MS基本培养液、蔗糖50-80g/L、活性炭2-5g/L、琼脂5-6g/L、精氨酸500-2000mg/L、玉米素（ZT）1-5mg/L、油菜素内酯 （BR）0.1-0.5mg/L、
茉莉酸甲酯（MEJA）1-5mg/L、吲哚乙酸（IAA）2-4mg/L；培养基的pH值为5.5-6.5。
另一方式的甘肃贝母试管小鳞茎培育的方法，包括以下步骤：选择外植体将贝母掰成鳞瓣和鳞心，对外植体消毒，然后对外植体进行诱导，具体诱导方法是，将灭菌后的外植体接种于诱导培养基中，在温度为16-25℃，黑暗条件下培养，在鳞心或鳞瓣的基部诱导出原球茎；
对于鳞心，诱导培养基包括如下配方: 1/2MS基本培养液、蔗糖50-80g/L、活性炭2-5g/L、琼脂5-6g/L、精氨酸500-2000mg/L、玉米素（ZT）1-5mg/L、油菜素内酯（BR）0.1-0.5mg/L、萘乙酸（NAA）或吲哚乙酸（IAA）2-4mg/L；
对于鳞瓣，诱导培养基包括如下配方:1/2MS基本培养液、蔗糖50-80g/L、活性炭2-5g/L、琼脂5-6g/L、精氨酸500-2000mg/L、玉米素（ZT）1-5mg/L、油菜素内酯 （BR）0.1-0.5mg/L、茉莉酸甲酯（MEJA）1-5mg/L、水杨酸(SA) 10-30mg/L；培养基的pH值为5.5-6.5。
另一方式的甘肃贝母试管小鳞茎培育的方法，包括以下步骤：选择外植体将贝母掰成鳞瓣和鳞心，对外植体消毒，然后对外植体进行诱导，具体诱导方法是，将灭菌后的外植体接种于诱导培养基中，在温度为16-25℃，黑暗条件下培养，在鳞心或鳞瓣的基部诱导出原球茎；
对于鳞心，诱导培养基包括如下配方: 1/2MS基本培养液、蔗糖50-80g/L、活性炭2-5g/L、琼脂5-6g/L、精氨酸500-2000mg/L、玉米素（ZT）1-5mg/L、油菜素内酯（BR）0.1-0.5mg/L、水杨酸(SA) 10-30mg/L；
对于鳞瓣，诱导培养基包括如下配方: 1/2MS基本培养液、蔗糖50-80g/L、活性炭2-5g/L、琼脂5-6g/L、精氨酸500-2000mg/L、玉米素（ZT）1-5mg/L、油菜素内酯（BR）0.1-0.5mg/L、茉莉酸甲酯（MEJA）1-5mg/L、萘乙酸（NAA）2-4mg/L；培养基的pH值为5.5-6.5。
优选的，上述的甘肃贝母试管小鳞茎培育的方法，还包括原球茎的生长与膨大步骤，将诱导出的原球茎接种于下列生长膨大培养基中，在温度为13-20℃，黑暗条件下培养，原球茎逐渐生长膨大；具体培养基配方见下：MS基本培养液、蔗糖50-80g/L、活性炭2-5g/L、琼脂5-6g/L、酸水解酪蛋白500-2000mg/L、酵母提取物500-2000mg/L、水杨酸(SA) 30-50mg/L、油菜素内酯（BR）0.1-0.5mg/L、吲哚乙酸（IAA）或萘乙酸（NAA）2-4mg/L；培养基中pH值为5.5-6.5。
优选的，上述的甘肃贝母试管小鳞茎培育的方法，它还包括原球茎的生长与膨大步骤，将诱导出的原球茎接种于下列生长膨大培养基中，在温度为13-20℃，黑暗条件下培养，原球茎逐渐生长膨大；具体培养基配方见下：MS基本培养液、蔗糖50-80g/L、活性炭2-5g/L、琼脂5-6g/L、酸水解酪蛋白500-2000mg/L、酵母提取物500-2000mg/L、水杨酸(SA) 30-50mg/L、烯效唑（S-3307）2-6mg/L、吲哚乙酸（IAA）或萘乙酸（NAA）2-4mg/L；培养基中pH值为5.5-6.5。
优选的，上述外植体的选择步骤是于当年6月前后开花期采挖新鲜的开花贝母，在-2℃—4℃低温条件下贮藏。为防治内生菌及伤口深源菌污染，外植体消毒步骤采用二次消毒法，外植体表面消毒前先使用内吸性杀菌剂或0.3%的生汞浸泡20-30min，期间不断震荡摇晃，用灭菌蒸馏水冲洗干净，间隔2-3天，再用0.3%的生汞浸泡20min，期间不断震荡摇晃，用灭菌蒸馏水冲洗干净；内吸性杀菌剂选自嘧菌酯、恶霉灵和农用链霉素的混合物质。
优选的，对原球茎生长膨大的试管小鳞茎进行贮藏方法是：采收上述培养的试管小鳞茎，既可作为商品又可作为原种用于大田生产。收获的试管小鳞茎可直接播种，播后叶片从小鳞瓣上长出。在零下2℃-5℃贮藏3-5个月，或在8-15℃贮藏2-3个月，零下2℃-5℃贮藏2-3个月后播种，播后叶片可从心芽发生，而且发芽率随试管小鳞茎大小的增加而增加。
本发明选取甘肃贝母鳞瓣或鳞心为外植体，研究了外植体的消毒方法，不同培养阶段培养基的组成、激素的搭配及添加浓度、培养条件等对小鳞茎再生体系建立的影响。对于鳞心，培养基中，细胞分裂素ZT，油菜素内酯BR，分别和四种有机酸（MEJA、NAA、IAA、SA）搭配的三激素组合。对于鳞瓣，培养基中，细胞分裂素ZT，油菜素内酯BR，茉莉酸甲酯MEJA，分别和三种有机酸（NAA，IAA、SA）搭配的四激素组合都能诱导出原球茎，鳞瓣能诱导出1-3个不等的原球茎，鳞心能诱导出2-5个不等的原球茎，原球茎大小为1-3mm。
生长素（吲哚乙酸或萘乙酸）和水杨酸分别于油菜素内酯或烯效唑搭配都能促进原球茎的生长，原球茎大小3-5mm，个别能达到8mm左右。
本发明的目的是建立一个试管小鳞茎繁育体系，直接诱导小鳞茎发生、膨大，有别于传统的诱导不定芽、不定芽继代、诱导生根、炼苗移栽的组培体系。试管小鳞茎即可作为繁殖材料大田栽培，也可直接作为商品。此方法具有繁殖速度快、培养周期短、扩繁率高、方便移栽、既可作种鳞茎栽培、又可作商品使用的特点。与传统的试管苗诱导，炼苗移栽方法相比，具有成本低、方便运输、操作简便、培养时间短、扩繁率高等优点。
具体实施方式
下面的实施例可以进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1-16：原球茎的诱导：
以鳞心为外植体，消毒完后接种于下列培养基中，在黑暗条件下于22℃在基础培养基（1/2MS、蔗糖50g/L、活性炭3g/L、琼脂6g/L、精氨酸1000mg/L）并添加不同激素的条件下进行培养，不同激素的配比参见表1，培养基的pH值为6.0。
通过以上实施例的配方看出，随着玉米素浓度的增加，诱导率逐渐加大，但玉米素3mg/L和5mg/L差异不大，而且5mg/L产生一定的畸形；随着油菜素内酯的增加，诱导率差异不大，但随着油菜素内酯浓度的增加，原球茎的横径有增加的趋势，但油菜素内酯浓度达到0.5mg/L时，诱导起始的速度有减慢的趋势；随着茉莉酸甲酯浓度的增加，诱导率逐渐提高，但高浓度的茉莉酸甲酯5mg/L开始有降低生长速度的趋势；随着水杨酸浓度的增加，诱导率逐渐提高，但高浓度的水杨酸能导致褐化率的升高。
实施例16-25：原球茎的诱导：
以鳞瓣为外植体，消毒完后接种于下列培养基中，在黑暗条件下于22℃在基础培养基（1/2MS、蔗糖50g/L、活性炭3g/L、琼脂6g/L、精氨酸1000mg/L）并添加不同激素的条件下进行培养，不同激素的配比参见表2，培养基的pH值为6.5。
实施例26、原球茎的诱导：与实施例2不同之处在于：
以鳞心为外植体，在黑暗条件下于25℃培养，培养基的pH值为5.5。
实施例27、原球茎的诱导：与实施例2不同之处在于：
以鳞心为外植体，在黑暗条件下于16℃培养。
实施例28、原球茎的诱导：与实施例17不同之处在于：
以鳞瓣为外植体，在黑暗条件下于25℃培养。
实施例29、原球茎的诱导：与实施例17不同之处在于：
以鳞瓣为外植体，在黑暗条件下于16℃培养。
实施例30、原球茎的诱导：
以鳞瓣为外植体，消毒完后接种于下列培养基中，在黑暗条件下于22℃在基础培养基（1/2MS、蔗糖80g/L、活性炭5g/L、琼脂5g/L、精氨酸2000mg/L）并添加不同激素的条件下进行培养，玉米素（ZT）5mg/L、油菜素内酯 （BR）0.5mg/L、茉莉酸甲酯（MEJA）5mg/L、水杨酸(SA) 20mg/L；培养基的pH值为6.0。
实施例31、原球茎的诱导：
以鳞瓣为外植体，消毒完后接种于下列培养基中，在黑暗条件下于22℃在基础培养基（1/2MS、蔗糖50g/L、活性炭2g/L、琼脂6g/L、精氨酸500mg/L）并添加不同激素的条件下进行培养，玉米素（ZT）1mg/L、油菜素内酯 （BR）0.1mg/L、茉莉酸甲酯（MEJA）1mg/L、萘乙酸（NAA）3mg/L；培养基的pH值为6.0。
实施例32、原球茎的诱导：
以鳞瓣为外植体，消毒完后接种于下列培养基中，在黑暗条件下于22℃在基础培养基（1/2MS、蔗糖50g/L、活性炭3g/L、琼脂6g/L、精氨酸1000mg/L）并添加不同激素的条件下进行培养，玉米素（ZT）5mg/L、油菜素内酯 （BR）0.3mg/L、茉莉酸甲酯（MEJA）3mg/L、吲哚乙酸（IAA）3mg/L；培养基的pH值为6.0。
上述实施例的培养基都能诱导出原球茎，鳞心的诱导能力明显高于鳞瓣，每个鳞心大约能诱导出3-5个原球茎，而每鳞瓣大约诱导出1-3个原球茎。综合考虑，以鳞心为外植体，选用方案1-16，以鳞瓣为外植体，因其自身内在激素含量较低，选用方案16-25，除此之外，以鳞瓣为外植体诱导率的大小还受鳞瓣自身大小、厚度、是否有伤斑等因素的影响。
上述实施例的方案，在不同温度培养条件下，原球茎的形成速度不同，22℃形成速度最快，大约20天左右就开始形成，25℃和16℃形成速度差异不大，大约35天左右开始形成。
《对照试验》以鳞心或鳞瓣为外植体，消毒完后接种于下列培养基中，在黑暗条件下，于22℃，在下述培养基中培养。
对照例1. 1/2MS、蔗糖50g/L、活性炭3g/L、琼脂6g/L、精氨酸1000mg/L、玉米素（ZT）3mg/L、油菜素内酯（BR）0.3mg/L、萘乙酸（NAA）0.5mg/L。
对照例2. 1/2MS、蔗糖50g/L、活性炭3g/L、琼脂6g/L、精氨酸1000mg/L、玉米素（ZT）3mg/L、油菜素内酯（BR）0.3mg/L、萘乙酸（NAA）5mg/L。
对照例3. 1/2MS、蔗糖50g/L、活性炭3g/L、琼脂6g/L、精氨酸1000mg/L、玉米素（ZT）3mg/L、油菜素内酯（BR）0.3mg/L、吲哚乙酸（IAA）0.5mg/L。
对照例4. 1/2MS、蔗糖50g/L、活性炭3g/L、琼脂6g/L、精氨酸1000mg/L、玉米素（ZT）3mg/L、油菜素内酯（BR）0.3mg/L、吲哚乙酸(IAA)5mg/L。
由上述对照1-4实验配方看出，低浓度的生长素（吲哚乙酸、萘乙酸）0.5mg/L，原球茎形态细长，有向叶芽发展的趋势，随着萘乙酸浓度的增加，形态逐渐向扁胖的原球茎发展，但高浓度的生长素5mg/L会抑制原球茎的发生，造成畸形、褐化、玻璃化现象。
实施例33-38、原球茎的生长与膨大
将上述实施例诱导产生的材料转接入下述基本培养基（MS、蔗糖80g/L、活性炭3g/L、琼脂6g/L、水解酪蛋白500mg/L、酵母提取物500mg/L），添加不同激素的膨大培养基，具体配方见表3，在黑暗条件下于16℃培养，培养基的pH值为6.0。
实施例33-38看出，低浓度的水杨酸在促进膨大的同时还会产生新的原球茎，随着水杨酸浓度的增加，膨大效果逐渐增加，但高浓度的水杨酸对外植体产生毒害，褐化增加；随着烯效唑浓度的增加，膨大效果逐渐增加，但生长速度变慢、褐化现象和玻璃化现象增加。
实施例39、原球茎的生长与膨大
将上述实施例诱导产生的材料转接入下述基本培养基（MS、蔗糖60g/L、活性炭5g/L、琼脂6g/L、水解酪蛋白2000mg/L、酵母提取物2000mg/L），添加不同激素的膨大培养基，水杨酸(SA)40mg/L、油菜素内酯（BR）0.5mg/L、烯效唑（S-3307）4mg/L、吲哚乙酸（IAA）4mg/L；培养基中pH值为5.5-6.5。在黑暗条件下于20℃培养，培养基的pH值为6.0。
实施例40、原球茎的生长与膨大
将上述实施例诱导产生的材料转接入下述基本培养基（MS、蔗糖50g/L、活性炭2g/L、琼脂5g/L、水解酪蛋白1000mg/L、酵母提取物1000mg/L），添加不同激素的膨大培养基，水杨酸(SA)40mg/L、油菜素内酯（BR）0.1mg/L、吲哚乙酸（IAA）2mg/L；培养基中pH值为5.5-6.5。在黑暗条件下于13℃培养，培养基的pH值为6.0。
实施例41、原球茎的生长与膨大
将上述实施例诱导产生的材料转接入下述基本培养基（MS、蔗糖50g/L、活性炭2g/L、琼脂5g/L、水解酪蛋白1000mg/L、酵母提取物1000mg/L），添加不同激素的膨大培养基，水杨酸(SA)40mg/L、油菜素内酯（BR）0.3mg/L、烯效唑（S-3307）4mg/L、萘乙酸（NAA）4mg/L；培养基中pH值为5.5-6.5。在黑暗条件下于13℃培养，培养基的pH值为6.0。
实施例42、原球茎的生长与膨大
将上述实施例诱导产生的材料转接入下述基本培养基（MS、蔗糖50g/L、活性炭2g/L、琼脂5g/L、水解酪蛋白1000mg/L、酵母提取物1000mg/L），添加不同激素的膨大培养基，水杨酸(SA)40mg/L、油菜素内酯（BR）0.3mg/L、萘乙酸（NAA）2mg/L；培养基中pH值为5.5-6.5。在黑暗条件下于13℃培养，培养基的pH值为6.0。
上述实施例，不同温度培养条件下，原球茎的生长速度不同，16℃生长速度最快，13℃和20℃形成速度差异不大。
上述实施例都能诱导原球茎的生长和膨大，但以鳞瓣为外植体诱导的原球茎生长速度明显快于以鳞心为外植体诱导的原球茎，培养60天统计，前者直径可达到4-5mm，个别能达到8mm，后者只有3mm左右，可见，母体贮藏营养的转移是原球茎生长膨大的营养条件的主要来源。
实施例43、外植体的采挖与贮藏：每年六月前后在甘肃岷县采挖野生开花的贝母，将茎杆拔去，取鳞茎直接用于试验。
实施例44、外植体的采挖与贮藏：每年六月前后在甘肃岷县采挖野生开花的贝母，将茎杆拔去，2℃条件下保湿贮藏。
实施例45、外植体的采挖与贮藏：每年六月前后在甘肃岷县采挖野生开花的贝母，将茎杆拔去，室温条件下保湿贮藏。
实施例46、外植体的采挖与贮藏：每年六月前后在甘肃岷县采挖野生开花的贝母，将茎杆拔去，零下2℃条件下贮藏。
实施例47、外植体的采挖与贮藏：每年六月前后在甘肃岷县采挖野生开花的贝母，将茎杆拔去，4℃条件下保湿贮藏。
分析：新鲜的贝母组培效果最好，随着室温贮藏时间的延长，组培效率逐渐降低；随着2℃条件下贮藏时间的延长，组培效率呈现先下降后上升的趋势。上述现象的发生，可能是由于6月采挖时，贝母正处于旺盛生长期，随着采后贮藏时间的延长，逐渐进入休眠期；室温贮藏无法打破休眠，而2℃低温贮藏，随着贮藏时间的延长，可以逐渐打破休眠。
实施例48、外植体的消毒：0.3%的生汞消毒20min。
实施例49、外植体的消毒：1000倍液的农用链霉素和恶霉灵浸泡30min，冲洗干净，0.3%的生汞消毒20min。
实施例50、外植体的消毒：1000倍液的农用链霉素和恶霉灵浸泡30min，冲洗干净，0.3%的生汞消毒20min，间隔两天，在用0.3%的生汞消毒20min。
实施例51、外植体的消毒：0.3%的生汞消毒20min，间隔两天，在用0.3%的生汞消毒20min，培养基中添加商品杀菌剂益培隆0.01%。
实施例52、外植体的消毒：外植体消毒步骤采用二次消毒法，外植体表面消毒前先使用嘧菌酯或0.3%的生汞浸泡30min，期间不断震荡摇晃，用灭菌蒸馏水冲洗干净，间隔3天，再用0.3%的生汞浸泡20min，期间不断震荡摇晃，用灭菌蒸馏水冲洗干净；
外植体消毒效果依次为实施例51>50>49>48，但实施例51有抑制生长的现象发生。
实施例53、试管小鳞茎的贮藏：将上述实施例33-42得到的试管小鳞茎贮藏在不同的条件下：草炭土、珍珠岩、蛭石3：1：1混合，室温保存。
实施例54、试管小鳞茎的贮藏：将上述实施例33-42得到的试管小鳞茎贮藏在不同的条件下：草炭土、珍珠岩、蛭石3：1：1混合，零下1℃贮藏5个月。
实施例55、试管小鳞茎的贮藏：将上述实施例33-42得到的试管小鳞茎贮藏在不同的条件下：草炭土、珍珠岩、蛭石3：1：1混合，8℃贮藏3个月，零下2℃贮藏2个月。
实施例56、试管小鳞茎的贮藏：在5℃条件下贮藏3个月。
实施例57、试管小鳞茎的贮藏：在15℃条件下贮藏3个月。
上述贮藏方法中，随着贮藏时间的延长，试管小鳞茎都会逐渐变小。实施例53中，较大的试管小鳞茎会长出叶片，但叶片是由小鳞瓣长出，而非心芽长出。实施例54和55，随着贮藏时间的延长都有部分腐烂现象，贮藏后置于18℃条件下生长，较大的试管小鳞茎可以由心芽产生叶片。
Claims (9)
1.一种甘肃贝母试管小鳞茎培育的方法，其特征在于它包括以下步骤：选择外植体将贝母掰成鳞瓣和鳞心，对外植体消毒，然后对外植体进行诱导，具体诱导方法是，将灭菌后的外植体接种于诱导培养基中，在温度为16-25℃，黑暗条件下培养，在鳞心或鳞瓣的基部诱导出原球茎；
对于鳞心，诱导培养基包括如下配方: 1/2MS基本培养液、蔗糖50-80g/L、活性炭2-5g/L、琼脂5-6g/L、精氨酸500-2000mg/L、玉米素1-5mg/L、油菜素内酯0.1-0.5mg/L、茉莉酸甲酯1-5mg/L；
对于鳞瓣，诱导培养基包括如下配方: 1/2MS基本培养液、蔗糖50-80g/L、活性炭2-5g/L、琼脂5-6g/L、精氨酸500-2000mg/L、玉米素1-5mg/L、油菜素内酯0.1-0.5mg/L、茉莉酸甲酯1-5mg/L、吲哚乙酸2-4mg/L；培养基的pH值为5.5-6.5。
2.一种甘肃贝母试管小鳞茎培育的方法，其特征在于它包括以下步骤：选择外植体将贝母掰成鳞瓣和鳞心，对外植体消毒，然后对外植体进行诱导，具体诱导方法是，将灭菌后的外植体接种于诱导培养基中，在温度为16-25℃，黑暗条件下培养，在鳞心或鳞瓣的基部诱导出原球茎；
对于鳞心，诱导培养基包括如下配方: 1/2MS基本培养液、蔗糖50-80g/L、活性炭2-5g/L、琼脂5-6g/L、精氨酸500-2000mg/L、玉米素1-5mg/L、油菜素内酯0.1-0.5mg/L、萘乙酸或吲哚乙酸2-4mg/L；
对于鳞瓣，诱导培养基包括如下配方:1/2MS基本培养液、蔗糖50-80g/L、活性炭2-5g/L、琼脂5-6g/L、精氨酸500-2000mg/L、玉米素1-5mg/L、油菜素内酯0.1-0.5mg/L、茉莉酸甲酯1-5mg/L、水杨酸10-30mg/L；培养基的pH值为5.5-6.5。
3.一种甘肃贝母试管小鳞茎培育的方法，其特征在于它包括以下步骤：选择外植体将贝母掰成鳞瓣和鳞心，对外植体消毒，然后对外植体进行诱导，具体诱导方法是，将灭菌后的外植体接种于诱导培养基中，在温度为16-25℃，黑暗条件下培养，在鳞心或鳞瓣的基部诱导出原球茎；
对于鳞心，诱导培养基包括如下配方: 1/2MS基本培养液、蔗糖50-80g/L、活性炭2-5g/L、琼脂5-6g/L、精氨酸500-2000mg/L、玉米素1-5mg/L、油菜素内酯0.1-0.5mg/L、水杨酸10-30mg/L；
对于鳞瓣，诱导培养基包括如下配方: 1/2MS基本培养液、蔗糖50-80g/L、活性炭2-5g/L、琼脂5-6g/L、精氨酸500-2000mg/L、玉米素1-5mg/L、油菜素内酯0.1-0.5mg/L、茉莉酸甲酯1-5mg/L、萘乙酸2-4mg/L；培养基的pH值为5.5-6.5。
4.根据权利要求1至3任意一项所述的甘肃贝母试管小鳞茎培育的方法，其特征在于：它还包括原球茎的生长与膨大步骤，将诱导出的原球茎接种于下列生长膨大培养基中，在温度为13-20℃，黑暗条件下培养，原球茎逐渐生长膨大；具体培养基配方见下：MS基本培养液、蔗糖50-80g/L、活性炭2-5g/L、琼脂5-6g/L、酸水解酪蛋白500-2000mg/L、酵母提取物500-2000mg/L、水杨酸30-50mg/L、油菜素内酯0.1-0.5mg/L、吲哚乙酸或萘乙酸2-4mg/L；培养基中pH值为5.5-6.5。
5.根据权利要求1至3任意一项所述的甘肃贝母试管小鳞茎培育的方法，其特征在于：它还包括原球茎的生长与膨大步骤，将诱导出的原球茎接种于下列生长膨大培养基中，在温度为13-20℃，黑暗条件下培养，原球茎逐渐生长膨大；具体培养基配方见下：MS基本培养液、蔗糖50-80g/L、活性炭2-5g/L、琼脂5-6g/L、酸水解酪蛋白500-2000mg/L、酵母提取物500-2000mg/L、水杨酸30-50mg/L、烯效唑2-6mg/L、吲哚乙酸或萘乙酸2-4mg/L；培养基中pH值为5.5-6.5。
6.根据权利要求4所述的甘肃贝母试管小鳞茎培育的方法，其特征在于：外植体的选择步骤是于当年6月前后开花期采挖新鲜的开花贝母，在-2℃—4℃低温条件下贮藏；外植体消毒步骤采用二次消毒法，外植体表面消毒前先使用内吸性杀菌剂或0.3%的生汞浸泡20-30min，期间不断震荡摇晃，用灭菌蒸馏水冲洗干净，间隔2-3天，再用0.3%的生汞浸泡20min，期间不断震荡摇晃，用灭菌蒸馏水冲洗干净；内吸性杀菌剂选自嘧菌酯、恶霉灵和农用链霉素的混合物质。
7.根据权利要求4所述的甘肃贝母试管小鳞茎培育的方法，其特征在于：对原球茎生长膨大的试管小鳞茎进行贮藏方法是：在零下2℃-5℃贮藏3-5个月，或在8-15℃贮藏2-3个月。
8.根据权利要求5所述的甘肃贝母试管小鳞茎培育的方法，其特征在于：外植体的选择步骤是于当年6月前后开花期采挖新鲜的开花贝母，在-2℃—4℃低温条件下贮藏,外植体消毒步骤采用二次消毒法，外植体表面消毒前先使用内吸性杀菌剂或0.3%的生汞浸泡20-30min，期间不断震荡摇晃，用灭菌蒸馏水冲洗干净，间隔2-3天，再用0.3%的生汞浸泡20min，期间不断震荡摇晃，用灭菌蒸馏水冲洗干净；内吸性杀菌剂选自嘧菌酯、恶霉灵和农用链霉素的混合物质。
9.根据权利要求5所述的甘肃贝母试管小鳞茎培育的方法，其特征在于：对原球茎生长膨大的试管小鳞茎进行贮藏方法是：在零下2℃-5℃贮藏3-5个月，或在8-15℃贮藏2-3个月。
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