CN109122318A - 一种地不容组培繁殖方法 - Google Patents
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- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
Abstract
本发明公开了一种地不容组培繁殖方法，包括(1)外植体选择、(2)外植体消毒、(3)丛生芽诱导、(4)增殖培养、(5)生根培养等步骤。本发明成功建立了地不容的组培快繁体系，显著提高了地不容丛生芽诱导率、增殖系数、生根率。具有组培效率高，成本低的优势，解决了野生地不容野生资源过度开发、药材供应少和种植规模受种苗数量和质量限制等问题。
Description
技术领域
本发明涉及中药材组培领域，尤其涉及一种地不容组培繁殖方法。
背景技术
地不容(Stephania epigaea H.S.Lo)为防己科千金藤属草质藤本属植物，以块根入药，有祛风除湿，清热解毒，止痛的功效，主要用于胃痛，风湿痹痛，咽喉不利，痈肿疮毒。其内含罗通定具解热镇痛作用，临床上主要用于治疗胃溃疡、十二指肠溃疡的疼痛以及月经痛、分娩后宫缩痛、紧张性失眠以及痉挛性咳嗽等；其内含青藤碱具镇痛抗炎作用，主要用于治疗风湿性关节炎和神经痛。同时，地不容由于其块根性状多异奇特，茎叶亮绿可艺术性人工缠绕，还常做一种价值较高的观赏性盆景。
地不容主要分布于云南除东北部、西南部和西双版纳尚未发现分布外，几乎各地都有，四川南部和西部亦有分布，常生于石山。近年来，随着药用价值的开发以及观赏性价值的推广，地不容需求突飞猛增，而有限的野生资源不能满足市场需求，其价格亦随之迅猛上涨，不少科研机构、企业纷纷开展地不容的种植技术研究，但由于地不容雌雄异株，且雌株在种群中分布量少，使得种子量较少，同时由于种子发芽率低、发芽周期长。同时也因其为雌雄异株，种子繁殖杂交性强，作为观赏性植物其变异性大，母本遗传性状不稳定。近年来，部分单位开展了广西地不容、小叶地不容等的组培技术研究，但是在增殖率、生根情况方面效果都不甚理想。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，发明了一种操作简便、培养周期短、增殖率高的地不容组培快繁技术，能有效降低生产成本，可为规模化种植短期内快速提供优质种苗的繁育方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种地不容组培繁殖方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)外植体选择、(2)外植体消毒、(3)丛生芽诱导、(4)增殖培养、(5)生根培养；
优选地，步骤(1)所述的外植体选择包含以下步骤：待新茎叶发出后，选取顶端10-20cm幼嫩带芽茎段；
优选地，步骤(2)所述的外植体消毒包含以下步骤：将选取的外植体剪成带芽小段后用饱和肥皂水溶液涮洗后冲淋，用75％酒精消毒10-25s，再用饱和漂白粉溶液消毒20-30min，最后用0.05％升汞溶液消毒10-15min；
优选地，步骤(3)所述的丛生芽诱导包含以下步骤：将消毒好的外植体，去掉两端，切至0.5-1.0cm带芽茎段，接种在诱导培养基上，在人工控制的环境下培养；更加优选地，所述的诱导培养基为：MS+NAA 0-0.05mg/L+TIBA 1.0-3.0mg/L+KT 2.0-4.0mg/L+活性炭0.2-0.5g/L；所述的在人工控制的环境下培养包含以下步骤：培养温度为24-30℃，光照强度1000-2000lux，前15天在单日光照时间6h的条件下培养，15天后在单日光照时间12h的条件下培养；
优选地，步骤(4)所述的增殖培养包含以下步骤：将丛生芽接种在增殖培养基上，在人工控制的环境下培养；更加优选地，所述的增殖培养基为：MS+IBA 0-0.1mg/L+TIBA2.0-4.0mg/L+KT2.0-4.0mg/L+硝酸银1.0-5.0μg/L+活性炭0.2-0.5g/L；所述的在人工控制的环境下培养包含以下步骤：培养温度为24-30℃，光照强度为1000-2000lux，单日光照时间为12h；
优选地，步骤(5)所述的生根培养包含以下步骤：将增殖的丛生芽接种在生根培养基上，在人工控制的环境下培养；更加优选地，所述的生根培养基为：1/2MS+NAA 0.5-2.0mg/L+IBA 0-2.0mg/L+多效唑0.01-0.1mg/L活性炭0.5-1.0g/L；所述的在人工控制的环境下培养包含以下步骤：培养温度为24±2℃，光照强度为3000-4000lux，单日光照时间为12h。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明地不容组培繁殖方法，外植体的采集时间为3月至11月，可采集周期长，经采集后可继续生长，到收获季节亦可同其他未采集的植株同时收获且不影响产量及品质；
(2)本发明所述的一种地不容组培繁殖方法，组分简单，操作简便，成本低廉，繁育过程不受地域及季节限制；
(3)本发明所述的一种地不容组培繁殖方法，增殖系和生根率显著优于现有技术。培养周期短，比现有技术繁殖速度更快，生产成本更低。一株植株一年可采集30-40个带芽茎段，经初代诱导，增殖与生根培养，约7-8个月，即可获得生根苗约150万株。
(4)本发明所述的一种地不容组培繁殖方法，属于用体细胞繁殖的无性繁殖范畴，能最大程度的保持亲本性状，相比传统的种子繁殖存在杂交变异的情况，更有利于药材优良性状的保存。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步的说明，但本发明并不局限于此。
实施例1
(1)将健壮无茎叶块根栽植于室内，待新茎叶发出后，每隔4天用75％多菌灵800倍液喷施2次，选取幼嫩带芽茎段；
(2)将选取的外植体剪成带芽小段后用饱和肥皂水溶液涮洗10min，自来水涮洗3-4次至无肥皂水残留，自来水冲淋60-70min；
(3)将洗净的外植体转移至超净工作台上，用75％酒精消毒10s，无菌水涮洗2-3次，饱和漂白粉溶液消毒20min，无菌水涮洗3-4次，0.05％升汞溶液+2-3滴吐温-80消毒10min，无菌水涮洗6-8次；
(4)将消毒好的外植体，用无菌滤纸吸去表面水分，并去掉两端剪成0.5-1.0cm带芽茎段，按极性斜插于MS+TIBA 2.0mg/L+KT2.0mg/L+活性炭0.2g/L的诱导培养基上，在温度为24-30℃，光照强度为1000lux，前15天在单日光照时间6h的条件下培养，15天后在单日光照时间12h的条件下培养35天。记录诱导情况。
(5)将诱导出的丛生芽剪成单芽，按极性斜插于MS+TIBA3.0mg/L+KT 2.0mg/L+硝酸银1.0μg/L+活性炭0.2g/L的增殖培养基上，在温度为24℃，光照强度为1000lux，单日光照时间为12h的条件下培养40天。记录增殖情况。
(6)将增殖的丛生芽，按极性直立插于在1/2MS+NAA 1.0mg/L+IBA 1.0mg/L+多效唑0.05mg/L+活性炭0.5g/L的生根培养基上，在温度为24℃，光照强度为3000lux，单日光照时间为12h的环境下培养34天，记录生根情况。
实施例2
(1)将健壮无茎叶块根栽植于室内，待新茎叶发出后，每隔5天用75％多菌灵800倍液喷施3次，选取幼嫩带芽茎段；
(2)将选取的外植体剪成带芽小段后用饱和肥皂水溶液涮洗10min，自来水涮洗3-4次至无肥皂水残留，自来水冲淋60min；
(3)将洗净的外植体转移至超净工作台上，用75％酒精消毒10s，无菌水涮洗2-3次，饱和漂白粉溶液消毒20min，无菌水涮洗3-4次，0.05％升汞溶液+2-3滴吐温-80消毒15min，无菌水涮洗6-8次；
(4)将消毒好的外植体，用无菌滤纸吸去表面水分，并去掉两端剪成0.5-1.0cm带芽茎段，按极性斜插于MS+NAA 0.05mg/L+TIBA3.0mg/L+KT 4.0mg/L+活性炭0.5g/L的诱导培养基上，在温度为30℃，光照强度为2000lux，前15天在单日光照时间6h的条件下培养，15天后在单日光照时间12h的条件下培养31天。记录诱导情况。
(5)将诱导出的丛生芽剪成单芽，按极性斜插于MS+IBA0.1mg/L+TIBA 4.0mg/L+KT4.0mg/L+硝酸银5.0μg/L+活性炭0.5g/L的增殖培养基上，在温度为30℃，光照强度为2000lux，单日光照时间为12h的条件下培养38天。记录增殖情况。
(6)将增殖的丛生芽按极性直立插于在1/2MS+NAA 2.0mg/L+IBA 2.0mg/L+多效唑0.01mg/L+活性炭1.0g/L的生根培养基上，在温度为26℃，光照强度为4000lux，单日光照时间为12h的环境下培养30天。记录生根情况。
对比例1按实施例1的步骤进行，不同点在于步骤(4)中的诱导培养基、步骤(5)中的增殖培养基、步骤(6)中的生根培养基不同，具体如下：
对比例1：
步骤(4)中的诱导培养基为：MS+NAA 0.1mg/L+BA 1mg/L；
步骤(5)中的增殖培养基为：MS+IBA 0.4mg/L+NAA 0.2mg/L+GA 0.5mg/L；
步骤(6)中的生根培养基为：1/2MS+IBA0.8mg/L。
对实施例1-2、对比例1各项数据进行统计分析，结果见下表。
| 类目 | 丛生芽诱导率 | 增值系数 | 生根率 |
| 实施例1 | 83.1％ | 12.8 | 98.3％ |
| 实施例2 | 83.7％ | 13.1 | 98.9％ |
| 对比例1 | 56.2％ | 6.3 | 72.7％ |
由此可知，本发明的地不容组培繁殖方法，丛生芽诱导率、增值系数、生根率均优于现有技术，可见本发明的组培繁殖方法具有大规模应用的价值。
Claims (9)
1.一种地不容组培繁殖方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)外植体选择、(2)外植体消毒、(3)丛生芽诱导、(4)增殖培养、(5)生根培养。
2.根据权利要求1所述的一种地不容组培繁殖方法，其特征在于，步骤(1)所述的外植体选择包含以下步骤：待新茎叶发出后，选取顶端10-20cm幼嫩带芽茎段。
3.根据权利要求2所述的一种地不容组培繁殖方法，其特征在于，步骤(2)所述的外植体消毒包含以下步骤：将选取的外植体剪成带芽小段后用饱和肥皂水溶液涮洗后冲淋，用75％酒精消毒10-25s，再用饱和漂白粉溶液消毒20-30min，最后用0.05％升汞溶液消毒10-15min。
4.根据权利要求3所述的一种地不容组培繁殖方法，其特征在于，步骤(3)所述的丛生芽诱导包含以下步骤：将消毒好的外植体，去掉两端，切至0.5-1.0cm带芽茎段，接种在诱导培养基上，在人工控制的环境下培养。
5.根据权利要求4所述的一种地不容组培繁殖方法，其特征在于，步骤(4)所述的增殖培养包含以下步骤：将丛生芽接种在增殖培养基上，在人工控制的环境下培养。
6.根据权利要求5所述的一种地不容组培繁殖方法，其特征在于，步骤(5)所述的生根培养包含以下步骤：将增殖的丛生芽接种在生根培养基上，在人工控制的环境下培养。
7.根据权利要求4所述的一种地不容组培繁殖方法，其特征在于，所述的诱导培养基为：MS+NAA 0-0.05mg/L+TIBA 1.0-3.0mg/L+KT 2.0-4.0mg/L+活性炭0.2-0.5g/L；所述的在人工控制的环境下培养包含以下步骤：培养温度为24-30℃，光照强度1000-2000lux，前15天在单日光照时间6h的条件下培养，15天后在单日光照时间12h的条件下培养。
8.根据权利要求5所述的一种地不容组培繁殖方法，其特征在于，所述的增殖培养基为：MS+IBA 0-0.1mg/L+TIBA 2.0-4.0mg/L+KT 2.0-4.0mg/L+硝酸银1.0-5.0μg/L+活性炭0.2-0.5g/L；所述的在人工控制的环境下培养包含以下步骤：培养温度为24-30℃，光照强度为1000-2000lux，单日光照时间为12h。
9.根据权利要求6所述的一种地不容组培繁殖方法，其特征在于，所述的生根培养基为：1/2MS+NAA 0.5-2.0mg/L+IBA 0-2.0mg/L+多效唑0.01-0.1mg/L活性炭0.5-1.0g/L；所述的在人工控制的环境下培养包含以下步骤：培养温度为24±2℃，光照强度为3000-4000lux，单日光照时间为12h。
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