CN110250004A - 一种山乌龟组织培养快速繁殖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中药材植物组织培养技术领域，尤其涉及一种山乌龟组织培养快速繁殖的方法，包括以下步骤：采集山乌龟幼嫩带芽茎段，去掉叶片，用洗衣粉饱和溶液浸泡30min，并用刷子轻轻刷表面，再用流水冲洗30min后，置于超净工作台上，用体积分数为75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗2次，再用质量分数为0.1％氯化汞消毒6min，无菌水冲洗5次，再用无菌滤纸吸干表面水分后，用无菌手术剪剪掉茎段两端各2mm，得到无菌茎段，并在诱导培养基、增殖培养基、壮苗培养基与生根培养基，培养得到健壮生根苗；本发明方法可获得大量完整茁壮无菌种苗，降低了生产成本，提高了种植效率。且在不定芽诱导率、增值系数、生根率方面效果显著。

Description

一种山乌龟组织培养快速繁殖的方法
技术领域
本发明属于中药材植物组织培养技术领域，尤其涉及一种山乌龟组织培养快速繁殖的方法。
背景技术
山乌龟是一类块根富含多种生物碱的千金藤属植物，是我国传统中药材。从其块根中分离出多种活性生物碱以及黄酮、甾醇和糖类等化合物,在临床、农业和其他领域上具有重要意义。目前,商品山乌龟还以野生采集为主。近几年由于其药用价值不断被发掘,市场需求增大,然而由于其雌雄异株、种子小、种壳坚硬,在自然条件下萌发困难,繁殖能力极差,加上近年来人为的过度消耗,环境的日益恶化,其种群及个体数量急剧减少,传统的播种、分块的方法已不能满足日益增长的市场需求。
发明内容
本发明为了解决上述技术问题提供一种操作简便、培养周期短、繁殖率高的山乌龟的组织培养快速繁殖的方法，能为大规模种植提供种苗。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种山乌龟组织培养快速繁殖的方法，包括以下步骤：
(1)采集山乌龟幼嫩带芽茎段，去掉叶片，用洗衣粉饱和溶液浸泡30min，并用刷子轻轻刷表面，再用流水冲洗30min后，置于超净工作台上，用体积分数为75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗2次，再用质量分数为0.1％氯化汞消毒6min，无菌水冲洗5次，再用无菌滤纸吸干表面水分后，用无菌手术剪剪掉茎段两端各2mm，得到无菌茎段，待用；
(2)将步骤(1)获得的无菌茎段种到诱导培养基上，在25℃，光照强度2300-2500lx，光照时长12h/d条件下培养，诱导出不定芽；
(3)将步骤(2)获得的不定芽切为1-1.5cm茎段，垂直接种到增殖培养基上，在25℃，光照强度2300-2500lx，光照时长12h/d条件下培养，得到山乌龟小植株；
(4)将步骤(3)获得的山乌龟小植株切分成1-2cm长度的单株，每株保留3-4片叶片，接入到壮苗培养基上，光照强度2300-2500lx，光照时长12h/d条件下培养，得到颜色深绿，叶片完全展开的山乌龟植株；
(5)将步骤(4)获得的山乌龟植株接种到生根培养基上，首先黑暗培养一周，然后转到在光照强度2300-2500lx，光照时长12h/d条件下培养，得到健壮生根苗。
本发明的有益效果是：本发明方法可获得大量完整茁壮无菌种苗，降低了生产成本，提高了种植效率。且在不定芽诱导率、增值系数、生根率方面效果显著。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
作为本发明进一步优选，在步骤(2)中，所述诱导培养基为：MS+6-BA 1.0-2.0mg/L+NAA 0.1-0.2mg/L，琼脂5.8g/L，蔗糖30g/L，pH为5.8。
作为本发明进一步优选，在步骤(3)中，所述增殖培养基为：MS+6-BA 0.4-0.6mg/L+IBA 0.2-0.3mg/L，琼脂5.8g/L，蔗糖30g/L，pH为5.8。
作为本发明进一步优选，在步骤(4)中，所述壮苗培养基为：MS+NAA0.1-0.2mg/L+IBA 0.2-0.4mg/L，琼脂5.8g/L，蔗糖30g/L，pH为5.8。
作为本发明进一步优选，在步骤(5)中，所述生根培养基为：1/2MS+IBA1.0-1.5ml/L+AC 0.4-0.6g/L，琼脂5.8g/L，蔗糖20g/L，pH为5.8。
本发明中的专用名词解释：
MS：一种植物组织培养技术中常用基本培养基配方，内容组成固定不变；
NAA：中文名萘乙酸，植物生长素的一种；
6-BA：中文名6-苄氨基腺嘌呤，植物细胞分裂素的一种；
IBA：中文名吲哚丁酸，植物生长素的一种；
AC：中文名活性炭。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
(1)采集山乌龟幼嫩的去叶带芽茎段，用洗衣粉饱和溶液浸泡30min，并用刷子轻轻刷表面，再用流水冲洗30min；置于超净工作台，用体积分数为75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗2次，再用质量分数为0.1％的氯化汞消毒6min，无菌水冲洗5次，用无菌手术剪剪掉茎段两端各2mm，得到无菌茎段，待用；
(2)将步骤(1)获得的无菌茎段接种到MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L，琼脂5.8g/L，蔗糖30g/L，pH为5.8的诱导培养基，在25℃，光照强度2300x，光照时长12h/d，培养15天，诱导出不定芽；
(3)将步骤(2)获得的不定芽切成1.5cm的小段，以垂直方式接种到MS+6-BA0.4mg/L+IBA 0.2mg/L，琼脂5.8g/L，蔗糖30g/L，pH为5.8的增殖培养基，在25℃，光照强度2300lx，光照时长12h/d，培养30天，得到山乌龟小植株；
(4)将步骤(3)获得的山乌龟小植株切分成单株，每株保留3片叶片，接种到MS+NAA0.1mg/L+IBA 0.2mg/L，琼脂5.8g/L，蔗糖30g/L，pH为5.8的壮苗培养基，在25℃，光照强度2300lx，光照时长12h/d，培养25天，得到颜色深绿，叶片完全展开的山乌龟植株；
(5)将步骤(4)所获得的山乌龟植株，接种到1/2MS+IBA 1.5ml/L+AC0.5g/L，琼脂5.8g/L，蔗糖20g/L，pH为5.8的生根培养基，培养条件为：首先黑暗培养7天，然后置于光照强度2300lx，光照时长：12h/d环境下培养25天,得到健壮生根苗。
本实施例1，污染率为0；山乌龟的诱导率为96％，生根率为86％，增殖率达4倍，培养周期为102天。
实施例2
(1)采集山乌龟幼嫩的去叶带芽茎段，用洗衣粉饱和溶液浸泡30min，并用刷子轻轻刷表面，再用流水冲洗30min；置于超净工作台，用体积分数的75％酒精消毒30s，无菌水冲洗2次，再用质量分数为0.1％的氯化汞消毒6min，无菌水冲洗5次，用无菌手术剪剪掉茎段两端各2mm，得到无菌茎段，待用；
(2)将步骤(1)获得的无菌茎段接种到MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L，琼脂5.8g/L，蔗糖30g/L，pH为5.8的诱导培养基，在25℃，光照强度2300x，光照时长12h/d，培养15天，诱导出不定芽；
(3)将步骤(2)获得的不定芽切成1.5cm的小段，以水平方式接种到MS+6-BA0.4mg/L+IBA 0.2mg/L，琼脂5.8g/L，蔗糖30g/L，pH为5.8的增殖培养基，在25℃，光照强度2300lx，光照时长12h/d，培养30天，得到山乌龟小植株；
(4)将步骤(3)获得的山乌龟小植株切分成单株，每株保留3片叶片，接种到MS+NAA0.1mg/L+IBA 0.2mg/L，琼脂5.8g/L，蔗糖30g/L，pH为5.8的壮苗培养基，在25℃，光照强度2300lx，光照时长12h/d，培养25天，得到颜色深绿，叶片完全展开的山乌龟植株；
(5)将步骤(4)所获得的山乌龟植株，接种到1/2MS+IBA 1.5ml/L+AC 0.5g/L，琼脂5.8g/L，蔗糖20g/L，pH为5.8的生根培养基，培养条件为：首先黑暗培养7天，然后置于光照强度2300lx，光照时长：12h/d环境下培养25天，得到健壮生根苗。
实施例3
(1)采集山乌龟幼嫩的去叶带芽茎段，用洗衣粉饱和溶液浸泡30min，并用刷子轻轻刷表面，再用流水冲洗30min；置于超净工作台，用提积分数为75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗2次，再用质量分数为0.1％的氯化汞消毒6min，无菌水冲洗5次，在超净工作台上，用无菌滤纸吸干表面水分后，用无菌手术剪剪掉茎段两端各2mm，得到无菌茎段，待用；
(2)将步骤(1)获得的无菌茎段接种到MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.2mg/L，琼脂5.8g/L，蔗糖30g/L，pH为5.8的诱导培养基，在25℃，光照强度2500lx，光照时长12h/d，培养14天，诱导出不定芽；
(3)将步骤(2)获得的不定芽切成1cm的小段，垂直接种到MS+6-BA 0.6mg/L+IBA0.3mg/L，琼脂5.8g/L，蔗糖30g/L，pH为5.8的增殖培养基，在25℃，光照强度2500lx，光照时长12h/d，培养25天，得到山乌龟小植株；
(4)将步骤(3)获得的植株切分成单株，每株保留3～4片叶片，接种到MS+NAA0.2mg/L+IBA 0.4mg/L，琼脂5.8g/L，蔗糖30g/L，pH为5.8的壮苗培养基，在25℃，光照强度2500lx，光照时长12h/d，培养21天，，得到颜色深绿，叶片完全展开的山乌龟植株；
(5)将步骤(4)所获得的山乌龟植株，接种到1/2MS+IBA1.0ml/L+AC 0.5g/L，琼脂5.8g/L，蔗糖20g/L，pH为5.8的生根培养基，培养条件为：首先黑暗培养7天，然后置于光照强度2500lx，光照时长：12h/d环境下培养25天，得到健壮生根苗。
本实施例3，污染率为0；山乌龟的诱导率为96％，生根率为85％，增殖率达5倍，培养周期为92天。
表1为实施例1与实施例2分别为垂直与水平两种接种方式对丛生芽增殖的影响
表1
接种方式 水平 垂直
接种段数 200 200
褐化段数 122 0
褐化率 61％ 0％
丛生芽数 235 827
增殖倍数 3.01 4.14
丛生芽状态 细小呈黄绿色 健壮呈绿色
从上表1可以看出，垂直接入的接种方式明显优于水平接入的方式。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种山乌龟组织培养快速繁殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集山乌龟幼嫩带芽茎段，去掉叶片，用洗衣粉饱和溶液浸泡30min，并用刷子轻轻刷表面，再用流水冲洗30min后，置于超净工作台上，用体积分数为75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗2次，再用质量分数为0.1％氯化汞消毒6min，无菌水冲洗5次，再用无菌滤纸吸干表面水分后，用无菌手术剪剪掉茎段两端各2mm，得到无菌茎段，待用；
(2)将步骤(1)获得的无菌茎段接种到诱导培养基上，在25℃，光照强度2300-2500lx，光照时长12h/d条件下培养，诱导出不定芽；
(3)将步骤(2)获得的不定芽切为1-1.5cm茎段，垂直接种到增殖培养基上，在25℃，光照强度2300-2500lx，光照时长12h/d条件下培养，得到山乌龟小植株；
(4)将步骤(3)获得的山乌龟小植株切分成1-2cm长度的单株，每株保留3-4片叶片，接入到壮苗培养基上，光照强度2300-2500lx，光照时长12h/d条件下培养，得到颜色深绿，叶片完全展开的山乌龟植株；
(5)将步骤(4)获得的山乌龟植株接种到生根培养基上，首先黑暗培养一周，然后转到在光照强度2300-2500lx，光照时长12h/d条件下培养，得到健壮生根苗。
2.根据权利要求1所述一种山乌龟组织培养快速繁殖的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述诱导培养基为：MS+6-BA 1.0-2.0mg/L+NAA 0.1-0.2mg/L，琼脂5.8g/L，蔗糖30g/L，pH为5.8。
3.根据权利要求1所述一种山乌龟组织培养快速繁殖的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述增殖培养基为：MS+6-BA 0.4-0.6mg/L+IBA 0.2-0.3mg/L，琼脂5.8g/L，蔗糖30g/L，pH为5.8。
4.根据权利要求1所述一种山乌龟组织培养快速繁殖的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述壮苗培养基为：MS+NAA0.1-0.2mg/L+IBA 0.2-0.4mg/L，琼脂5.8g/L，蔗糖30g/L，pH为5.8。
5.根据权利要求1所述一种山乌龟组织培养快速繁殖的方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述生根培养基为：1/2MS+IBA1.0-1.5ml/L+AC 0.4-0.6g/L，琼脂5.8g/L，蔗糖20g/L，pH为5.8。
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