CN115250922A - 一种诱导新麦草上胚轴形成愈伤组织并再生植株的方法 - Google Patents

一种诱导新麦草上胚轴形成愈伤组织并再生植株的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物组织培养技术领域，公开了一种诱导新麦草上胚轴形成愈伤组织并再生植株的方法，包括以下步骤：(1)、培养获得无菌幼苗；(2)、获得初代愈伤组织；(3)、获得胚性愈伤组织；(4)、培养得到不定芽；(5)、获得生根无菌苗；(6)、进行驯化和移栽；本发明所述培养基以诱导上胚轴产生愈伤组织，通过继代改善愈伤组织质量，形成胚性愈伤组织，由愈伤组织再分化长出新芽，在生根培养基上培养其生根，直至长出完整的新植株，建立起以上胚轴为外植体的高效新麦草再生体系；本发明采用胚轴这一新的外植体材料，优化缩短了建立新麦草再生体系的时间，提高了诱导和再生效率，并为后续新麦草遗传转化、组培扩繁、脱毒种质研究提供了新途径。

Description

一种诱导新麦草上胚轴形成愈伤组织并再生植株的方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，特别涉及一种诱导新麦草上胚轴形成愈伤组织并再生植株的方法。
背景技术
新麦草又称俄罗斯野黑麦，是禾本科小麦族多年生牧草，二倍体物种，具有很强的抗旱抗寒能力，是新麦草属中唯一具有较高饲用价值的草种，也是改良禾谷类作物的优异种质和基因资源。既是我国北方重要的优良放牧型禾草，也是重要的生态建设草种。野生资源在俄罗斯、中亚、以及中国均有分布，在我国主要分布在新疆。新麦草分蘖较多，为短根茎下繁丛生禾草。
蒙农4号新麦草是经国家草品种审定委员会登记的育成品种，登记号371，本专利发明人为该品种育种人，具有该品种知识产权。蒙农4号新麦草在株丛大小、产草量上均有显著优势,种子产量也比对照有大幅度增长,且群体性状表现整齐一致，苗期生长迅速,能适应内蒙古及周边地区自然条件,是我国北方干旱寒冷地区草地建设和生态治理的优良禾草材料。到目前为止，蒙农4号新麦草以上胚轴为外植体的组织培养技术并不成熟，可借鉴的技术还处于初级摸索阶段。
专利号为201711396955 .3的中国公开专利提出了一种华山新麦草专用育苗复配基质及其制备方法，所述华山新麦草专用育苗复配基质由园土、草炭和珍珠岩组成；按照体积比园土：草炭：珍珠岩＝1：2：1。华山新麦草种子发芽率最高，达83.33％，株高为12 .5cm，根长为5.8cm，对华山新麦草幼苗质量有促进作用，根冠比值为0.20，根系活力增加16.64％。该申请主要目的是解决华山新麦草幼苗生长的基质，属于传统的培养技术，发芽率最高达83.33％。目前缺乏对新麦草完整组织培养技术的研究，也没有一套完整的新麦草组织培养体系。
发明内容
本发明的目的在于提供一种诱导新麦草上胚轴形成愈伤组织并再生植株的方法，采用胚轴这一新的外植体材料，缩短了建立新麦草再生体系的时间，提高了诱导和再生效率；所以，其胚轴再生体系的建立，将为后续种质资源的保存、组培扩繁、遗传转化等提供高效的新途径；解决上述背景技术中提出的问题。
本发明采用的技术方案如下：一种诱导新麦草上胚轴形成愈伤组织并再生植株的方法，包括以下步骤：
(1)、培养获得无菌幼苗：
取种子1000粒，剥去内外稃，装入锥形瓶，网膜封口，流动自来水下冲洗一小时，然后在超净台上进行消毒，接种到培养基中；
(2)、选取步骤(1)中幼叶未顶出胚芽鞘的无菌幼苗，切取胚轴为外植体接种到愈伤组织诱导培养基中进行培养，获得愈伤组织；
(3) 、取步骤（2）中愈伤组织接种到继代培养基中，进行愈伤组织质量改善，获得胚性愈伤组织；
(4) 、选取步骤（3）中所改善的胚性愈伤组织转移至分化培养基中培养得到不定芽；
(5) 、将步骤（4）中诱导出的不定芽接种至生根培养基上进行培养获得生根无菌苗；
(6) 、待步骤（5）中生根无菌苗根长到3～4cm之后培养一周，进行驯化和移栽。
进一步，所述步骤（1）中消毒方式为采用无水乙醇消毒30s，无菌水冲洗三次，4%的次氯酸钠消毒9min，无菌水冲洗4～5次。
进一步，所述步骤（1）中无菌苗培养基配方为：MS+0.2mg/L IBA。
进一步，所述步骤（2）中外植体为根与胚轴接口处至胚芽鞘未伸出或伸出种皮1～2mm处。
进一步，所述步骤（2）中愈伤组织诱导培养基配方为：MS+0.5～1.5mg/L 2,4-D+0.2～0.35mg/L KT+300mg/L CH。
优选的，所述步骤（2）中愈伤组织诱导培养基配方为：MS+1.0mg/L 2,4-D+0.25mg/L KT+300mg/L CH。
进一步，所述步骤（3）中继代培养基配方为：MS+0.3mg/L NAA+1～4mg/L KT或MS+0.3mg/L 2,4-D+1～4mg/L KT。
优选的，所述步骤（3）中继代培养基配方为：MS+3.0mg/L KT+0.3mg/L 2,4-D。
进一步，所述步骤（4）中分化培养基配方为：MS+0.3～0.5mg/L 2,4-D+0.4～1.0mg/L KT。
优选的，所述步骤（4）中分化培养基配方为：MS+0.3mg/L 2,4-D+0.6mg/L KT。
进一步，所述步骤（5）中生根培养基配方为：1/2MS+0.3mg/L NAA，1/2MS+0.3mg/LIBA，1/2MS+0.3mg/L 2,4-D，1/2MS+0.25mg/L NAA+0.25mg/L IBA中的一种。
优选的，所述步骤（5）中生根培养基配方为：1/2MS+0.3mg/L IBA。
进一步，所述步骤（6）中培养基质为：3:1混合的营养土和蛭石。
进一步，上述方法在建立蒙农4号新麦草上胚轴再生体系中的应用。
本发明的有益效果在于：
1.本申请筛选出新麦草种子消毒的最适方式，次氯酸钠替代升汞的方式，对减少人体和植株伤害方面有很大成效，培养基未污染百分数可达100%；
2.所陈述的培养基以MS培养基为基本培养基，按照不同阶段所需成分及比例添加2,4-D，KT，IBA，NAA以及水解酪蛋白，PH值为5.8-6.0，适合植物组织生长，提升了无菌苗的成活率；
3.利用上胚轴为外植体建立再生体系，为新麦草培育愈伤组织方面提供新途径，并为其后续遗传转化、保存种质、种源扩繁的研究提供理论与技术支撑。
附图说明
图1为4%的次氯酸钠消毒9min下的蒙农4号新麦草无菌苗。
图2为最优激素配比对上胚轴愈伤诱导的影响，其中，A为初代愈伤出愈质量。
图3为最优激素配比对上胚轴愈伤诱导的影响，其中，B为初代愈伤出愈率效果。
图4为不同激素配比对愈伤诱导的影响。
图5为优势激素配比对上胚轴愈伤改造效果。
图6为最佳培养基对愈伤组织分化的影响，其中，A为分化初期。
图7为最佳培养基对愈伤组织分化的影响，其中，B为分化后期。
图8为不同培养基对愈伤组织分化的影响。
图9为最适培养基1/2MS对无菌苗生根的影响。
图10为组培苗移栽。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在整个再生体系培养体过程中，温度均为 25±1℃；培养基 pH 值均为 5.8-6，这个范围是植物组织内pH正常范围，过低或过高培养基质地不适合植物组织生长，用酸度计测量，用浓度1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调整；MS培养基成分是蔗糖和琼脂，一般是蔗糖30g/L,琼脂7 g/L，我们调整降低了蔗糖浓度为27 g/L，琼脂浓度没有调整。
实施例一：筛选新麦草种子的最佳消毒方式：
如图1所示，选取健康结实种子1000粒，剥去内外稃，去稃的原因为内外稃带菌多，容易发生污染，去稃的操作为用镊子剥离；然后装入锥形瓶或其他有一定深度玻璃容器；网膜封口，该网膜为医用纱布，可以防止种子被冲跑，同时避免种子被冲坏；在流动自来水下冲洗一小时后放在超净台上，长时间冲洗不仅可以去污，而且能打破种子休眠，促进种子整齐的快速发芽；取浓度为10%的次氯酸钠溶液分别配比成4%、5%、6%的次氯酸钠溶液，将冲洗好的种子分成10份，均用无水乙醇消毒30s，无菌水冲洗3次，除CK（即对照组）以外，其余9份种子分别使用配比不同的次氯酸钠溶液消毒8、9、10min，无菌水冲洗4～5次，接种于MS+0.2mg/L IBA的培养基上培养，每组处理重复3次。
通过以下公式统计未污染率且取均值：
未污染率=(未污染的种子数目/接种时种子数目)×100%
培养基编号 时间(min) 浓度（%) 无菌率（%）
CK 0 0 10
A1 8 4 73.3
A2 9 4 100
A3 10 4 66.7
A4 8 5 60
A5 9 5 54.5
A6 10 5 45.4
A7 8 6 40
A8 9 6 36.4
A9 10 6 16.7
表1不同消毒浓度和消毒时间对种子消毒效果的影响
数据分析：由表1可知，不同消毒浓度以及不同消毒浓度所处理的时间长短，对蒙农4号新麦草种子的消毒效果存在明显的差异。通过和CK 的对比，次氯酸钠有明显的消毒效果，其浓度在4%的时候消毒效果明显高于其他浓度，且消毒时间在9min的时候消毒效果最好，达到100%，其次是同浓度的8min和10min，分别为73.3%和66.7%。随着消毒浓度的升高，无菌率整体在下降，当浓度和时间最高时无菌率达到最低，为16.7%。
筛选结果：由于升汞的毒性较大，对人体危害较大。经综合考虑，种子消毒选择以次氯酸钠为主的消毒方式。采用无水乙醇消毒30s后，再用4%的次氯酸钠溶液消毒9min,最终达到外植体消毒目的，采用两种灭菌方式可以更好的杀灭不同类型的微生物如细菌和霉菌，所述培养基配方为：MS+0.2mg/L IBA。
实施例二：筛选不同激素配比对愈伤组织诱导的影响：
如图2~图4所示，选取幼叶未顶出胚芽鞘的无菌幼苗，这个阶段幼苗胚芽完全发育但纤维还比较少，做外植体效果最好；切取胚轴为外植体接种到愈伤组织诱导培养基中进行培养，所述外植体为根与胚轴接口处至胚芽鞘未伸出或伸出种皮1～2mm处，这部分组织长愈伤最快；对愈伤组织诱导培养基激素浓度配比进行筛选，分别取0.5、1、1.5mg/L的2,4-D，对外植体进行培养，选取愈伤率最高的2,4-D浓度，与0.2、0.25、0.3、0.35mg/L 的KT做组合处理，然后用上述最优组合配比300mg/L的水解酪蛋白（CH），该水解酪蛋白有助于改善愈伤组织质地；筛选出最佳愈伤组织培养配方。每个处理重复5次，培养条件均是暗培养3～4d，然后转入光照，12h光12h暗，培养10～11d。
通过以下公式(Ｉ)计算愈伤组织诱导率：
愈伤组织诱导率=(产生愈伤组织的外植体数/接入外植体总数)×100% (Ｉ)
表2不同激素配比对愈伤诱导的影响
Figure 672466DEST_PATH_IMAGE002
（注：不同列相同字母的数值间（p<0.05）差异显著，同列相同字母的数值间（p>0.05）差异不显著。下同。）
数据分析：上胚轴在不同激素配比下愈伤诱导能力不同，由表2可知（或如图4所示），2,4-D浓度为1.0mg/L时，诱导率显著高于0.5mg/L和1.5mg/L的2,4-D。结合KT的激素配比进一步提升了上胚轴愈伤的诱导率，0.25mg/L的KT诱导上胚轴诱导率最高，为80%，显著高于KT的其他两个浓度处理。
筛选结果：所述愈伤诱导培养基为：MS+1.0mg/L 2,4-D+0.25mg/L KT+300mg/LCH。
实施例三：筛选不同激素配比对愈伤组织改造的影响：
如图5所示，将初代培养基诱导出的愈伤组织转移至分别含有0.3mg/L NAA和2,4-D的不同的继代培养基中培养，与1、2、3、4mg/L 的KT做组合处理，筛选出最佳愈伤组织改造配方，培养条件均为16h光培，8h黑暗，培养15～18d。
通过以下公式(Ⅱ)计算继代改造率。
继代改造率=（改造好的愈伤数/接入的愈伤总数）×100% (Ⅱ)
表3不同激素处理对愈伤改造的影响
Figure 448661DEST_PATH_IMAGE004
数据分析：初代愈伤组织经过继代改造后，愈伤块由初代的疏松、湿软状态变为白色或淡黄色致密、坚硬、干燥状态。由表3可知，2,4-D相对NAA对愈伤组织改造效果更好。0.3mg/L的2,4-D配比3.0mg/L的KT对愈伤改造最佳，为62.87%。改造后的愈伤组织整体质量较好，便于后续分化。
筛选结果：所述继代培养基为：MS+3.0mg/L KT+0.3mg/L 2,4-D。
实施例四：筛选不同培养基对愈伤分化的影响：
如图6~图8所示，选取继代状态良好的愈伤组织块，该状态良好指质地较硬，颗粒明显，颜色为淡黄色，生长速度快的愈伤组织块；转移至不同激素和浓度配比的分化培养基中，激素选取0.3～0.5mg/L的2,4-D,和0.4～1.0mg/L KT进行配比培养，培养条件均为室温25℃，16h光培，8h黑暗，培养15～20d。
通过以下公式(Ⅲ)计算愈伤组织分化率。
分化率=（分化的愈伤数/接入的愈伤总数）×100% (Ⅲ)
表4不同培养基对愈伤组织分化的影响
Figure 526601DEST_PATH_IMAGE006
数据分析：继代之后的愈伤组织在不同激素配比的培养基中分化能力不同，当KT为0.4mg/L时，0.5mg/L 2,4-D的分化率显著低于0.3mg/L 2,4-D，即62.10%小于83.71%。当2,4-D浓度为0.3mg/L时，随着KT浓度的上升，分化率呈现先增后降的趋势（如图8所示），由表4可知，KT浓度为0.6mg/L时，分化率达到最高，为85.28%。
筛选结果：所述分化培养基为：MS+0.3mg/L 2,4-D+0.6mg/L KT。
实施例五：筛选不同培养基对无菌苗生根的影响：
如图9所示，待分化不定芽长成2～3cm无菌苗，移入生根培养基中培养，1/2MS分别附加0.3mg/L IBA、NAA、2,4-D及0.25mg/L的NAA和IBA，培养条件均为室温25℃，16h光培养，8h暗培养。记录生根情况。
表5不同培养基对无菌苗生根的影响
培养基编号 培养基成分（mg/L) 生根率（%）
S1 1/2MS+NAA(0.3mg/L) 71.67±19.79B
S2 1/2MS+IBA(0.3mg/L) 93.32±8.45A
S3 1/2MS+2,4-D(0.3mg/L) 32.17±10.73D
S4 1/2MS+NAA(0.25mg/L)+IBA(0.25mg/L) 58.43±6.52C
数据分析：无菌苗转至生根培养基4～5d即可长出2～3mm的根，随后根逐渐伸长最终形成根系。不同的生根培养基配方对无菌苗的影响不同。试验共采用了四种生根培养基：1/2MS+0.3mg/L NAA、1/2MS+0.3mg/L IBA、1/2MS+0.3mg/L 2,4-D和1/2MS+0.25mg/L NAA+0.25mg/L IBA。由表5可知，2,4-D对无菌苗生根的促进作用显著低于其他处理，IBA对根的生长效果最好，生根率可达93.32%。
筛选结果：所述生根培养基为：1/2MS+0.3mg/L IBA。
实施例六：无菌苗的驯化和移栽
如图10所示，待无菌苗根长到3～4cm之后培养一周，使得无菌苗根系稳定,微微敞开封口膜，后逐渐敞开，室温炼苗2～3d，定期浇水，防止植物萎蔫，之后取出无菌苗，小心清洗根系上的培养基，最后转入培养基质进行培养，培养基质为营养土与蛭石（3:1），两种基质混合均匀，前期覆袋保护，后期正常管理。该培养基质选择于实验室常用的基质材料，在一定程度上提高了无菌苗的成活率。
通过以上实施例的筛选过程提出一种诱导新麦草上胚轴形成愈伤组织并再生植株的方法，包括以下步骤：
(1)：培养获得无菌幼苗：
取种子1000粒，剥去内外稃，装入锥形瓶，网膜封口，流动自来水下冲洗一小时，置于超净台上，用无水乙醇消毒30s，无菌水冲洗3次，再用4%的次氯酸钠消毒9min, 无菌水冲洗4～5次，随后接种到培养基中培养，温度25℃，光照12h，黑暗12h，接种5～7d后得到所需无菌苗；所述培养基配方为：MS+0.2mg/L IBA；
(2)：选取(1)中幼叶未顶出胚芽鞘的无菌苗，切取胚轴为外植体接种到愈伤组织诱导培养基中进行培养，温度25℃，暗培养3～4d，转入光照，光照12h，黑暗12h，培养10～11d，获得初代愈伤组织；所述愈伤诱导培养基为：MS+1.0mg/L 2,4-D+0.25mg/L KT+300mg/L CH；
(3)：选取(2)中长势较好的愈伤组织接种到继代培养基中，进行愈伤组织质量改善，温度25℃，光照16h，黑暗8h，培养15～20d，获得胚性愈伤组织；所述继代培养基为：MS+3.0mg/L KT+0.3mg/L 2,4-D；
(4)：选取（3）中改善的愈伤组织转移至分化培养基中培养得到不定芽；所述分化培养基为：MS+0.3mg/L 2,4-D+0.6mg/L KT；
(5)：将（4）中诱导出的不定芽接种至生根培养基上进行培养获得生根无菌苗；所述生根培养基为：1/2MS+0.3mg/L IBA；
(6)：待（5）中无菌苗根长到3～4cm之后培养一周，进行驯化和移栽。
综上本发明公开了最佳的一种诱导新麦草上胚轴形成愈伤组织并再生植株的方法，通过筛选最适种子消毒浓度，获得无菌苗；切取上胚轴为外植体，获得愈伤组织，确定诱导愈伤组织及分化效果最佳的培养基配方；确定无菌苗的最适生根培养基，并驯化移栽组培苗。本发明建立了蒙农4号新麦草上胚轴高效再生体系，缩短了新麦草再生体系建立的时间，并为后续新麦草遗传转化、组培扩繁、脱毒研究奠定基础；蒙农4号新麦草可以用于建立放牧刈割兼用型人工草地和改良退化草地,也是寒冷干旱地区理想的绿化和水土保持植物,具有重要的推广应用价值。
可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。

Claims (10)

1.一种诱导新麦草上胚轴形成愈伤组织并再生植株的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、取种子剥去内外稃，装入锥形瓶，网膜封口，流动自来水下冲洗一小时，打破种子休眠，然后在超净台上进行消毒，接种到培养基中，获得无菌幼苗；
(2)、选取步骤(1)中幼叶未顶出胚芽鞘的无菌幼苗，切取胚轴为外植体接种到愈伤组织诱导培养基中进行培养，获得愈伤组织；
(3) 、取步骤（2）中愈伤组织接种到继代培养基中，进行愈伤组织质量改善，获得胚性愈伤组织；
(4) 、选取步骤（3）中所改善的胚性愈伤组织转移至分化培养基中培养，得到不定芽；
(5) 、将步骤（4）中诱导出的不定芽接种至生根培养基上进行培养，获得生根无菌苗；
(6) 、待步骤（5）中生根无菌苗根长到3～4cm之后培养一周，进行驯化和移栽。
2.根据权利要求1所述的一种诱导新麦草上胚轴形成愈伤组织并再生植株的方法，其特征在于所述步骤（1）中消毒方式为采用无水乙醇消毒30s，无菌水冲洗三次，4%的次氯酸钠消毒9min，无菌水冲洗4～5次。
3.根据权利要求1所述的一种诱导新麦草上胚轴形成愈伤组织并再生植株的方法，其特征在于所述步骤（1）中无菌苗培养基配方为：MS+0.2mg/L IBA。
4.根据权利要求1所述的一种诱导新麦草上胚轴形成愈伤组织并再生植株的方法，其特征在于所述步骤（2）中外植体为根与胚轴接口处至胚芽鞘未伸出或伸出种皮1～2mm处。
5.根据权利要求1所述的一种诱导新麦草上胚轴形成愈伤组织并再生植株的方法，其特征在于所述步骤（2）中愈伤组织诱导培养基配方为：MS+0.5～1.5mg/L 2,4-D+0.2～0.35mg/L KT+300mg/L CH；其中最佳配方为：MS+1.0mg/L 2,4-D+0.25mg/L KT+300mg/LCH。
6.根据权利要求1所述的一种诱导新麦草上胚轴形成愈伤组织并再生植株的方法，其特征在于所述步骤（3）中继代培养基配方为：MS+0.3mg/L NAA+1～4mg/L KT或MS+0.3mg/L2,4-D+1～4mg/L KT；其中最佳配方为：MS+3.0mg/L KT+0.3mg/L 2,4-D。
7.根据权利要求1所述的一种诱导新麦草上胚轴形成愈伤组织并再生植株的方法，其特征在于所述步骤（4）中分化培养基配方为：MS+0.3～0.5mg/L 2,4-D+0.4～1.0mg/L KT；其中最佳配方为：MS+0.3mg/L 2,4-D+0.6mg/L KT。
8.根据权利要求1所述的一种诱导新麦草上胚轴形成愈伤组织并再生植株的方法，其特征在于所述步骤（5）中生根培养基配方为：1/2MS+0.3mg/L NAA，1/2MS+0.3mg/L IBA，1/2MS+0.3mg/L 2,4-D，1/2MS+0.25mg/L NAA+0.25mg/L IBA中的一种；其中最佳配方为：1/2MS+0.3mg/L IBA。
9.根据权利要求1所述的一种诱导新麦草上胚轴形成愈伤组织并再生植株的方法，其特征在于所述步骤（6）中培养基质为：3:1混合的营养土和蛭石。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的一种诱导新麦草上胚轴形成愈伤组织并再生植株的方法，其特征在于所述方法应用在建立蒙农4号新麦草上胚轴再生体系中。
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