CN104221851B - 一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物快繁方法技术，公开了一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法，包括下列步骤：取大叶蚁塔无菌外植体，在无菌环境下，经初代培养、增殖培养、叶盘法诱导不定芽培养、生根培养，获得生根试管苗，进行栽种。本发明将大叶蚁塔的年繁殖系数由自然状态下的1:1，提高到1:1000000，成本由原来的每株80~100元，降低至每株1~2元，生产周期短，繁殖系数高、生产步骤衔接紧密、成本低廉，生产得到的大叶蚁塔种苗品质高，一致性好，并且从幼苗开始驯化，能逐步适应上海甚至长三角地区的土壤气候条件，具有广阔的市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及植物快繁方法技术，尤其涉及了一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法。
背景技术
大叶蚁塔(GunneramanlcataL.)，小二仙草科根乃拉草属多年生草本，植株的高度可达2～3米，原产南美洲巴西亚马逊河流域一带。超大型观叶植物，整片叶子就像一把带刺的雨伞，直径可达4米，最大的叶片能把3个并排骑马的人，连人带马遮盖住，寻常叶片能盖住一个成人。是世界上目前发现的草本植物中叶片硕大的植物之一，已被收录入吉尼斯世界纪录。种子却极其细小，种皮也极其坚硬，不透水，不透气，休眠期长，萌发率极低。
目前国内大叶蚁塔数量不多，未见结籽，分株、切根等繁殖速度极慢，周期长，不利于优良种苗的推广。其次因其原产于亚马逊河流域热带雨林，喜欢温暖湿润气候，上海曾经几次引种大型种苗，却都难以成活。因此我们采用了离体培养的方式，建立快速繁殖技术，除繁育优质种苗降低昂贵的引种费之外，并通过控制光照、温度、湿度，从幼苗期开始驯化，使之能逐步适应上海甚至长三角的土壤条件和气候条件，让市民早日欣赏到这一奇特植物。该植物在生物学观察、栽培种植、快速繁育方面，目前未见任何报道。
发明内容
本发明针对现有技术中大叶蚁塔在国内温带地区繁殖速度极慢，生长周期长，繁育优质种苗费用昂贵等缺点，提供了一种采用离体培养的方式，建立快速繁殖技术，通过控制光照、温度、湿度，从幼苗期开始驯化，使之能逐步适应上海甚至长三角的土壤条件和气候条件，具有周期短，繁殖系数高、生产步骤衔接紧密、成本低廉的一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法。
本发明中，所用到的培养基及激素包括：MS培养基(MurashingandSkoogmedium，以下简称MS)，MS配方中的药品成分和培养基的具体配制方法为现有公知技术，在此不再赘述。附加的植物激素为6-苄基氨基嘌呤(benzylaminopurine，简称为6-BA)、萘乙酸(naphthyleneaceticacid，简称为NAA)、玉米素(Zeatin，以下简称为ZT)。
为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：
一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法，包括下列步骤：取大叶蚁塔无菌外植体，在无菌环境下，经初代培养、增殖培养、叶盘法诱导不定芽培养、生根培养，获得生根试管苗，进行栽种，
初代培养为：选择并清洗、消毒处理大叶蚁塔茎尖获得起始的无菌外植体，接种到初代培养基上，进行初代培养，获得无菌苗；
增殖培养：是将初代培养的无菌苗转入增殖培养基，诱导丛生芽；
叶盘法诱导不定芽培养：取诱导出丛生芽的无菌苗的幼嫩叶片，转移至叶盘法诱导不定芽诱导培养基培养，诱导出不定芽；
生根培养：将叶盘法诱导分化的不定芽，从叶盘上切下，取高度为0.5cm，转移至生根培养基中，获得生根试管苗；
最后，对所得的生根试管苗进行清洗，移至珍珠岩、草炭土、腐殖质的混合基质中进行栽种。
叶盘法诱导不定芽培养即叶盘法诱导不定芽分化培养；叶盘法诱导不定芽培养基即叶盘法诱导不定芽分化培养基；
所述的增殖培养基为：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.1～2.5mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.1～0.5mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂4～8g·L-1，诱导出丛生芽。增殖培养基优选为：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6g·L-1，丛生芽增殖率为1:3～5。
所述的叶盘法诱导不定芽培养基为：：MS+玉米素(ZT)0.15～2.5mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.1～0.5mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂4～8g·L-1。叶盘法诱导不定芽培养基优选为：MS+玉米素(ZT)1.0mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6g·L-1，叶盘分化率为95％，每片叶盘上可以再生出10～15株整齐细小的不定芽。
所述的生根培养基为1/2MS+萘乙酸(NAA)0.1～2.5mg·L-1+蔗糖15～25g·L-1+琼脂4～8g·L-1。生根培养基优选为：1/2MS+萘乙酸(NAA)1.0mg·L-1+蔗糖20g·L-1+琼脂6g·L-1，生根率最高达到95％，诱导生成的根数量众多，长势旺盛。
所述的初代培养基为：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.15～0.25mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.15～0.25mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂4～8g·L-1。优选为MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.2mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.18mg·L-1+蔗糖31g·L-1+琼脂6g·L-1。
作为优选，所述的大叶蚁塔无菌外植体的获得方法为：取大叶蚁塔肥厚的茎尖，切取成为长度0.5～1cm、直径为0.3～0.6cm的圆柱体，并使顶芽生长点位于圆柱体的中央，保留两片叶柄基部，保护生长点，用洗洁精擦洗表面，流水冲洗20分钟，再进行消毒处理；消毒处理方法是：先用72％浓度的酒精消毒30～60s，再用无菌水冲洗3～4次，然后用加有2～4滴吐温-80油酸酯的0.1～0.2％的升汞液浸泡15～30分钟，无菌水冲洗至无残留，得到无菌外植体。
作为优选，所述的初代培养、增殖培养、叶盘法诱导不定芽培养和生根培养的培养条件均为无菌环境，光周期为10～15h/d，光照强度1500～2500lx，培养温度为室温，初代培养的周期为22～28天，增殖培养的周期为28～32天，叶盘法诱导不定芽发生培养的周期为18～22天，生根培养的周期为28～32天。
作为优选，所述的生根培养步骤中：将生根试管苗置于自然环境中6～10天，取出洗净根部，用500～600倍托布津水溶液浸泡数秒，移栽到草炭土、珍珠岩和腐殖质的混合基质中，起始30天内保持苗的叶面湿润，相对湿度为95％，并适当遮阳，待新的根系发育完整后，再逐渐降低湿度，加强光强至全光照，成活率可以达到90％。
作为优选，所述的生根试管苗移栽入混合基质的营养成分为草炭土:珍珠岩:腐殖质＝1:1:1。
本发明的目的在于设计一种大叶蚁塔快繁技术，寻找适用于大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的技术方案，生产的大叶蚁塔种苗品质高，一致性好，从幼苗期开始驯化，使之能逐步适应上海甚至长三角的土壤条件和气候条件，让市民早日欣赏到这一奇特植物。
本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：本发明将大叶蚁塔的年繁殖系数由自然状态下的1:1，提高到1:1000000，成本由原来的每株80～100元，降低至每株1～2元，提供了一种周期短，繁殖系数高、生产步骤衔接紧密、成本低廉的大叶蚁塔组培育苗方法。生产得到的大叶蚁塔种苗品质高，一致性好，并且从幼苗开始驯化，能逐步适应上海甚至长三角地区的土壤气候条件，具有广阔的市场前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1
一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法，包括下列步骤：取大叶蚁塔无菌外植体，在无菌环境下，经初代培养、增殖培养、叶盘法诱导不定芽培养、生根培养，获得生根试管苗，进行栽种。
初代培养为：选择并清洗、消毒处理茎尖获得起始的无菌外植体，接种到初代培养基上，进行初代培养，获得无菌苗，其中初代培养基为：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.15～0.25mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.15～0.25mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂4～8g·L-1；
增殖培养：是将初代培养的无菌苗转入增殖培养基，诱导丛生芽，该增殖培养基为：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.1～2.5mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.1～0.5mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂4～8g·L-1，诱导出丛生芽；
叶盘法诱导不定芽培养：取无菌苗的幼嫩叶片，转移至不定芽诱导培养基培养，该培养基为：MS+玉米素(ZT)0.15～2.5mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.1～0.5mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂4～8g·L-1；
生根培养：将叶盘法诱导分化的不定芽，从叶盘上切下，取高度为0.5cm左右，转移至生根培养基中，获得生根试管苗，该生根培养基为1/2MS+萘乙酸(NAA)0.1～2.5mg·L-1+蔗糖15～25g·L-1+琼脂4～8g·L-1；
最后，对所得的生根试管苗进行清洗，移至珍珠岩、草炭土、腐殖质的混合基质中进行栽种。
大叶蚁塔无菌外植体的获得方法为：取大叶蚁塔肥厚的茎尖，切取成为长度0.5～1cm，直径为0.3～0.6cm的圆柱体，并使顶芽生长点位于圆柱体的中央，保留两片叶柄基部，保护生长点，用洗洁精擦洗表面，流水冲洗20分钟，再进行消毒处理；消毒处理方法是：先用72％浓度的酒精消毒30～60s，再用无菌水冲洗3～4次，然后用加有2～4滴吐温-80(油酸酯)的0.1～0.2％的升汞液浸泡15～30分钟，无菌水冲洗至无残留，得到无菌外植体。
增殖培养基为：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6g·L-1，丛生芽增殖率为1:3～5。
叶盘法诱导不定芽培养基为：MS+玉米素(ZT)1.0mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6g·L-1，叶盘分化率为95％，每片叶盘上可以再生出10～15株整齐细小的不定芽。
生根培养基为：1/2MS+萘乙酸(NAA)1.0mg·L-1+蔗糖20g·L-1+琼脂6g·L-1，生根率最高达到95％，诱导生成的根数量众多，长势旺盛。
初代培养、增殖培养、叶盘法诱导不定芽发生和生根培养的培养条件均为无菌环境，光周期为10～15h/d，光照强度1500～2500lx，培养温度为室温。初代培养的周期为22～28天，增殖培养的周期为28～32天，叶盘法诱导不定芽发生培养的周期为18～22天，生根培养的周期为28～32天。
生根培养步骤中：将生根试管苗置于自然环境中6～10天，取出洗净根部，用500～600倍托布津水溶液浸泡数秒，移栽到草炭土、珍珠岩和腐殖质的混合基质中，起始30天内保持苗的叶面湿润，相对湿度为95％左右，并适当遮阳，待新的根系发育完整后，再逐渐降低湿度，加强光强至全光照，成活率可以达到90％。生根试管苗移栽入混合基质的营养成分为草炭土:珍珠岩:腐殖质＝1:1:1。
采用本发明所提供的方法，对加快大叶蚁塔的繁殖速度，是一种很有效的途径，一旦得到无菌苗后，可以利用无菌苗进行增殖培养，并取其叶片诱导个体较小的不定芽，不定芽生根和移栽成活后，即再生为完整植株，形成了一个良好的生产体系。
实施例2
一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法，包括下述步骤：
a、选择生长健壮，无病虫害大叶蚁塔茎尖做为起始外植体，用洗洁精擦洗表面，流水冲洗20分钟，再进行消毒处理。
b、将消毒处理后的茎尖接种到初代培养基上，进行初代培养；
c、将初代培养的无菌苗转入增殖培养基，该增殖培养基为MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.1～2.5mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.1～0.5mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂4～8g·L-1，诱导无菌苗的增殖；
d、取无菌苗的幼嫩叶片，转移至不定芽诱导培养基培养，该培养基为MS+玉米素(ZT)0.15～2.5mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.1～0.5mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂4～8g·L-1
e、将叶盘上分化出的高度为0.5cm的试管苗分切后，转移至生根培养基，该生根培养基为1/2MS+萘乙酸(NAA)0.1～2.5mg·L-1+蔗糖15～25g·L-1+琼脂4～8g·L-1。
f、对所得的生根试管苗进行清洗，移至珍珠岩、草炭土、腐殖质的混合基质中进行栽种。
步骤a中，取大叶蚁塔茎尖，切取成为长度0.5～1cm，直径为0.3～0.6cm的圆柱体，并使顶芽生长点位于圆柱体的中央，保留两片叶柄基部保护生长点，进行消毒处理。步骤a中，先用72％浓度的酒精消毒30～60s，再用无菌水冲洗3～4次，然后用加有2～4滴吐温80的0.1～0.2％的升汞液浸泡15～30分钟，用无菌水冲洗至无残留，得到无菌的外植体。
在上述方案的基础上，步骤a中，所述的外植体长度为0.5～1cm，可以为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1cm，直径为0.3～0.6cm，可以为0.3、0.4、0.5、0.6的圆柱体。在上述方案的基础上，步骤a中，所述的清洗消毒处理的方法包括：取大叶蚁塔茎尖，用水冲洗干净，去除叶片，切成圆柱体，并使生长点位于圆柱体的中央，保留两片叶柄基部保护生长点，先用72％浓度的酒精消毒30～60s，再用无菌水冲洗3～4次，然后用加有2～4滴吐温80的0.1～0.2％的升汞液浸泡15～30分钟，用无菌水冲洗至无残留无异味，得到无菌的外植体。具体的，72％浓度酒精消毒时间可以为30s、40s、50s、60s，升汞液浓度可以为0.1％、0.15％、0.2％，，浸泡时间可以为15、18、20、25、28、30分钟。
步骤b中，将步骤a中所得到的无菌外植体接种到初代培养基MS+6-BA0.15～0.25mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.15～0.25mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂4～8g·L-1。
在上述方案的基础上，步骤b中，所述初代培养基为MS+6-BA0.15～0.25mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.15～0.25mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂4～8g·L-1。具体的，在初代培养基中，6-BA的激素浓度可以为0.15、0.18、0.2、0.22、0.25mg·L-1，萘乙酸(NAA)的激素浓度可以为0.15、0.18、0.2、0.22、0.25mg·L-1，蔗糖的浓度可以为25、28、30、32、35g·L-1，琼脂的浓度可以为4、5、6、7、8g·L-1。在初代培养过程中，培养条件为无菌室内光周期为10～15h/d，优选12h/d，光照强度1500～2500lx，优选2000lx，培养温度为室温，优选25℃，培养周期为22～28天，优选25天。
步骤c中，所述的最佳增殖培养基为MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6g·L-1，丛芽增殖率为1：3～5。
在上述方案的基础上，步骤c中，所述增殖培养基为MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.1～2.5mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.1～0.5mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂4～8g·L-1。具体的，6-苄氨基嘌呤(6-BA)的激素浓度可以为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、mg·L-1，萘乙酸(NAA)的激素浓度可以为0.1、0.2、0.4、0.5mg·L-1，蔗糖的浓度可以为25，28，30，32、35g·L-1，琼脂的浓度可以为4、5、6、7、8g·L-1。所述的增殖培养基最佳的激素组合及浓度为：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6g·L-1；在增殖培养过程中，培养条件为无菌室内光周期为10～15h/d，优选12h/d，光照强度1500～2500lx，优选2000lx，培养温度为室温，优选25℃，培养周期为28～32天，优选30天，由此大叶蚁塔试管苗的月增殖系数为1:3～5。
步骤d中，所述的叶盘法诱导不定芽最佳培养基为MS+玉米素(ZT)1.0mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6g·L-1，叶盘分化率为95％，每片叶盘上可以再生出10～15株整齐细小的不定芽。
在上述方案的基础上，步骤d中，所述的叶盘法诱导不定芽发生培养基为MS+玉米素(ZT)0.15～2.5mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.1～0.5mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂4～8g·L-1。具体的，在叶盘法诱导不定芽发生的培养基中，玉米素(ZT)的激素浓度可以为0.15、0.25、0.3、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5mg·L-1，萘乙酸(NAA)的激素浓度可以为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg·L-1，蔗糖的浓度可以为25、28、30、32、35g·L-1，琼脂的浓度可以为4、5、6、7、8g·L-1。优选的叶盘不定芽分化培养基为：MS+玉米素(ZT)1.0mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6g·L-1；在叶盘诱导不定芽培养过程中，培养条件为无菌室内光周期为10～15h/d，优选12h/d，光照强度1500～2500lx，优选2000lx，培养温度为室温，优选25℃，培养周期为18～22天，优选20天，由此叶盘分化率为95％，每片叶盘上可以再生出10～15株整齐细小的不定芽。
步骤e中，所述的最佳生根培养基为1/2MS+萘乙酸(NAA)1.0mg·L-1+蔗糖20g·L-1+琼脂6g·L-1，生根率最高达到95％，诱导生成的根数量众多，长势旺盛。
在上述方案的基础上，步骤e中，所述生根培养基为1/2MS+萘乙酸(NAA)0.1～2.5mg·L-1+蔗糖15～25g·L-1+琼脂4～8g·L-1。具体萘乙酸(NAA)的激素浓度可以为0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg·L-1，，蔗糖的浓度可以为15、18、20、22、25g·L-1，琼脂的浓度可以为4、5、6、7、8g·L-1。所述的生根培养基最佳的激素和矿质元素及碳源组合浓度值为：1/2MS+萘乙酸(NAA)1.0mg·L-1+蔗糖20g·L-1+琼脂6g·L-1；培养条件为无菌室内光周期为10～15h/d，优选12h/d，光照强度1500～2500lx，优选2000lx,培养温度为室温，优选25℃，生根培养的周期为28～32天，优选30天。由此生根率最高可达95％，根数量众多。
步骤b至e中，初代培养、增殖培养、叶盘法诱导不定芽培养和生根培养的培养条件均为无菌环境，光周期为10～15h/d，光照强度1500～2500lx，培养温度为室温。步骤b至e中，初代培养的周期为22～28天，增殖培养的周期为28～32天，叶盘不定芽诱导培养的周期为18～22天，生根培养的周期为28～32天。
步骤f中，将生根试管苗置于自然环境中6～10天，取出洗净根部，用500～600倍托布津水溶液浸泡数秒，移栽到草炭土、珍珠岩和腐殖质的混合基质中，起始30天内保持苗的叶面湿润，相对湿度为95％，并适当遮阳，待萌发新的根系后，逐渐加强光照至全光照，进行栽种。步骤f中，生根试管苗移栽入混合基质的营养成分为草炭土:珍珠岩:腐殖质＝1:1:1。
在上述方案的基础上，步骤f中，将生根试管苗至于自然环境中6～10天，一般为一周，取出洗净，用500～600倍托布津水溶液浸泡数秒，移栽到草炭土、珍珠岩和腐殖质的混合基质中，一般草炭土:珍珠岩:腐殖质＝1:1:1，起始30天内采用喷雾保持苗的叶面湿润，相对湿度为95％左右，并适当遮阳，待其萌发新根后，逐渐加强光照至全光照。
实施例3
一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法，包括大叶蚁塔无菌外植体经初代培养、增殖培养、叶盘法诱导不定芽培养和生根培养获得再生植株，进行移栽，包括下述步骤：
第一步：大叶蚁塔茎尖肥大，长期深埋于土壤中，感染各种外源微生物机会多，因此消毒获得完全无菌的材料非常困难。经过反复实验，本发明得到以下最佳外植体处理方式：于天气晴朗的中午，选择生长健壮，无病虫害大叶蚁塔茎尖做为外植体，切取成为长度0.5～1cm，直径为0.3～0.6cm的圆柱体，并使顶芽生长点位于圆柱体的中央，保留两片叶柄基部保护生长点，以减弱消毒处理时消毒液对生长点分生细胞的伤害。先用72％浓度的酒精消毒30～60s，再用无菌水冲洗3～4次，然后用加有2～4滴吐温80的0.1～0.2％的升汞液浸泡15～30分钟，用无菌水冲洗至无残留无异味。
第二步：在步骤a中消毒所得到的无菌外植体接种到初代培养基MS+6-BA0.15～0.25mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.15～0.25mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂4～8g·L-1。培养基pH调为5.8左右，一个试管接种一个，避免交叉感染，于光周期为12h/d，光照强度为2000lx，培养温度为25℃的无菌室内培养25天左右开始萌发。
无菌操作室在使用前30分钟，打开紫外灯和超净工作台，紫外灯在关闭10分钟后，才可进行接种操作；接种用具在121℃条件下高压灭菌35分钟，培养基在121℃条件下高压灭菌18分钟。
第三步：将初代培养获得的健壮一致的无菌苗转到增殖培养基MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.1～2.5mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.1～0.5mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂4～8g·L-1。结果表明，大叶蚁塔增殖需要一定浓度的细胞分裂素，当6-苄氨基嘌呤(6-BA)为0.1mg·L-1时，增殖速度非常缓慢，当6-苄氨基嘌呤(6-BA)浓度为1mg·L-1时，对大叶蚁塔丛生芽的增殖效果最好，而当浓度达到2.5mg·L-1时，大叶蚁塔出现玻璃化、僵化的畸形现象。添加生长素萘乙酸(NAA)0.1mg·L-1时，对大叶蚁塔的增殖有促进作用，生长素萘乙酸(NAA)浓度超过0.2mg·L-1时，基部又容易形成大块的愈伤组织，阻碍试管苗吸收营养，选定MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6g·L-1培养基为大叶蚁塔增殖的最佳培养基，在该培养基上产生的丛生芽发育正常，叶色浓绿，长势旺盛，无玻璃化现象，可以做为大叶蚁塔扩繁增殖的培养基。
第四步：大叶蚁塔试管苗高度小于0.5cm的，诱导分化率低，高度为2cm的分化效果好，但因其长势快，需采用容积较大的培养瓶，由此增加了生产成本，与分化出的种苗大小不一，为生根操作增加分拣工序，因此尝试叶盘法诱导不定芽分化。叶盘法诱导不定芽培养基为MS+玉米素(ZT)0.15～2.5mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.1～0.5mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂4～8g·L-1。玉米素(ZT)在0.15～2.5mg·L-1的浓度范围内，接种10d即观察到叶片边缘卷曲，逐渐形成瘤状突起，30d成为可见的不定芽，培养基MS+玉米素(ZT)1.0mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6g·L-1诱导率最高达到95％。每片叶盘上可以再生出10～15株数量不等，但整齐细小的试管苗，由此每瓶可容纳50～100株试管苗，再把此试管苗用做生根培养，操作简单，试管苗整齐均一，成本大大降低。在叶盘法诱导不定芽发生的培养过程中，培养条件为无菌室内光周期优选12h/d，光照强度优选2000lx，培养温度优选25℃，培养周期优选20天，试管苗长至0.5cm高，比较整齐可以用来诱导生根。
第五步：本发明中生根培养基为1/2MS+萘乙酸(NAA)0.1～2.5mg·L-1+蔗糖15～25g·L-1+琼脂4～8g·L-1。挑选叶盘法分化诱导的不定芽，高度控制在0.5cm左右，转接入生根培养基。大量元素减半的1/2MS比MS更有利于生根，降低蔗糖含量至20g·L-1时，也能够提高生根率及平均生根数。当萘乙酸(NAA)浓度为0.5mg·L-1时，生根率比较低；当上调至2.5mg·L-1时，生根率虽然可以达到100％，但是在试管苗的基部容易出现愈伤化组织，不利于后期的移栽；当萘乙酸(NAA)浓度为1mg·L-1时，生根率最高达到95％，每株试管苗上诱导生成的根多达10条，基部无愈伤组织生成，并且其根尖部分为红色，证明其分生细胞分裂活跃，生命力旺盛，吸收营养迅速，是该植物生长健壮的原因所在。大叶蚁塔试管苗最适生根培养基确定为1/2MS+萘乙酸(NAA)1mg·L-1+蔗糖20g·L-1+琼脂6g·L-1。培养条件为无菌室内光周期优选12h/d，光照强度优选2000lx，培养温度优选25℃，生根培养的周期优选30天。由此生根率最高可达95％，诱导生成的根数量众多。
第六步：将大叶蚁塔生根试管苗置于自然环境中6～10天，一般为一周，取出洗净，用500～600倍托布津水溶液浸泡数秒，移栽到草炭土、珍珠岩和腐殖质的混合基质中，本发明中草炭土:珍珠岩:腐殖质＝1:1:1，起始30天内采用喷雾保持苗的叶面湿润，相对湿度为95％左右，并适当遮阳，待萌发新根后，逐渐加强光照至全光照。大叶蚁塔成活率可以达到90％。试管苗移栽第4个月时，植株老叶逐渐褪去，萌发出了新叶，较之刚出瓶的试管苗，叶片厚度加大，在常规管理下，已能安然生长，有望在上海以及长三角各处推广试种。移栽成活4个月的试管苗，新叶厚度加大。
采用本发明所提供的方法，对加快大叶蚁塔的繁殖速度，是一种很有效的途径，一旦得到无菌苗后，可以利用无菌苗进行增殖培养，并取其叶片诱导个体较小的不定芽，不定芽生根和移栽成活后，即再生为完整植株，形成了一个良好的生产体系。年繁殖系数由自然状态下的1:1，提高到1:1000000，成本由原来的每株80～100元，降低至每株1～2元。提供了一种周期短，繁殖系数高、生产步骤衔接紧密、成本低廉的大叶蚁塔组培育苗方法。生产得到的大叶蚁塔种苗品质高，一致性好，并且从幼苗开始驯化，能逐步适应上海的土壤气候条件，具有广阔的市场前景。
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。
Claims (5)
1.一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于，包括下列步骤：取大叶蚁塔无菌外植体，在无菌环境下，经初代培养、增殖培养、叶盘法诱导不定芽培养、生根培养，获得生根试管苗，进行栽种，初代培养为：选择并清洗、消毒处理大叶蚁塔茎尖获得起始的无菌外植体，接种到初代培养基上，进行初代培养，获得无菌苗；
增殖培养：是将初代培养的无菌苗转入增殖培养基，诱导丛生芽；
叶盘法诱导不定芽培养：取诱导出丛生芽的无菌苗的幼嫩叶片，转移至叶盘法诱导不定芽诱导培养基培养，诱导出不定芽；
生根培养：将叶盘法诱导分化的不定芽，从叶盘上切下，取高度为0.5cm，转移至生根培养基中，获得生根试管苗；
最后，对所得的生根试管苗进行清洗，移至珍珠岩、草炭土、腐殖质的混合基质中进行栽种；
所述的增殖培养基为：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.1～2.5mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.1～0.5mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂4～8g·L-1；
所述的叶盘法诱导不定芽培养基为：MS+玉米素(ZT)0.15～2.5mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.1～0.5mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂4～8g·L-1；
所述的生根培养基为：1/2MS+萘乙酸(NAA)0.1～2.5mg·L-1+蔗糖15～25g·L-1+琼脂4～8g·L-1；
所述初代培养基为：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.15～0.25mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.15～0.25mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂4～8g·L-1。
2.根据权利要求1所述的一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于：所述的大叶蚁塔无菌外植体的获得方法为：取大叶蚁塔肥厚的茎尖，切取成为长度0.5～1cm、直径为0.3～0.6cm的圆柱体，并使顶芽生长点位于圆柱体的中央，保留两片叶柄基部，保护生长点，用洗洁精擦洗表面，流水冲洗20分钟，再进行消毒处理；消毒处理方法是：先用72％浓度的酒精消毒30～60s，再用无菌水冲洗3～4次，然后用加有2～4滴吐温-80的0.1～0.2％的升汞液浸泡15～30分钟，无菌水冲洗至无残留，得到无菌外植体。
3.根据权利要求1所述的一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于：所述的初代培养、增殖培养、叶盘法诱导不定芽培养和生根培养的培养条件均为无菌环境，光周期为10～15h/d，光照强度1500～2500lx，培养温度为室温，初代培养的周期为22～28天，增殖培养的周期为28～32天，叶盘法诱导不定芽发生培养的周期为18～22天，生根培养的周期为28～32天。
4.根据权利要求1所述的一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于：所述的生根培养步骤中：将生根试管苗置于自然环境中6～10天，取出洗净根部，用500～600倍托布津水溶液浸泡数秒，移栽到草炭土、珍珠岩和腐殖质的混合基质中，起始30天内保持苗的叶面湿润，相对湿度为95％，并适当遮阳，待新的根系发育完整后，再逐渐降低湿度，加强光强至全光照。
5.根据权利要求1所述的一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于：所述的生根试管苗移栽入混合基质的营养成分为草炭土:珍珠岩:腐殖质＝1:1:1。
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