CN104145825B

CN104145825B - 朝鲜蓟试管实生苗茎尖快繁育苗的方法

Info

Publication number: CN104145825B
Application number: CN201410449833.6A
Authority: CN
Inventors: 李进进; 廖俊杰; 张建军; 曾佑炜; 高阳林
Original assignee: DONGGUAN CITY RUISHEN BIOTECHNOLOGY Co Ltd; Guangdong Industry Technical College
Current assignee: DONGGUAN CITY RUISHEN BIOTECHNOLOGY Co Ltd; Guangdong Industry Technical College
Priority date: 2014-09-04
Filing date: 2014-09-04
Publication date: 2016-04-13
Anticipated expiration: 2034-09-04
Also published as: CN104145825A

Abstract

本发明公开一种朝鲜蓟试管实生苗茎尖快繁育苗的方法。本发明利用种子消毒后进行试管内播种，获得大量无菌实生苗；并采取合适大小的试管实生苗茎尖进行从芽诱导获得继代无根苗；将无根苗进行生根培育获得朝鲜蓟优质种苗。因朝鲜蓟种皮坚硬，对消毒剂有较强的耐受力，因此用本发明的消毒剂消毒后无污染率可达80％以上；且进行适当的物理处理后的种子消毒后发芽率可达到85％以上。获得的无菌实生苗采取其茎尖进行诱导，成活率可达到90％，丛芽诱导成功率可达85％；且进行试管播种成苗后无需再消毒，成功率可达90％以上，无疑达到快繁种苗并降低成本的目的。本发明的方法具有种苗快繁效率高、成本低、前景好等优势。

Description

朝鲜蓟试管实生苗茎尖快繁育苗的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种朝鲜蓟试管实生苗茎尖快繁育苗的方法。

背景技术

朝鲜蓟，别名菊蓟、菜蓟，学名CynarascolymusL.，为菊科(Comopsite)菜蓟属多年生草本植物。并且是一种药食同源植物，既是一种很好的菜肴，同时有很好的药用价值，其花蕾或叶含菜蓟素、菜蓟苦素、大海米菊素、木犀草甙等成分，在欧洲的德国、法国、英国、意大利等国家，朝鲜蓟用于防治消化不良、便秘、腹泻、肝脏和胆囊疾病以及高血脂、动脉硬化、高血糖、黄胆等；在巴西，朝鲜蓟用于糖尿病、高血压的预防。同时，朝鲜蓟最突出的特点是同时具备保护和恢复肝脏细胞的功能，也是其它降脂降糖产品所无法替代的。在我国，朝鲜蓟主要加工成罐头成品出口，目前世界上朝鲜蓟罐头年需求量约10万吨以上。近年来，美国及西欧等发达国家对朝鲜蓟的消费和进口量不断增加，罐头制品在国际市场供不应求(李进进.朝鲜蓟继代增殖快繁方法探讨[J].种子，2011(1))。

目前朝鲜蓟的种植方法多采用种子播种，露天栽种，而朝鲜蓟是异化授粉植物，在我国大多数地区只开花不结果，种子繁育率低，虽然种子昂贵但我国几个主要种植地区(如湖南常德)每年都需要大量进口种子，这不仅成本高，而且经常因茬口接不上而延误农时；另一种是通过组培快繁技术，但外植体是采用露地健壮植株的分蘖苗茎尖消毒后进行诱导培育朝鲜蓟种苗，其缺点和不足是朝鲜蓟表面密布绒毛，消毒效果不理想，而且幼嫩茎尖常因消毒剂的副作用导致褐化或死忙，影响成苗率(张平喜，朝鲜蓟的组织培养与快速繁殖技术研究[J].中国园艺文摘，2011.6)。为改善传统的育种方法，适应国际市场的需要，迫切需要改善朝鲜蓟的组培快繁途径。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种朝鲜蓟试管实生苗茎尖快繁育苗的方法。利用种子消毒后进行试管内播种，获得大量无菌实生苗；并采取合适大小的试管实生苗茎尖进行从芽诱导获得继代无根苗；将无根苗进行生根培育获得朝鲜蓟优质种苗，从而达到快速繁殖朝鲜蓟种苗的目的。

因种子消毒比露地实生苗茎尖消毒容易而且成活率高，进行试管播种成苗后无需再消毒，成功率可达90％以上，无疑达到快繁种苗并降低成本的目的。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种朝鲜蓟试管实生苗茎尖快繁育苗的方法，包括如下步骤：

(1)将朝鲜蓟(CynarascolymusL.)种子进行物理处理后，再经消毒剂消毒后在种子培养基中进行试管内播种、培育，将培育发芽的种子挑出至新鲜的种子培养基中进行自然光照，获得无菌实生苗；

(2)在无菌条件中进行如下操作，将步骤(1)获得的无菌实生苗切取0.7～1.0mm的实生苗茎尖转入丛芽诱导培养基中进行诱导，再转入自然光照下进行培养，获得丛芽，然后将丛芽转至继代培养基中，经继代培养后获得无根苗；

(3)将步骤(2)获得的无根苗转至试管生根培养基中，进行试管生根培育获得朝鲜蓟优质种苗。

步骤(1)中所述的物理处理的条件优选为黑暗条件下30～35℃温水中恒温浸泡12～24h；更优选为黑暗条件下30℃温水中恒温浸泡24h；

步骤(1)中所述的消毒剂的组成及消毒条件优选为75％(v/v)酒精15s+2％(v/v)NaClO(10～15)min+1g/LHgCl₂(10～15)min；更优选为75％(v/v)酒精15s+2％(v/v)NaClO(10～15)min+1g/LHgCl₂15min；适当提高1g/LHgCl₂的消毒时间，污染率会随着降低。

步骤(1)中的物理处理后的种子用纱布松散包扎，消毒剂处理后用无菌水浸洗4～5次；

步骤(1)中所述的种子培养基的组成优选为MS培养基+GA₃(0～3.0)mg/L+NAA(0～0.2)mg/L+活性炭(0～2)g/L+卡拉胶(6.8～7)g/L+蔗糖30g/L，pH5.5～5.7，其中，NAA为零时，GA₃和活性炭均不为零；更优选为MS培养基+GA₃1.0mg/L+活性炭2g/L+卡拉胶7g/L+蔗糖30g/L，pH5.6；所述的GA₃，指赤霉素；所述的NAA，指a-萘乙酸；

步骤(1)中所述的培育的条件优选为黑暗条件下，环境温度23～28℃培育15～25天，培养湿度为70％～85％；

步骤(1)中所述的进行自然光照的条件优选为23～28℃自然光照30～40天，湿度为70％～85％；

步骤(2)中所述的丛芽诱导培养基的组成优选为MS培养基+6-BA(2.0～5.0)mg/L+NAA(0.2～0.5)mg/L+KT(0～0.2)mg/L+琼脂6.8g/L+蔗糖30g/L，pH5.6；更优选为MS培养基+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+KT0.2mg/L+琼脂6.8g/L+蔗糖30g/L，pH5.6；所述的6-BA，指6-苄基腺嘌呤；所述的KT，指激动素；

步骤(2)中所述的诱导的条件优选为黑暗条件下23～28℃诱导培养10～15天；

步骤(2)中所述的自然光照下进行培养的条件优选为待茎尖膨大1～2倍后转入培养室自然光下培养15～20天，待开始转绿而且有芽点出现时适当增加光照强度至2500～3000lux，再培养25～35天后获得丛芽；

步骤(2)中所述的继代培养基的组成优选为MS培养基+NAA(0～0.5)mg/L+GA₃(0～0.5)mg/L+6-BA(0～1.5)mg/L+CM(椰子汁)(0～50)g/L+卡拉胶7g/L+蔗糖30g/L，pH5.5～5.7，其中，NAA、GA₃、6-BA与CM不能同时为零；更优选为MS培养基+GA₃0.5mg/L+6-BA1.5mg/L+CM(椰子汁)50g/L卡拉胶7g/L+蔗糖30g/L，pH5.6；所述的GA₃，指赤霉素；所述的CM(椰子汁)，从椰果中抽取的原液；

步骤(2)中所述的继代培养的条件优选为温度23～28℃培养15～25天，湿度为70％～85％，光照强度3000～3500lux；

步骤(3)中所述的试管生根培养基的组成优选为1/2MS培养基+IBA(0.2～1.0)mg/L+香蕉泥(0～50)g/L+活性炭(0～2)g/L+琼脂6.8g/L+蔗糖20g/L，pH5.5～5.8；更优选为1/2MS培养基+IBA0.5mg/L+香蕉泥50g/L+活性炭2g/L+琼脂6.80g/L+蔗糖20g/L，pH5.7；所述的IBA，指吲哚丁酸；所述的香蕉泥，指成熟香蕉果肉匀浆物；所述1/2MS培养基是指MS培养基的大量元素减半；

步骤(3)中所述的生根培育的条件优选为温度23～28℃培育20～30天，湿度为70％～85％，光照强度3000～4500lux；

本发明的机理是：利用植物组织培养的原理和技术进行种苗扩繁。植物组织培养(又称为离体培养、植物克隆)，简称组培，是将植物的离体材料(器官、组织、细胞、原生质体等)无菌培养，使其生长、分化、增殖，再生出完整植株或生产次生代谢物质的技术。植物组织培养的特点有：培养材料经济；培养条件可以人为控制；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于工厂化生产和自动化控制等。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

(1)利用种子进行消毒，因种皮坚硬，对消毒剂有较强的耐受力，因此使用本发明的消毒剂消毒后无污染率可达80％以上。

(2)获得的无菌实生苗采取其茎尖进行诱导，成活率可达到90％，丛芽诱导成功率可达85％；

(3)因朝鲜蓟种皮较坚硬，进行适当的物理处理后的种子消毒后发芽率可达到85％以上；

(4)本发明的方法具有种苗快繁效率高、成本低、前景好等优势。

附图说明

图1是经消毒处理后进行试管播种的朝鲜蓟种子的示意图。

图2是朝鲜蓟种子发芽后自然形式的示意图。

图3是朝鲜蓟茎尖诱导后的丛芽的示意图。

图4是朝鲜蓟种苗楼顶种植着生的花苞的示意图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：

(1)从北京花仙子园艺有限公司购进朝鲜蓟(CynarascolymusL.)优质种子；

(2)先将种子进行物理处理(黑暗条件下，30℃温水中恒温浸泡24小时)，然后在超净工作台上用特定的消毒剂(75％(v/v)酒精15s+2％(v/v)NaClO10min+1g/LHgCl₂15min)，进行种子消毒，再用无菌水浸洗4～5次，然后接种至种子培养基(其配方为MS培养基+GA₃1.0mg/L+活性炭2g/L+卡拉胶(CAS9000-07-1)7g/L+蔗糖30g/L，pH5.6)中进行暗培养，要求培养室温度23～28℃，湿度75％～85％；(见图1)

(3)15～25天后陆续有种子发芽，将发芽的种子挑出至新鲜的种子培养基(配方与步骤(2)中的相同)中进行自然光照，温度23～28℃，湿度75％～85％，30～40天后获得无菌实生苗(见图2)；总发芽率可达到80％以上；

(4)当无菌实生苗高3.5cm左右时，切取0.7mm～1.0mm的实生苗茎尖在丛芽诱导培养基(MS培养基+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+KT0.2mg/L+琼脂6.8g/L+蔗糖30g/L，pH5.6)中进行丛芽诱导(培养室温度23～28℃，10～15天，湿度75％～85％，暗培养)，待茎尖膨大1～2倍后转入培养室自然光下培养15～20天，待开始转绿而且有芽点出现时适当增加光照至2500～3000lux，再培养25～35天后获得丛芽(见图3)，丛芽诱导成功率可达85％；

(5)将步骤(4)获得的丛芽转至继代培养基(其配方为MS培养基+GA₃0.5mg/L+6-BA1.5mg/L+CM(椰子汁)50g/L+卡拉胶7g/L+蔗糖30g/L，pH5.6)中，进行继代培养，培养室温度23～28℃，15～25天，湿度75％～85％，光照强度3000～3500lux，获得健壮无根苗；

(6)将步骤(5)中获得的健壮无根苗在试管生根培养基(1/2MS培养基+IBA0.5mg/L+香蕉泥50g/L+活性炭2g/L+琼脂6.8g/L+蔗糖20g/L，pH5.7)中进行生根培育，培养室温度23～28℃，培养20～30天，湿度75％～85％，光照强度3500～4000lux，获得朝鲜蓟优质种苗；

(7)将步骤(6)获得的种苗露地繁育(见图4)。

实施例2：

本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤(2)采用消毒剂配方：75％(v/v)酒精15s+2％(v/v)NaClO15min+1g/LHgCl₂15min进行种子消毒，再用无菌水浸洗4～5次，然后接种至种子培养基上，可达到同样理想的效果。可见，1g/LHgCl₂的消毒溶液对朝鲜蓟种子的消毒起着重要的作用。

实施例3：

本实施例中的步骤(1)、(2)、(3)、(4)与实施例1中的步骤(1)、(2)、(3)、(4)相同。

(5)将步骤(4)获得的丛芽转至继代培养基(其配方为MS培养基+NAA0.2mg/L+6-BA1.0mg/L+CM(椰子汁)50g/L+卡拉胶7g/L+蔗糖30g/L，pH5.7)中进行继代培养，培养室温度23～28℃，15～25天，湿度75％～85％，光照强度3000～3500lux，同样可获得健壮无根苗；

(6)将步骤(5)中获得的健壮无根苗在试管生根培养基(1/2MS培养基+IBA0.2mg/L+香蕉泥30g/L+活性炭2g/L+琼脂6.8g/L+蔗糖20g/L，pH5.8)中进行生根培育，培养室温度23～28℃，培养20～30天，湿度75％～85％，光照强度3500～4500lux，亦可获得朝鲜蓟优质种苗；

(7)将步骤(6)获得的种苗露地繁育(结果与图4相近)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种朝鲜蓟试管实生苗茎尖快繁育苗的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将朝鲜蓟(CynarascolymusL.)种子进行物理处理后，再经消毒剂消毒，然后在种子培养基中进行试管内播种、培育，将培育发芽的种子挑出至新鲜的种子培养基中进行自然光照，获得无菌实生苗；

(3)将步骤(2)获得的无根苗转至试管生根培养基中，进行试管生根培育获得朝鲜蓟优质种苗；

步骤(2)中所述的丛芽诱导培养基的组成为MS培养基+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+KT0.2mg/L+琼脂6.8g/L+蔗糖30g/L，pH5.6；

步骤(2)中所述的继代培养基的组成为MS培养基+NAA0.2mg/L+6-BA1.0mg/L+CM50g/L+卡拉胶7g/L+蔗糖30g/L，pH5.5～5.7；或者，MS培养基+GA₃0.5mg/L+6-BA1.5mg/L+CM50g/L+卡拉胶7g/L+蔗糖30g/L，pH5.5～5.7；

步骤(3)中所述的试管生根培养基的组成为1/2MS培养基+IBA0.5mg/L+香蕉泥50g/L+活性炭2g/L+琼脂6.8g/L+蔗糖20g/L，pH5.5～5.8；或者，1/2MS培养基+IBA0.2mg/L+香蕉泥30g/L+活性炭2g/L+琼脂6.8g/L+蔗糖20g/L，pH5.5～5.8；

步骤(2)中所述的诱导的条件为黑暗条件下23～28℃诱导培养10～15天；

步骤(1)中所述的物理处理的条件为黑暗条件下30～35℃恒温浸泡12～24h；

步骤(1)中所述的种子培养基的组成为MS培养基+GA₃1.0mg/L+活性炭2g/L+卡拉胶(6.8～7)g/L+蔗糖30g/L，pH5.5～5.7。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的消毒剂的组成及消毒条件为75％酒精15s+2％NaClO(10～15)min+1g/LHgCl₂(10～15)min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的培育的条件为黑暗条件下，环境温度23～28℃培育15～25天，培养湿度为70％～85％；

步骤(1)中所述的进行自然光照的条件为23～28℃自然光照30～40天，湿度为70％～85％。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的自然光照下进行培养的条件为待茎尖膨大1～2倍后转入培养室自然光下培养15～20天，待开始转绿而且有芽点出现时适当增加光照强度至2500～3000lux，再培养25～35天。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的继代培养的条件为温度23～28℃培养15～25天，湿度为70％～85％，光照强度3000～3500lux。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的生根培育的条件为温度23～28℃培育20～30天，湿度为70％～85％，光照强度3000～4500lux。