CN103858762A - 一种金线莲组织培养快速增殖方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开金线莲组织培养快速增殖方法，对外植体清洗消毒，接入MS培养基，前一周弱光培养，一周后强光培养，光照时间10小时/天，温度23±2℃，培养40天；接入配比为MS培养基、6-BA1.4-1.6mg/L、NAA0.2-0.3mg/L的液体培养基中增殖培养，培养条件为暗培养，温度23±2℃，培养周期45天；壮苗培养基为MS培养基，光照培养，光照时间8小时/天，温度23±2℃，培养周期12-15天；生根培养基配比：1/2MS、香蕉60g/L、活性炭1g/L、水解酪蛋白0.5g/L，光照时间10小时/天，温度23±2℃，培养周期3个月。该方法实现金线莲工业化快速繁育，缩短了培养周期。

Description

一种金线莲组织培养快速增殖方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是指一种金线莲组织培养快速增殖方法。
背景技术
金线莲（Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl）是兰科开唇兰属的多年生草本植物，具有清热解毒、祛风利湿、滋阴润肺及降血压等功效。同时，金线莲株型小巧美观，叶形优美，叶脉金黄色，呈网状排列，具有极高的观赏价值。
然而，金线莲种子自然萌发率和繁殖率低，生长缓慢，加上人为大量采挖及生态环境的破坏，野生金线莲资源日渐枯竭。现有技术中，通过组织培养建立无性繁殖系，对金线莲资源进行保护和合理利用。目前，金线莲培育主要是固体培养基实现芽诱导、增殖与壮苗，其缺陷在于：增殖倍率低，培养时间长，成本高，使得金线莲得不到较快的发展。
金线莲培育的另一种方法为液体培养基培育，液体培养基通过摇床浅层震荡进行金线莲增殖比固体增殖速度更快。液体培养能让所有的外植体充分而均匀的吸收养分，同时能够避免褐化物对培养物生长的影响，有鉴于此，本发明人研发出一种金线莲组织培养快速增殖方法，本案由此产生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种金线莲组织培养快速增殖方法，解决金线莲增殖率低，繁殖周期长及成本高等问题，实现金线莲工业化快速繁育。
为达成上述目的，本发明的解决方案为：
一种金线莲组织培养快速增殖方法，包括以下步骤：
外植体诱导：采取金线莲植株作为外植体，先对外植体进行清洗、消毒，接入不添加激素的MS基本培养基诱导培养，前一周弱光培养，光照强度500-800Lux，一周后强光培养，光照强度1500-2000Lux，光照时间10小时/天，温度23±2℃，培养40天；
增殖培养：接入液体培养基中进液体增殖培养，液体增殖培养基配比：MS培养基、6-BA（6-卞基嘌呤）1.4-1.6 mg/L、NAA（萘乙酸） 0.2-0.3 mg/L，培养条件为暗培养，温度为23±2℃，培养周期45天；
壮苗培养：壮苗培养基为无激素液体改良MS培养基，光照培养，光强为1200-1500Lux，光照时间为8小时/天，温度为23±2 ℃，培养周期为12-15天；
生根培养：生根培养基配比：1/2MS、香蕉60g/L、活性炭1g/L、水解酪蛋白0.5g/L，光照培养，光照时间10 小时/天，光照强度1500-2500 Lux，温度为23±2 ℃，培养周期为3个月。
所述外植体清洗、消毒的具体步骤为：先用洗衣粉水溶液浸泡5 min（分钟），自来水冲洗干净；置于无菌工作台中，75%（体积分数）的酒精消毒30s（秒），无菌水冲洗1次，再用0.1%（质量分数）的升汞（HgCl2）消毒3min，无菌水冲洗3次，最后用10%（质量分数）的次氯酸钠消毒6-8min，无菌水冲洗5次。
所述外植体消毒完成后，吸干水分切成1±0.1 cm的茎段，然后接入不添加激素的MS基本培养基中进行诱导培养，pH5.6-5.8。
所述增殖培养及壮苗培养均采用液体浅层震荡培养，采用直径80cm（厘米）、高100cm耐高温PP组培瓶培养，培养液的量为瓶身的1/6-1/5，接种量为培养液的2/3-3/4，并置于大型工业摇床上，转速80-100r/min。
所述增殖培养每隔15天更换一次培养液并分瓶，45天后转入壮苗培养基中。
采用上述方案后，本发明的种金线莲组织培养快速增殖方法解决了增殖倍率低，培养时间长及生产成本高等问题，实现金线莲工业化快速繁育，缩短了培养周期，45天增殖倍率达25倍。
具体实施方式
运用本发明进行金线莲组织培养的具体实施例：
一、外植体诱导培养
采取健壮的无病虫害的金线莲植株，去除根、根毛、叶片及顶芽，自来水清洗干净，洗衣粉水浸泡5min，然后自来水冲洗干净，移至无菌操作台上。75%的酒精消毒30s，无菌水冲洗1次，0.1%的升汞消毒3min，无菌水冲洗3次，10%的次氯酸钠消毒6-8min，无菌水冲洗5次，沥干水分，放入无菌的接种盘中备用。将消毒好的茎段在接种台上剪成1cm左右，含一个茎节的若干茎段，接种于诱导培养基中，每瓶接一个茎段。若是采用无菌苗直接接种，则只需要在接种台上将组培苗去叶，将茎段剪成1±0.1 cm，含一个茎节的若干茎段，直接接入诱导培养基中进行诱导分化培养。培养条件：前一周弱光培养，光照强度500-800Lux（勒克斯），一周后强光培养，光照强度1500-2000Lux，光照时间10h/天，温度为23±2℃，诱导培养基为不添加激素的MS基本培养基，40天诱导出1-2个腋芽。
二、金线莲液体增殖培养
金线莲经过诱导阶段后，每个茎段带1-2个腋芽，高度在0.2-0.5 cm，接入液体增殖培养基中，液体增殖培养基的量为瓶身的1/6-1/5，接种量为培养液2/3-3/4为宜。本实施例中采用直径80cm，高100 cm耐高温PP组培瓶培养，接种量为10个带1-2个腋芽、高0.5-1.0cm的10个茎段，置于大型工业摇床上进行浅层震荡培养，转速80-100 r/min。培养基配比是MS培养基、6-BA1.4-1.6mg/L、NAA 0.2-0.3mg/L，培养条件是暗培养，培养室温度23±2℃，培养周期45天，每隔15天更换一次培养液并且分瓶，见表1，金线莲通过液体培养基增殖，增殖倍率可达25倍。
表1金线莲不同时间段增殖特点
培养时间 金线莲不同时间的增殖特点（10个茎段/瓶）
15天 对液体增殖培养苗更换培养液及分瓶，增殖的腋芽数目为40-50个，高度为0.5-1.0cm
30天 对液体增殖培养苗进行换液及分瓶，腋芽数增多，80-120个，高度在0.5-2.0cm
45天 腋芽数增多，220-250个，高度0.5-3.0cm
所述6-BA及NAA激素浓度对金线莲液体增殖影响见表2
表2不同激素浓度对金线莲液体增殖的影响
培养基号 6-BA NAA 接种数 培养时间/天 新增株数 增殖系数 株高 生长状况
1 2.0 1.0 10 45 200-250 20-25 0.5-4 芽较多，苗较高，但是偏细
2 2.0 0.5 10 45 300-350 30-35 0.5-3 芽多，苗高，偏细
3 2.0 0.3 10 45 300-350 30-35 0.5-2.5 芽多偏细
4 1.5 1.0 10 45 100-150 10-15 0.5-4 芽较多，直径1.5-3mm，苗高
5 1.5 0.5 10 45 200-250 20-25 0.5-3 芽多，直径1.5-3mm，苗较高
6 1.5 0.3 10 45 200-250 20-25 0.5-2.5 芽多，直径1.5-2.5mm
7 1.0 1.0 10 45 30-50 5-10 0.5-4 芽少，易成球茎
8 1.0 0.5 10 45 50-100 5-10 0.5-3 芽少，苗较粗
9 1.0 0.3 10 45 50-150 5-15 0.5-2.5 芽少、苗较粗
从表2中可以看出，液体增殖倍率的高低与6-BA及NAA浓度有密切关系，一定量的6-BA及NAA对茎段有促进分化和增殖的作用。从表2中可以看出细胞分裂素6-BA浓度为1.5mg/L为最合适，增值倍率高，苗相对粗壮。当6-BA增加到2.0mg/L时，虽然更多芽的分化，但是生长受到抑制，苗较为细弱。一定量浓度的NAA有利于腋芽的萌发，并有利于萌发后芽体生长健壮，但是不宜过高，过高则对芽的萌发有明显的抑制作用，本实验中浓度在0.3mg/L为宜。
三、金线莲液体培养基壮苗培养
经过45天液体增殖的金线莲，苗高1.5-2.5cm，修剪成小团块接入壮苗培养基中。采用不含激素的MS培养基，用三种不同的壮苗方式，即液体浅层震荡壮苗培养、液体静置壮苗培养、固体壮苗培养。培养条件均为光照培养，光强为1200-1500Lux，光照时间为8 h，温度为23±2℃，不同的培养方式对苗的影响，具体情况见表3。其中液体浅层震荡培养及液体静置培养都采用直径80cm，高110cm耐高温PP组培瓶培养，培养液的量为瓶身的1/6-1/5，接种量为培养液2/3-3/4为宜，液体浅层震荡培养置于大型工业摇床上进行，转速80-100r/min，液体静置及固体壮苗培养则直接放置于培养架上培养。
表3金线莲不同壮苗方式的特点
壮苗培养方式 培养时间/天 特点
液体浅层震荡培养 15 植株浅绿，叶片较少，浅层震荡培养15天明显长高1-2cm
液体静置培养 15 植株变绿，叶片较小，静置一个月长高趋势不明显
固体壮苗培养 15 植株深绿色，茎段木质化程度高，叶片较小，长高趋势不明显
四、金线莲固体培养基生根培养
经过壮苗阶段后进入固体生根阶段，20株/瓶，固体生根培养基配比为：1/2 MS、香蕉60g/L、活性炭1g/L、水解酪蛋白0.5g/L，光照10 小时/天，光强为1500-2500 Lux，温度为23±2 ℃，培养时间3个月。不同的壮苗方式对生根效果也产生不同的影响，主要表现在生根率及根的生长情况，见表4。
生根情况的不同导致不同的移栽成活率，采用液体浅层震荡培养方式进行壮苗然后进入生根，不但缩短了培养周期，生根率达到100%，固体与液体培养基搭配使用，效果优于单纯固体培养基，经炼苗移栽，金线莲移栽成活率高，大幅的降低了生产成本。
表4不同壮苗方式对生根率，生长状况的影响
壮苗培养方式 生根时间/天 生根率 金线莲生长情况
液体浅层震荡培养 90 100% 生根效果很好，且从基部发根，气生根发达
液体静置培养 90 95% 生根效果好，大部分苗从基部发根，气生根发达
固体壮苗培养 90 90% 生根效果较差，基部发出的根很少，大部分是从茎节上长出的气生根

Claims (5)

1.一种金线莲组织培养快速增殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
外植体诱导：采取金线莲植株作为外植体，先对外植体进行清洗、消毒，接入不添加激素的MS基本培养基诱导培养，前一周弱光培养，光照强度500-800Lux，一周后强光培养，光照强度1500-2000Lux，光照时间10小时/天，温度23±2℃，培养40天；
增殖培养：接入液体培养基中进液体增殖培养，液体增殖培养基配比：MS培养基、6-BA1.4-1.6mg/L、NAA0.2-0.3mg/L，培养条件为暗培养，温度为23±2℃，培养周期45天；
壮苗培养：壮苗培养基为无激素液体改良MS培养基，光照培养，光强为1200-1500Lux，光照时间为8小时/天，温度为23±2℃，培养周期为12-15天；
生根培养：生根培养基配比：1/2MS、香蕉60g/L、活性炭1g/L、水解酪蛋白0.5g/L，光照培养，光照时间10 小时/天，光照强度1500-2500Lux，温度为23±2℃，培养周期为3个月。
2.如权利要求1所述的一种金线莲组织培养快速增殖方法，其特征在于，所述外植体清洗、消毒的具体步骤为：先用洗衣粉水溶液浸泡5min，自来水冲洗干净；置于无菌工作台中，75%的酒精消毒30s，无菌水冲洗1次，再用0.1%的升汞消毒3 min，无菌水冲洗3次，最后用10%的次氯酸钠消毒6-8min，无菌水冲洗5次。
3.如权利要求1所述的一种金线莲组织培养快速增殖方法，其特征在于，所述外植体消毒完成后，吸干水分切成1±0.1 cm的茎段，然后接入不添加激素的MS基本培养基中进行诱导培养，pH 5.6-5.8。
4.如权利要求1所述的一种金线莲组织培养快速增殖方法，其特征在于，所述增殖培养及壮苗培养均采用液体浅层震荡培养，采用直径80cm、高100cm耐高温PP组培瓶培养，培养液的量为瓶身的1/6-1/5，接种量为培养液的2/3-3/4，并置于大型工业摇床上，转速80-100r/min。
5.如权利要求1所述的一种金线莲组织培养快速增殖方法，其特征在于，所述增殖培养每隔15天更换一次培养液并分瓶，45天后转入壮苗培养基中。
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