CN110352853A - 一种提高茅苍术试管苗品质和移栽成活率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提高茅苍术试管苗品质和移栽成活率方法，以健壮茅苍术植株的顶芽为外植体，清洗并初步消毒后，浸入抑菌剂中浸泡，然后取出冲洗干净，接着接种于缓冲培养基，得到无菌苗；将无菌苗转接到增殖培养基中进行培养，每隔28～30d转接一次，连续转接4～5次，得到茅苍术丛生芽；将茅苍术丛生芽转接到壮苗生根培养基中培养，选取苗高4～6cm、带有5～6条根的茅苍术试管苗，移入室外开盖驯化培养，然后洗掉残留的培养基，放入多菌灵溶液中浸泡，最后移栽于育苗穴盘。本发明以顶芽为外植体建立无菌系，并简化了茅苍术组培快繁体系步骤，缩短了试管苗成苗周期，节约了成本，获得的茅苍术种苗移栽成活率高，质量稳定，品质好。

Description

一种提高茅苍术试管苗品质和移栽成活率的方法
技术领域
本发明涉及一种提高茅苍术试管苗品质和移栽成活率的方法，属于中药材栽培技术领域。
背景技术
茅苍术[ArtractylodesIancea(Thunb.)DC]为菊科多年生宿根性草本植物，其块根入药，具有燥湿健脾、祛风明目的功效，是我国传统中药材。现代药理研究发现，茅苍术具有显著的抗炎、抗菌、抗癌等功效，在肝癌、胆管癌和肺癌中的抗肿瘤效果突出。除药用外，茅苍术还可用作各种饮料的添加剂和加工工艺香包，近年来对茅苍术的综合开发也使得其用途不断扩大。
茅苍术显著的药效和应用价值使得其需求逐年扩大，野生资源已远远不能满足用药需求。传统生产上茅苍术采用种子和块茎进行繁殖，但其种子生命力较差，繁殖系数低，自身结实率低、抗逆性差，对种子繁殖造成很大障碍；而长期利用根茎切块进行无性繁殖会导致其药用价值退化、病虫害加重、产量下降。利用组织培养的方式进行茅苍术种苗繁殖和复壮，有广阔的市场前景。关于茅苍术组培快繁的研究已见过很多报道，但大部分研究采用种子建无菌系，然后经过愈伤组织，诱导不定芽，增殖继代培养等步骤获得茅苍术组培苗，程序繁琐，周期较长，频繁的转接也容易造成污染，生产成本较高，获得的试管苗品质差、移栽成活率低，因此制约了茅苍术组培种苗工厂化生产。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中茅苍术组培快繁体系存在的不足，提供一种提高茅苍术试管苗品质和移栽成活率的方法，获得的茅苍术种苗质量稳定，品质好。
技术方案
一种提高茅苍术试管苗品质和移栽成活率方法，包括如下步骤：
(1)以健壮茅苍术植株的顶芽为外植体，依次用洗衣粉和蒸馏水清洗后，进行初步消毒，然后用流水冲洗后吸干顶芽表面的水，将顶芽浸入抑菌剂中浸泡2～5h，然后取出用无菌水冲洗干净，接着将茅苍术顶芽接种于缓冲培养基，得到茅苍术无菌苗；
(2)将步骤(1)获得的茅苍术无菌苗转接到增殖培养基中进行培养，每隔28～30d转接一次，连续转接4～5次，得到茅苍术丛生芽；
(3)将步骤(2)获得的茅苍术丛生芽转接到壮苗生根培养基中培养30～40d，得到茅苍术试管苗；
所述壮苗生根培养基的配方：1/2MS+NAA0.5mg/L+活性炭0.5-3.0g/L+琼脂7.0～7.5g/L+蔗糖25～30g/L，pH5.8～6.0；
(4)选取苗高4～6cm、带有5～6条根的茅苍术试管苗，移入室外阴凉处开盖驯化培养5～7d，然后取出，用清水洗掉小苗上残留的培养基，接着放入多菌灵溶液中浸泡20～30min，最后移栽于含有育苗基质的育苗穴盘中进行培养。
进一步，步骤(1)中，所述缓冲培养基的配方为：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+链霉素0.1g/L或青霉素400mg/L+琼脂7.0～7.5g/L+蔗糖25～30g/L，pH5.8～6.0。培养基中加了0.1g/L链霉素或400mg/L青霉素，抑菌作用良好，显著降低了组培苗的污染率。
进一步，步骤(1)中，所述初步消毒是指：先用75％酒精消毒30s，再用0.1％升汞消毒8min。
进一步，步骤(2)中，所述增殖培养基的配方：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+琼脂7.0～7.5g/L+蔗糖25～30g/L，pH5.8～6.0。
进一步，步骤(3)中，所述壮苗生根培养基的配方：1/2MS+NAA0.5mg/L+活性炭1.0g/L+琼脂7.0～7.5g/L+蔗糖25～30g/L，pH5.8～6.0。在培养基中添加活性炭能够显著提高茅苍术试管苗品质，与不加活性炭组相比，其试管苗植株高大，根系发达，苗壮。本发明人研究发现，茅苍术组培苗在生长过程中会分泌有害物质，长期积累会对其自身产生毒害作用。利用活性炭的吸附作用可以降低培养基中某些有害物质的影响，如通过吸附培养基中的酚类物质可防止组织褐化，利于形态发生和器官形成。活性炭会使培养基变黑，利于诱导植物生根。这些特性均有利于提高茅苍术试管苗品质。但大量活性炭的加入会减弱培养物凝固，壮苗生根培养基的配方中，活性炭适宜使用量为0.5～3.0g/L，最优选为1.0g/L。
进一步，步骤(2)和(3)中，所述培养条件：温度24±1℃，湿度80±5％，光照14-16h/d，光照强度2000-2500Lx。
进一步，步骤(4)中，驯化培养的条件：温度为10～15℃，湿度在60％～70％，避免阳光直射。
进一步，步骤(4)中，多菌灵溶液的浓度为300～500mg/L。
进一步，步骤(4)中，育苗基质为蛭石或蛭石：椰糠：泥炭土＝1:1:1。
进一步，步骤(4)中，为了进一步提高茅苍术试管苗移栽成活率，茅苍术试管苗移栽到含有育苗基质的育苗穴盘中后，先在温度21～25℃，光照强度2000～3000lx，湿度60％～70％之间的温室中培养28～35d，待植株长至10cm高时再进行室外大田移栽，移栽时间选择下午5:00～6:00之间，并浇透水。
本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明的优势在于：
1)本发明对茅苍术组培快繁体系进行优化，以顶芽为外植体建立无菌系，克服了茅苍术种子生命力较差，繁殖系数低对试管苗品质的影响，也解决了利用种子建立无菌系时种子获取困难的问题，既提高了茅苍术试管苗的品质又节约了其宝贵的种质资源。
2)通过在培养基中添加0.1g/L链霉素或400mg/L青霉素，显著降低了茅苍术组织培养初期的试管苗污染率。
3)利用健壮茅苍术顶芽为外植体建立无菌系，直接转入增殖培养基进行增殖培养，在转接3～5代后转入生根培养基进行壮苗生根培养，简化了茅苍术组培快繁体系步骤，缩短了试管苗成苗周期，节约了成本，同时也避免了频繁转接对组培苗造成的污染。
4)通过在生根培养中添加适量的活性炭显著提高了茅苍术试管苗的品质，提高移栽成活率。
5)通过育苗基质筛选，找到了最适宜茅苍术试管苗移栽的基质，试管苗的成活率达92％。
附图说明
图1为实施例1的茅苍术试管苗的生长情况图；
图2为对比例1的茅苍术试管苗的生长情况图；
图3为实施例1的茅苍术试管苗的生根情况图；
图4为对比例1的茅苍术试管苗的生根情况图；
图5为实施例1中茅苍术试管苗移栽时的生长情况图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
下述实施例中，茅苍术来自江苏茅山地区；2D-106抑菌剂由江西万年创新组织培养研究所提供，但均不限于此。
实施例1
一种提高茅苍术试管苗品质和移栽成活率方法，包括如下步骤：
(1)以健壮茅苍术植株的顶芽为外植体(茅苍术外植体取材方法：选择晴天中午12:00～1:00，用刀片割取健壮植株的幼嫩顶芽，带有2～3个腋芽)，依次用洗衣粉和蒸馏水清洗后，进行初步消毒(先用75％酒精消毒30s，再用0.1％升汞消毒8min)，然后用流水冲洗后吸干顶芽表面的水，将顶芽浸入2D-106抑菌剂中浸泡3h，然后取出用无菌水冲洗干净，接着将茅苍术顶芽接种于缓冲培养基，得到茅苍术无菌苗(本实施例中接种了30个顶芽，污染了5个，死亡2个)；
所述缓冲培养基的配方为：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+链霉素0.1g/L+琼脂7.0～7.5g/L+蔗糖25～30g/L，pH5.8～6.0；
(2)将步骤(1)获得的茅苍术无菌苗转接到增殖培养基中进行培养，每隔28～30d转接一次，连续转接4～5次，得到茅苍术丛生芽；
所述增殖培养基的配方：MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+琼脂7.0～7.5g/L+蔗糖25～30g/L，pH5.8～6.0；培养条件：温度24±1℃，湿度80±5％，光照14-16h/d，光照强度2000-2500Lx；
(3)将步骤(2)获得的茅苍术丛生芽转接到壮苗生根培养基中培养30～40d，得到茅苍术试管苗，茅苍术试管苗的生长情况图见图1，生根情况图见图3，茅苍术试管苗的品质测试结果见表1；
所述壮苗生根培养基的配方：1/2MS+NAA0.5mg/L+活性炭1.0g/L+琼脂7.0～7.5g/L+蔗糖25～30g/L，pH5.8～6.0；培养条件：温度24±1℃，湿度80±5％，光照14-16h/d，光照强度2000-2500Lx；
(4)选取苗高4～6cm、带有5～6条根的茅苍术试管苗，移入室外阴凉处开盖驯化培养5～7d(温度为10～15℃，湿度在60％～70％，避免阳光直射)，然后取出，用清水洗掉小苗上残留的培养基，接着放入400mg/L多菌灵溶液中浸泡20～30min，最后移栽于含有育苗基质(蛭石：椰糠：泥炭土＝1:1:1)的育苗穴盘(32孔穴盘，单个穴盘长×宽×高为540mm×280mm×100mm)中，茅苍术试管苗移栽时的生长情况图见图5，先在温度21～25℃，光照强度2000～3000lx，湿度60％～70％之间的温室中培养28～35d，待植株长至10cm高时再进行室外大田移栽，移栽时间选择下午5:00～6:00之间，并浇透水。本实施例中，苗生长非常健壮，移栽成活率为92％。
实施例2
步骤(4)中，育苗基质为蛭石，其余与实施例1相同。本实施例中，苗生长健壮，移栽成活率为90％。
实施例3
步骤(3)中，所述壮苗生根培养基的配方：1/2MS+NAA0.5mg/L+活性炭2.0g/L+琼脂7.0～7.5g/L+蔗糖25～30g/L，pH5.8～6.0。茅苍术试管苗的品质测试结果见表1。
其余与实施例1相同。本实施例中，苗生长健壮，移栽成活率为75％。
对比例1
步骤(1)中，所述缓冲培养基的配方为：MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.1mg/琼脂7.0～7.5g/L+蔗糖25～30g/L，pH5.8～6.0；该对比例中接种了30个顶芽，污染了12个，死亡3个)。
步骤(3)中，所述壮苗生根培养基的配方为：1/2MS+NAA0.5mg/L+琼脂7.0～7.5g/L+蔗糖25～30g/L，pH 5.8～6.0，茅苍术试管苗的生长情况图见图2，生根情况图见图4，茅苍术试管苗的品质测试结果见表1。
其余与实施例1相同。
对比例1中，苗生长健壮，移栽成活率为68％。
对比例2
步骤(4)中，育苗基质为：蛭石：泥炭土＝1:1。该对比例中，苗长势弱，有腐烂苗，移栽成活率为63％。
对比例3
步骤(4)中，育苗基质为园土，该对比例中，苗长势弱，腐烂苗多，移栽成活率为45％。
对比例4
步骤(4)中，育苗基质为珍珠岩，该对比例中，苗生长较健壮，移栽成活率为82％。
表1实施例1、实施例3及对比例1的茅苍术试管苗品质对比
由表1的测试结果可以看出，采用本发明方法得到的茅苍术试管苗品质更好，说明在壮苗生根培养基中加入活性炭有利于提高茅苍术试管苗品质，加入1g/L的活性炭对茅苍术试管苗的生长更有利，当活性炭的量增加到2g/L时，其品质反而降低。

Claims (10)

1.一种提高茅苍术试管苗品质和移栽成活率方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以健壮茅苍术植株的顶芽为外植体，依次用洗衣粉和蒸馏水清洗后，进行初步消毒，然后用流水冲洗后吸干顶芽表面的水，将顶芽浸入抑菌剂中浸泡2～5h，然后取出用无菌水冲洗干净，接着将茅苍术顶芽接种于缓冲培养基，得到茅苍术无菌苗；
(2)将步骤(1)获得的茅苍术无菌苗转接到增殖培养基中进行培养，每隔28～30d转接一次，连续转接4～5次，得到茅苍术丛生芽；
(3)将步骤(2)获得的茅苍术丛生芽转接到壮苗生根培养基中培养30～40d，得到茅苍术试管苗；
所述壮苗生根培养基的配方：1/2MS+NAA0.5 mg/L+活性炭0.5-3.0g/L+琼脂7.0～7.5g/L+蔗糖25～30g/L，pH5.8～6.0；
(4)选取苗高4～6cm、带有5～6条根的茅苍术试管苗，移入室外阴凉处开盖驯化培养5～7d，然后取出，用清水洗掉小苗上残留的培养基，接着放入多菌灵溶液中浸泡20～30min，最后移栽于含有育苗基质的育苗穴盘中进行培养。
2.如权利要求1所述提高茅苍术试管苗品质和移栽成活率方法，其特征在于，步骤(1)中，所述缓冲培养基的配方为：MS+6-BA1.0 mg/L+NAA 0.1mg/L+链霉素0.1g/L或青霉素400mg/L+琼脂7.0～7.5g/L+蔗糖25～30g/L，pH5.8～6.0。
3.如权利要求1所述提高茅苍术试管苗品质和移栽成活率方法，其特征在于，步骤(1)中，所述初步消毒是指：先用75％酒精消毒30s，再用0.1％升汞消毒8min。
4.如权利要求1所述提高茅苍术试管苗品质和移栽成活率方法，其特征在于，步骤(2)中，所述增殖培养基的配方：MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L+琼脂7.0～7.5g/L+蔗糖25～30g/L，pH5.8～6.0。
5.如权利要求1所述提高茅苍术试管苗品质和移栽成活率方法，其特征在于，步骤(3)中，所述壮苗生根培养基的配方：1/2MS+NAA0.5 mg/L+活性炭1.0g/L+琼脂7.0～7.5g/L+蔗糖25～30g/L，pH5.8～6.0。
6.如权利要求1所述提高茅苍术试管苗品质和移栽成活率方法，其特征在于，步骤(2)和(3)中，所述培养条件：温度24±1℃，湿度80±5％，光照14-16h/d，光照强度2000-2500Lx。
7.如权利要求1所述提高茅苍术试管苗品质和移栽成活率方法，其特征在于，步骤(4)中，驯化培养的条件：温度为10～15℃，湿度在60％～70％，避免阳光直射。
8.如权利要求1所述提高茅苍术试管苗品质和移栽成活率方法，其特征在于，步骤(4)中，多菌灵溶液的浓度为300～500mg/L。
9.如权利要求1所述提高茅苍术试管苗品质和移栽成活率方法，其特征在于，步骤(4)中，育苗基质为蛭石或蛭石：椰糠：泥炭土＝1:1:1。
10.如权利要求1至9任一项所述提高茅苍术试管苗品质和移栽成活率方法，其特征在于，步骤(4)中，茅苍术试管苗移栽到含有育苗基质的育苗穴盘中后，先在温度21～25℃，光照强度2000～3000lx，湿度60％～70％之间的温室中培养28～35d，待植株长至10cm高时再进行室外大田移栽，移栽时间选择下午5:00～6:00之间，并浇透水。
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