CN104982336A - 一种茅苍术人工种子制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种茅苍术人工种子的制作方法，主要包括外植体材料的获取、种皮包被材料的选取及胚乳吸附剂、碳源、培养基浓度、激素配伍等人工种子制作的相关作用条件的最佳选择方案。其所制作的人工种子，可以摆脱季节、温湿度环境对茅苍术天然种子发生、形成、出芽、萌发等过程的限制，可在组织培养无性繁殖技术条件下大规模工厂化繁殖育种生产道地茅苍术中药材原料。

Description

一种茅苍术人工种子制作方法

技术领域

本发明属于生物技术和农业工程领域，具体涉及一种茅苍术人工种子的制作方法。

背景技术

茅苍术，亦称南苍术，是菊科苍术属多年生宿根草本，喜温凉耐寒抗旱，多生长在丘陵、山坡疏松透气性较好的砂、壤质土壤中，主要分布在长江流域的华东、中南地区，安徽、江苏、四川、湖北较为常见，其中江苏镇江茅山是公认的道地茅苍术药材中心产区，故因茅山称之为“茅苍术”。道地茅苍术是名贵的中药材，其可以起到促进肝蛋白合成、抗病毒作用，具有预防胃溃疡、改善脾虚、降糖、利尿的功效，在医学临床方面还多用于健胃消食、治疗风寒感冒以及风湿关节炎等诸多病症的治疗。其所提取的水溶性多糖、粗蛋白及挥发油除了药用外也同时具有保健食品的潜在开发应用价值。

江苏镇江地区作为道地茅苍术主要产区，其周边的金坛、句容、溧水、溧阳、高淳等地从上世纪50年代起也同样作为茅苍术的原材料供应地，但经过几十年的采挖，从80年代开始其产量就已经开始一直下降，而在最近几年，野生的茅苍术种质资源几乎消耗殆尽，虽然为满足日益增长的市场需求，相关部门已经开始引导开展茅苍术的人工种植工作，但由于受到茅苍术生长的诸多要求和各方面技术条件的限制远未满足市场的需求，所以通过可行的技术手段实现茅苍术的增产增殖也是经济发展要求的当地农业生产和种质资源保存的重要且长远的任务之一！

人工种子技术其实质是借助植物组织培养进行的无性微体快速繁殖技术，通过组织培养获取无菌的活性生长外植体作为人工种胚材料包裹在含有各种养分的水凝胶络合形成的凝胶外壳，即“人工种皮”结构中形成类似天然种子结构的颗粒体。在一定适宜的环境条件下，其具有跟天然种子相同的出芽生根生长的功能。而相比天然种子，人工种子可以不受到各类时空及自身遗传种质优良条件的限制，并对大规模大批量高效生产和不同环境条件下的播种种植成为可能。

发明内容

本发明目的在于提供一种茅苍术人工种子的制作方法，可克服时空及自身遗传种质优良条件的限制，以实现大规模大批量高效生产和不同环境条件下的播种种植，为茅山地区的茅苍术播种生产及种质资源保存提供重要的技术支撑。

为解决上述技术问题，本发明采用的具体技术方案如下：

一种茅苍术人工种子的制作方法，其特征在于包括以下步骤

步骤一：茅苍术外植体材料的获取和芽的诱导

选取初秋时节生长成熟的茅苍术植株，取根茎冲洗干净后，切取其顶芽、腋芽和不定芽部分，将所述顶芽、腋芽和不定芽部分在超净工作台内进行灭菌消毒处理后接种在芽诱导培养基上进行芽诱导培养；

所述芽诱导培养基的成分为：MS培养基+0.2mg/L NAA+2mg/L 6-BA+2.0％蔗糖+0.7％琼脂；芽诱导培养基的pH＝5.8；芽诱导培养的条件为：以光强为35μmol·m^-2·s^-1的日光灯光源光照14小时；

所述NAA为α-萘乙酸，6-BA为6-苄氨基腺嘌呤；MS培养基为Murashige和Skooge培养基；

MS培养基的成分包括

大量元素:KNO₃为1900mg/L、NH₄NO₃为1650mg/L、MgSO₄·7H₂O为370mg/L、KH₂PO₄为170mg/L、CaCl₂·2H₂O为440mg/L；

微量元素:MnSO₄·4H₂O为22.3mg/L、ZnSO₄·7H₂O为8.6mg/L、H₃BO₃为6.2mg/L、KI为0.83mg/L、NaMoO₄·4H₂O为0.25mg/L、CuSO₄·5H₂O为0.025mg/L、CoCl₂·6H₂O为0.025mg/L；

铁盐溶液:FeSO₄·4H₂O为27.8mg/L、Na₂-EDTA为37.3mg/L；

有机成分:甘氨酸为2.0mg/L、盐酸硫胺素为0.1mg/L、盐酸吡哆醇为0.5mg/L、烟酸为0.5mg/L、肌醇为100mg/L；

步骤二：茅苍术芽的增殖扩繁

待顶芽、腋芽、不定芽部分在芽诱导培养基上诱导出新芽后,将所述新芽再转接到芽诱导培养基上进行芽蔟诱导培养,待芽增殖扩繁后即形成大量的芽蔟和原球茎；所述芽增殖扩繁的培养条件与所述芽诱导培养的条件相同；

步骤三：茅苍术人工种子的滴埋制备

在超净台内将所述芽蔟和原球茎分割成单芽和单个原球茎，选取适当大小的单芽或原球茎，投入灭菌处理过的包埋液中，搅拌充分混匀；所述包埋液由混合水溶胶包被材料、作水溶胶溶剂的培养基、激素、胚乳养分吸附剂以及碳源组成；

所述混合水溶胶包被材料为质量比为4:1的海藻酸钠与明胶混合水溶胶；所述包埋液的成分为：溶质总质量的5.0％海藻酸钠与明胶混合水溶胶+1/2MS培养基+0.7mg/LNAA+3.0％蔗糖+1.0％活性炭，包埋液的pH＝5.8；

用内径4-6mm的吸管吸取适量包有单芽或原球茎包埋液，滴入到质量浓度为2.0％的CaCl₂溶液中，络合凝固10分钟，形成人工种子胶囊，取出所述人工种子胶囊并用滤纸吸干所述人工种子胶囊上的液体，将人工种子胶囊储藏待萌发，即得茅苍术人工种子。

所述络合凝胶的包埋液中的主要成分有以下几部分

混合水溶胶包被材料：质量配比为海藻酸钠:明胶＝4:1；总体水溶胶质量为5.0％；

作水溶胶溶剂的培养基：1/2MS培养基，即半强度MS培养基；

激素配伍组合：0.7mg/L NAA；

胚乳养分吸附剂：1.0％活性炭；

碳源为3.0％蔗糖。

本发明具有益效果。本方法通过人工种皮包被材料的优化选取、胚乳吸附剂的选用、培养基浓度的控制和激素配伍的调配进一步深入研究了人工种子制作的理论技术，优化了此前相关技术的应用，并进行了其它方面的创新。通过混合水溶胶包被筛选、胚乳养分吸附剂的选用、培养基浓度和激素配伍组合相关实验，分别得出最佳组合水平，为茅苍术人工种子的制作技术提供了重要借鉴。通过人工的方法制备种子以替代天然的种子，在充分利用茅苍术资源的同时，也打破了时间和空间方面的限制，可以进行大规模大批量高效生产和不同环境条件下的播种种植，为茅山地区的茅苍术播种生产及种质资源保存提供重要的技术支撑。材料获取方便，操作简单易行；与试管苗相比，其体积小，成本低廉，贮存和运输均很方便,减少了移栽驯化过程。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的水溶胶包被材料、胚乳养分吸附剂、培养基浓度和激素配伍做进一步详细说明。

实施例1

调整包埋液中的水溶胶包被材料及配比，进行茅苍术人工种子的萌发实验。

对包埋液也即海藻酸钠与明胶混合水溶胶的包被材料配比进行调整，依发明内容中所述的步骤制作茅苍术人工种子，包被的外植体为单芽或原球茎，观察茅苍术人工种子的萌发和生根情况，得不同种皮包被材料水溶胶配比滴埋茅苍术人工种子生理指标如表1所示。

表1不同种皮包被材料水溶胶配比滴埋茅苍术人工种子生理指标

从表1中可看出，对于不同成分配比组成(总质量分数为5.0％)的水溶胶络合包被的人工种子的主要生理指标显示，总体上，海藻酸钠与明胶组合整体效果最好，其中海藻酸钠:明胶＝4:1的水平其出芽率、生根率最高，为本发明选用的包被材料的配比；而海藻酸钠与壳聚糖组合整体效果次之。海藻酸钠与槐树豆胶的组合可能因为其粘性大透气性较差整体效果最差。故选择质量配比海藻酸钠:明胶＝4:1的组合水平作为人工种子络合的凝胶包被材料，效果相对最好。

实施例2

调整包埋液中的胚乳养分吸附剂，进行茅苍术人工种子的萌发实验。

添加胚乳养分吸附剂可以吸附人工种子的营养，防止渗漏。对包埋液中的胚乳养分吸附剂进行调整，依发明内容中所述的步骤制作茅苍术人工种子，包被的外植体为单芽，观察茅苍术人工种子的萌发和生根情况，得不同类型胚乳养分吸附剂对茅苍术人工种子生长影响如表2所示。

表2不同类型胚乳养分吸附剂对茅苍术人工种子生长影响

吸附剂类型	成活率	出芽率	生根率
				活性炭	85％	70％	44％
硅藻土	82％	64％	38％
				淀粉	73％	55％	30％

从表2的结果可以看出，在质量分数均为1.0％的三种吸附剂中，活性炭和硅藻土总体上防养分渗漏效果较好，两者效果相近，但活性炭总体效果最好。淀粉效果则最差。则茅苍术人工种子滴埋制作选择1.0％活性炭效果最好。

实施例3

调整包埋液中的激素配伍，观察茅苍术人工种子的生根效果。

对包埋液中的激素配伍进行调整，依发明内容中所述的步骤制作茅苍术人工种子，包被的外植体为原球茎，观察茅苍术人工种子的生根情况，得不同激素配比对茅苍术人工种子生根的影响作用结果如表3所示。

表3不同激素配比对茅苍术人工种子生根的影响作用

从表3结果中可知，在单一的NAA处理组中，0.7mg/LNAA水平上生根率最高，且根系生长得最旺盛，效果最好，而在该水平的NAA与不同浓度的6-BA配伍组合中0.7mg/LNAA+0.5mg/L6-BA水平效果最好，但从所有激素配伍组合中，还是单一的0.7mg/LNAA水平效果最佳。

实施例4

调整包埋液中的培养基浓度，进行茅苍术人工种子的萌发实验。

对包埋液中的培养基浓度进行调整，依发明内容中所述的步骤制作茅苍术人工种子，包被的外植体为单芽，观察茅苍术人工种子的萌发和生根情况。

表4不同强度培养基对茅苍术人工种子生长的影响

培养基强度	成活率	出芽率	生根率
				MS	81％	62％	36％
1/2MS	84％	65％	38％
				1/4MS	71％	52％	22％

由表4结果可以看出，不同强度MS培养基加入到包埋液中结果显示，MS和半强度的MS影响效果较为相近，但半强度的MS培养基组合出芽率、生根率效果相对最好，而1/4的MS培养基效果相对较差，则MS培养基作为人工种子胚乳的矿质营养成分则选用半强度水平较好。

Claims (2)

1.一种茅苍术人工种子的制作方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一：茅苍术外植体材料的获取和芽的诱导

选取初秋时节生长成熟的茅苍术植株，取根茎冲洗干净后，切取其顶芽、腋芽和不定芽部分，将所述顶芽、腋芽和不定芽部分在超净工作台内进行灭菌消毒处理后接种在芽诱导培养基上进行芽诱导培养；

所述芽诱导培养基的成分为：MS培养基+0.2mg/L NAA+2mg/L 6-BA+2.0％蔗糖+0.7％琼脂；芽诱导培养基的pH＝5.8；芽诱导培养的条件为：以光强为35μmol·m^-2·s^-1的日光灯光源光照14小时；

所述NAA为α-萘乙酸，6-BA为6-苄氨基腺嘌呤；MS培养基为Murashige和Skooge培养基；

MS培养基的成分包括

大量元素:KNO₃为1900mg/L、NH₄NO₃为1650mg/L、MgSO₄·7H₂O为370mg/L、KH₂PO₄为170mg/L、CaCl₂·2H₂O为440mg/L；

微量元素:MnSO₄·4H₂O为22.3mg/L、ZnSO₄·7H₂O为8.6mg/L、H₃BO₃为6.2mg/L、KI为0.83mg/L、NaMoO₄·4H₂O为0.25mg/L、CuSO₄·5H₂O为0.025mg/L、CoCl₂·6H₂O为0.025mg/L；

铁盐溶液:FeSO₄·4H₂O为27.8mg/L、Na₂-EDTA为37.3mg/L；

有机成分:甘氨酸为2.0mg/L、盐酸硫胺素为0.1mg/L、盐酸吡哆醇为0.5mg/L、烟酸为0.5mg/L、肌醇为100mg/L；

步骤二：茅苍术芽的增殖扩繁

待顶芽、腋芽、不定芽部分在芽诱导培养基上诱导出新芽后,将所述新芽再转接到芽诱导培养基上进行芽蔟诱导培养,待芽增殖扩繁后即形成大量的芽蔟和原球茎；所述芽增殖扩繁的培养条件与所述芽诱导培养的条件相同；

步骤三：茅苍术人工种子的滴埋制备

在超净台内将所述芽蔟和原球茎分割成单芽和单个原球茎，选取适当大小的单芽或原球茎，投入灭菌处理过的包埋液中，搅拌充分混匀；所述包埋液由混合水溶胶包被材料、作水溶胶溶剂的培养基、激素、胚乳养分吸附剂以及碳源组成；

所述混合水溶胶包被材料为质量比为4:1的海藻酸钠与明胶混合水溶胶；所述包埋液的成分为：溶质总质量的5.0％海藻酸钠与明胶混合水溶胶+1/2MS培养基+0.7mg/LNAA+3.0％蔗糖+1.0％活性炭，包埋液的pH＝5.8；

用内径4-6mm的吸管吸取适量包有单芽或原球茎包埋液，滴入到质量浓度为2.0％的CaCl₂溶液中，络合凝固10分钟，形成人工种子胶囊，取出所述人工种子胶囊并用滤纸吸干所述人工种子胶囊上的液体，将人工种子胶囊储藏待萌发，即得茅苍术人工种子。

2.根据权利要求1所述的一种茅苍术人工种子的制作方法，其特征在于：所述络合凝胶的包埋液中的主要成分有以下几部分

混合水溶胶包被材料：质量配比为海藻酸钠:明胶＝4:1；总体水溶胶质量为5.0％；

作水溶胶溶剂的培养基：1/2MS培养基，即半强度MS培养基；

激素配伍组合：0.7mg/L NAA；

胚乳养分吸附剂：1.0％活性炭；

碳源为3.0％蔗糖。