CN108040884B - 一种以独蒜兰类原球茎为繁殖体构建人工种子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以独蒜兰类原球茎为材料构建人工种子的方法，所述方法包括独蒜兰类原球茎的诱导、增殖、人工种子的制作与播种。本发明将植物组织培养技术与人工种子技术相互结合，利用独蒜兰小苗基部诱导产生的类原球茎并增殖作为人工种子的繁殖体，可以大规模生产。其不受季节影响，繁殖周期短，成本低廉，便于储藏，有效解决独蒜兰资源日益枯竭的问题，为独蒜兰产业化发展提供技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种独蒜兰人工种子制作方法及其播种方法。
背景技术
兰科植物独蒜兰（Pleione bulbocodioides (Franch. ) Rolfe）的干燥假鳞茎，是中药山慈菇的主要来源之一。2015年版《中国药典》记载山慈姑的主要来源为兰科植物杜鹃兰（Cremastra appendiculata (D. Don) Makino）、独蒜兰（Pleione bulbocodioides(Franch. ) Rolfe）或云南独蒜兰（Pleione yunnanensis (Rolfe) Rolfe）的干燥假鳞茎。前者习称“毛慈姑”，后二者习称“冰球子”，均作为山慈姑使用。其味甘、微辛、性凉，具有清热解毒，消肿散结的功效，主要用于痈肿疔毒、瘰疬痰核、淋巴结结核、蛇虫咬伤等。近年来，由于过度采挖，独蒜兰的自然储量急剧下降，现已呈濒危状态；同时，在自然状态下，其种子由于发育不成熟以及自身不透水、不透气等原因而极难萌发。目前实际人工栽培中采用分株法进行繁殖，繁殖系数低，时间长，不能满足市场需求。独蒜兰正面临着资源短缺的严峻现实。
类原球茎是指在兰花的组织培养中，从顶芽、侧芽或种子萌发的植株进行器官培养，都能诱导出类似原始球茎的胚性组织。通过对独蒜兰类原球茎的诱导、增殖、分化，可以快速大量产生独蒜兰小苗。人工种子技术的诞生为独蒜兰产业化提供了一条新途径，其本质为无性繁殖，与组培苗相比，人工种子使得无菌生长的类原球茎可以直接播入土壤，繁殖速度快，从而减少了移栽驯化过程，且大大降低组培苗培育和移栽驯化中的风险。
目前国内外尚未有关独蒜兰人工种子的报道。而我们课题组在前期的研究中，已成功诱导独蒜兰的类原球茎并能稳定增殖，为独蒜兰人工种子的研制提供了可利用的生产材料。
发明内容
本发明的目的在提供一个以独蒜兰类原球茎为材料构建人工种子及其播种的方法。
具体而言，在第一方面，本发明提供了一种独蒜兰人工种子的制作方法，其特征在于，其依次包括如下步骤：
（1）类原球茎的诱导：
以独蒜兰无菌苗为材料接种于类原球茎诱导培养基中，诱导其基部形成类原球茎；
（2）类原球茎的增殖：
将诱导得到的类原球茎转接到增殖培养基中，进行增殖培养30-35天（即，d），再转移至液体培养基中进行增殖15-30 d；
（3）人工种子的制作：
配制人工胚乳，其配方为MS+0.3 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA+20-30 g/L蔗糖+5%（w/v）土豆汁+0.5%（w/w）多菌灵+3%（w/w）海藻酸钠；
配制人工种皮，其配方为0.2 mol/L CaCl2的水溶液；
将人工胚乳和人工种皮分别于121℃高压灭菌30 min，冷却备用；
无菌条件下将增殖的类原球茎在120目的不锈钢滤网过筛后与人工胚乳混合均匀，再用口径直径为5 mm的无菌滴管吸起含有类原球茎的人工胚乳，滴入人工种皮溶液中，18-20 min后取出所形成的直径为7.5 mm-8.5 mm的凝胶颗粒，用无菌水冲洗3次，得到人工种子，置于无菌培养皿中备用。
在本发明中，培养基或者人工胚乳等的表述是本领域通用的表述方法，即在诸如MS等基本培养基的成分基础上添加所示的其他成分以达到所示的浓度。其中，土豆汁的浓度是指熬汁所用的去皮马铃薯占最终配制物的比例，例如，5%（w/v）土豆汁指的是50g去皮马铃薯加水煮沸30min后过滤所得的汁液定容在1L相应培养基或者人工胚乳中。在本发明中，培养基、激素的名称和重量比（w/w）、体积比（v/v）浓度均为本领域通用的。
优选在本发明第一方面的方法中，步骤（1）中类原球茎诱导培养基的配方为1/2MS+2.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L KT+0.2 mg/L NAA+10%（v/v）椰汁+25-30 g/L蔗糖+5 g/L琼脂+0.5 g/L活性炭。
优选在本发明第一方面的方法中，步骤（2）中增殖培养基的配方为1/2MS+1.0-1.5mg/L KT+0.2 mg/L NAA+10%（w/v）土豆汁+25-30 g/L蔗糖+5 g/L琼脂。
优选在本发明第一方面的方法中，步骤（2）中液体培养基的配方为1/2MS+1.0-1.5mg/L KT+0.2 mg/L NAA+10%（w/v）土豆汁+25-30 g/L蔗糖。
在第二方面，本发明提供了一种独蒜兰人工种子的播种方法，其特征在于，其依次包括如下步骤：
（1）执行本发明第一方面的方法，获得人工种子；
（2）将人工种子接种至无激素MS培养基萌发。
在本发明中，类原球茎诱导和增殖及人工种子萌发的培养条件都可以为光照1000-1500 lx，12 h光周期，25±2℃培养。
在第三方面，本发明提供了一种独蒜兰人工种子的播种方法，其特征在于，其依次包括如下步骤：
（1）执行本发明第一方面的方法，获得人工种子；
（2）将人工种子直接播种到混合土壤基质中萌发，所述混合土壤基质的配方是珍珠岩：蛭石：壤土的重量比=1:1:3。
在第四方面，本发明提供了本发明第二方面的播种方法在萌发率达95%以上的独蒜兰人工种子的萌发方法中的应用。
在第五方面，本发明提供了本发明第三方面的播种方法在萌发率达95%以上的独蒜兰人工种子的萌发方法中的应用。
本发明取得的有益效果包括，本发明所述中类原球茎的稳定增殖为人工种子的制作提供了源源不断的材料，复合的人工胚乳，改善了传统包埋的透气性、保水性，又促进了类原球茎的萌发；制作工艺流程简单，材料通过稳定增殖大量获得，不受季节影响，繁殖周期短，成本低廉，便于储藏，有效解决独蒜兰资源日益枯竭的问题，为独蒜兰人工种子实用化和产业化发展提供技术支持；本发明所得的人工种子在自然环境下具有较高的萌发率和成苗率。
附图说明
图1为实例中独蒜兰小苗诱导形成类原球茎的示例性照片。
图2为实例中独蒜兰类原球茎在固体培养基中增殖的示例性照片。。
图3为实例中制得的人工种子的示例性照片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行进一步说明。
本发明所述的独蒜兰人工种子的制作方法，包括以下步骤：
（1）类原球茎的诱导：
以独蒜兰无菌苗为材料接种于类原球茎诱导培养基中，诱导其基部形成类原球茎；
（2）类原球茎的增殖：
将诱导得到的类原球茎转接到增殖培养基中，进行增殖培养30-35 d，再转移至液体培养基中进行增殖15-30 d；
（3）人工种子的制作：
配制人工胚乳；
配制人工种皮；
将人工胚乳和人工种皮分别于121℃高压灭菌30 min，冷却备用；
无菌条件下将增殖的类原球茎在120目的不锈钢滤网过筛后与人工胚乳混合均匀，再用口径直径为5 mm的无菌滴管吸起含有类原球茎的人工胚乳，滴入人工种皮溶液中，18-20 min后取出所形成的直径为7.5 mm-8.5 mm的凝胶颗粒，用无菌水冲洗3次，得到人工种子，置于无菌培养皿中备用。
其中：
（1）将独蒜兰无菌苗接入含不同激素配比的诱导培养基中进行类原球茎诱导，并筛选配方。
表1不同激素配比对独蒜兰类原球茎诱导的影响
注：类原球茎情况是在诱导培养45d后的结果
从表1可以看出独蒜兰小苗在诱导4组（1/2MS+2.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L KT+0.2mg/L NAA+10%椰汁+30 g/L蔗糖+5 g/L琼脂+0.5 g/L活性炭）的培养基能够最短时间内诱导形成颜色翠绿，质地疏松的类原球茎。
（2）将得到的类原球茎转接到含不同激素配比的增殖培养基中进行增殖培养，并筛选配方。
表2 不同激素配比对独蒜兰类原球茎增殖的影响
注：用+表示增殖情况，＋越多增殖越好。
从表2可以看出类原球茎在增殖1和2组（1/2MS+1.0-1.5 mg/L KT+0.2 mg/L NAA+10%土豆汁+30 g/L蔗糖+5 g/L琼脂）的固体培养基上增殖效果最佳。
（3）将增殖的类原球茎以含不同激素、成分配比的人工胚乳配制，在含激素营养的培养基上进行萌发实验，并筛选配方。
表3 正交考察人工胚乳对独蒜兰人工种子萌发的影响
从表3可以看出以MS+0.3 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+5%土豆汁+0.5%多菌灵+3%海藻酸钠为人工胚乳制得的人工种子萌发率最高。
另外，尤其令人意外的是，对于上述最佳人工胚乳制得的人工种子，无需对萌发的培养基进行优化，即使只置于无激素MS培养基或混合土壤基质中，30 d后的萌发率和出苗率都达到很高的程度（见表4）。
表4 培养基、混合土壤基质对独蒜兰人工种子萌发出苗的影响
| 组别 | 污染率% | 萌发率% | 出苗率% |
| 无激素MS | 0 | 95.5 | 93.5 |
| 混合土壤基质 | 8.50 | 81.0 | 78.5 |
上述实例仅仅是对本发明的进一步解释，并不是对本发明的限定，通过将上述方案进行简单的调整进而得到的方案，同样在本申请的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种独蒜兰人工种子的制作方法，其特征在于，其依次包括如下步骤：
(1)类原球茎的诱导：
以独蒜兰无菌苗为材料接种于类原球茎诱导培养基中，诱导其基部形成类原球茎，其中类原球茎诱导培养基的配方为1/2MS+2.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT+0.2mg/L NAA+10％（v/v）椰汁+30g/L蔗糖+5g/L琼脂+0.5g/L活性炭；
(2)类原球茎的增殖：
将诱导得到的类原球茎转接到增殖培养基中，进行增殖培养30-35d，再转移至液体培养基中进行增殖15-30d，其中，增殖培养基的配方为1/2MS+1.0-1.5mg/L KT+0.2 mg/L NAA+10％（w/v）土豆汁+30g/L蔗糖+5g/L琼脂，和液体培养基的配方为1/2MS+1.0-1.5mg/L KT+0.2mg/L NAA+10％(w/v)土豆汁+25-30g/L 蔗糖；
(3)人工种子的制作：
配制人工胚乳，其配方为MS+0.3mg/L NAA+2.0mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+5％(w/v)土豆汁+0.5％(w/w)多菌灵+3％(w/w)海藻酸钠；
配制人工种皮，其配方为0.2mol/L CaCl2的水溶液；
将人工胚乳和人工种皮分别于121℃高压灭菌30min，冷却备用；
无菌条件下将增殖的类原球茎在120目的不锈钢滤网过筛后与人工胚乳混合均匀，再用口径直径为5mm的无菌滴管吸起含有类原球茎的人工胚乳，滴入人工种皮溶液中，18-20min后取出所形成的直径为7.5mm-8.5mm的凝胶颗粒，用无菌水冲洗3次，得到人工种子，置于无菌培养皿中备用。
2.一种独蒜兰人工种子的播种方法，其特征在于，其依次包括如下步骤：
(1)执行权利要求1所述的方法，获得人工种子；
(2)将人工种子接种至无激素MS培养基萌发。
3.一种独蒜兰人工种子的播种方法，其特征在于，其依次包括如下步骤：
(1)执行权利要求1所述的方法，获得人工种子；
(2)将人工种子直接播种到混合土壤基质中萌发，所述混合土壤基质的配方是珍珠岩：蛭石：壤土的重量比＝1:1:3。
4.权利要求3所述的播种方法在萌发率达95％以上的独蒜兰人工种子的萌发方法中的应用。
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