CN115250893B - 一种独蒜兰人工培育的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种独蒜兰人工培育的方法，先将独蒜兰种子浸泡于石斛小菇发酵上清液进行预处理；再浸泡在胚乳溶液中，滴入种皮溶液中，室温反应0‑30min，4℃保存至种子破皮后，获得萌发的种子；萌发的种子移栽于土壤基质中，温度保持在20～25℃，空气湿度为40％‑70％，1‑2d喷水一次；当种子长成为植株幼苗后移栽于25℃温室大棚。本发明采用石斛小菇萌发酵菌液预处理独蒜兰种子，有利于抑制其他杂菌，促进种子萌发。选用胚乳溶液和种皮溶液直接包裹天然种子，省去播种前需要将种子培养成原球茎的步骤，节省大量培养基成本；本发明制作工艺简单，成本低廉，可推广使用，可降低成本，实现独蒜兰快速大规模化生产。

Description

一种独蒜兰人工培育的方法
一、技术领域
本发明涉及一种新型独蒜兰人工培育的方法，能够直接种植繁育独蒜兰。
二、背景技术
独蒜兰(Pleione bulbocodioides(Franch.)Rolfe)为兰科独蒜兰属多年生植物，是中国珍贵药材之一，主要分布于中国陕西、四川、贵州、云南等地。独蒜兰的花形非常独特和优雅，具有非常高的观赏价值；经常被用在园林景区等地方来美化和装饰环境，具有较高的园艺价值；独蒜兰能吸收大量的二氧化碳气体和一些有毒的气体，养殖独蒜兰的四周空气质量一般都特别好，对空气和环境具有非常强大的净化作用。
独蒜兰是中药山慈菇的基原植物，其假鳞茎入药，又称冰球子，是一种临床常用中药。始载于《本草拾遗》，具有清热解毒、化痰散结的功效，用于治疗痈肿疔毒、瘰疬痰核、淋巴结结核和蛇虫咬伤等症，近年来因其抗癌作用而受到广泛关注。但由于人类长期的滥采乱挖和独蒜兰赖以生存环境的不断恶化，再加上自身繁殖速度极其缓慢，其野生资源已面临枯竭而成为濒危物种。由于独蒜兰种子细小如粉，缺少胚乳，自然条件下独蒜兰种子自身不透水、不透气等原因，野外繁殖非常困难，难以萌发。目前，独蒜兰主要采用分株法繁殖，但是繁殖速度缓慢，严重影响产量。
为了满足市场需求和野生资源保护的需要，不少学者对独蒜兰的组织繁殖技术进行研究，但没有获得技术突破，目前只有少数学者进行过原球茎诱导的研究。人工种子技术是快速大量获得植物体的有效方法，白及、铁皮石斛、半夏、白术等都有报道人工种子制作技术研究，但是关于独蒜兰人工种子制作技术的研究报道却相对较少。
本发明采用石斛小菇上清液处理过的独蒜兰种子为人工胚体，添加不同种类植物生长调节剂及杀菌剂，筛选最佳的人工胚乳配方和人工种皮，制备适合直接播种的独蒜兰人工种子，为独蒜兰繁育提供一条新途径。
三、发明内容
本发明目的是提供一种新型独蒜兰人工培育的方法，该方法能够繁殖出大量适合直接播种的优良独蒜兰，满足其生产需要。
本发明采用的技术方案：
本发明提供一种独蒜兰人工培育的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)种子预处理：将独蒜兰果荚中自然种子浸泡于石斛小菇发酵上清液中，25-30℃浸泡10-30h(优选28℃浸泡24h，每4h摇晃均匀一次)，获得预处理后的独蒜兰种子；所述石斛小菇发酵上清液是将石斛小菇经发酵培养获得的发酵液离心后获得的上清液；所述石斛小菇优选保藏于山西自然科技资源共享平台的编号为BISX50487的石斛小菇；
(2)种子萌发：将步骤(1)预处理后的独蒜兰种子加入胚乳溶液中，混合均匀后，获得含种子的胚乳液；将含有种子的胚乳液滴入种皮溶液中(优选逐滴滴入，使得种子包覆在30g/L海藻酸钠溶液内)，室温反应0-30min，然后再在4℃保存10-20d至种子破皮后，获得萌发的种子；所述胚乳溶液组成为：MS培养基+10-40g/L海藻酸钠+100.0g/L土豆汁(100g土豆，加水1000mL煮沸半个小时，纱布过滤)+0.1-0.5mg/L NAA+0.1-0.5mg/L 6-BA+0.1-0.5g/L的抗菌剂；所述抗菌剂为多菌灵或青霉素；所述种皮溶液组成为：0.1-0.3mol/LCaCl2+0.1-0.3mol/L SiO2，溶剂为水。
(3)种子种植：步骤(2)萌发的种子移栽于装有土壤基质的育苗盆中，温度保持在20～25℃，空气湿度为40％-70％，1-2d喷水一次；当种子长成为植株幼苗后移栽于25℃温室大棚，然后进行正常的田间管理；所述土壤基质由椰糠和蛭石组成。
进一步，步骤(1)所述石斛小菇发酵上清液按如下步骤制备：
1)石斛小菇的活化：从石斛小菇(菌株保藏编号：BISX50487)母种培养基上取1cm2的菌块，接种到斜面培养基上，置于霉菌培养箱中28℃扩大培养3-5d，待菌丝体长满斜面的2/3以上，得到活化好的菌种；斜面培养基组成：200g/L马铃薯、10-20g/L葡萄糖和17-20g/L琼脂，溶剂为水；
2)石斛小菇发酵上清液制备：待步骤1)活化好的菌种，转接入液体培养基中，置于摇床中28℃恒温培养至发酵液OD＝0.6～0.8，12000rpm离心30min，得石斛小菇发酵上清液；液体培养基组成：200g/L马铃薯、10-20g/L葡萄糖，溶剂为水。
进一步，步骤(2)所述胚乳溶液配方优选为：MS培养基+30g/L海藻酸钠+100.0g/L土豆汁+0.4mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+0.4g/L青霉素。所述MS培养基组成为：大量元素50mL+钙盐50mL+微量元素10mL+维生素10mL+铁盐5mL+糖30g+肌醇0.1g+琼脂5g，蒸馏水定容至1000mL。所述大量元素组成为：33g NH4NO3，38g KNO3，7.4g MgSO4·7H2O，3.4g KH2PO4，溶剂为水，体积1L；所述钙盐是6.64g/L的CaCl2水溶液；所述微量元素组成：0.0415g KI，0.31gH3BO3，0.845g MnSO4·H2O，0.43g ZnSO4·7H2O，0.0125g NaMoO·H2O，0.00125g CuSO4·5H2O，0.00125g CoCl2·6H2O，溶剂为水，体积1L；所述维生素组成：0.025g VB6，0.025g VB1，0.025g烟酸，0.1g甘氨酸，溶剂为水，体积500mL；所述铁盐是0.01mol/L的FeSO4水溶液。
进一步，步骤(2)所述种皮溶液配方优选为：0.2mol/L CaCl2+0.2mol/L SiO2，溶剂为水。
进一步，步骤(2)优选25℃反应15min，然后再在4℃保存15d。
进一步，步骤(3)土壤基质铺设厚度为3-5cm。所述土壤基质为重量比1:1的椰糠：蛭石组成；所述椰糠性能接近于泥炭，有较强的保水能力，通气性能好，所述蛭石为天然、无机的矿物质，大小3-6mm，具有疏松土壤，透气性好，吸水力强，温度变化小等特点。
本发明海藻酸钠需煮开形成胶状后取出，定容，放凉至25℃再使用。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
(1)采用石斛小菇发酵菌液预处理独蒜兰种子，有利于抑制其他杂菌，促进种子萌发，萌发率高达80.0％，不经过菌液进行预处理，种子萌发率仅35％。
(2)本发明选用胚乳溶液和种皮溶液直接包裹天然种子，省去播种前需要将种子培养成原球茎的步骤，节省大量培养基成本；
(3)本发明方法的种子萌发率高达80.0％，本发明制作工艺简单，成本低廉，可推广使用，可降低独蒜兰培养的生产成本，实现独蒜兰快速大规模化生产。
四、例图说明
图1为实施例4独蒜兰种子萌发绿色芽点的照片，A为实验组，B为对照组(不加石斛小菇发酵菌液预处理)。
图2为实施例4独蒜兰种子萌发破皮后移栽至土壤基质中的照片。
图3为实施例4独蒜兰种子在土壤基质中发育成幼苗的照片。
图4为实施例4独蒜兰种子长成为植株幼苗后移栽于25℃温室大棚。
五、具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明海藻酸钠需煮开形成胶状后取出，定容，放凉至25℃再使用。
所述独蒜兰(学名：Pleione bulbocodioides(Franch.)Rolfe)，兰科、独蒜兰属，独蒜兰种。所述室温是25-30℃。所述MS培养基组成为：大量元素50mL、钙盐50mL、微量元素10mL、维生素10mL、铁盐5mL、糖30g、肌醇0.1g、琼脂5g，蒸馏水定容至1000mL。所述大量元素组成为：33g NH4NO3，38g KNO3，7.4g MgSO4·7H2O，3.4g KH2PO4，溶剂为水，体积1L；所述钙盐是6.64g/L的CaCl2水溶液；所述微量元素组成：0.0415g KI，0.31g H3BO3，0.845gMnSO4·H2O，0.43g ZnSO4·7H2O，0.0125g NaMoO·H2O，0.00125g CuSO4·5H2O，0.00125gCoCl2·6H2O，溶剂为水，体积1L；所述维生素组成：0.025g VB6，0.025g VB1，0.025g烟酸，0.1g甘氨酸，溶剂为水，体积500mL；所述铁盐是0.01mol/L的FeSO4水溶液。
实施例1、独蒜兰种子的预处理
1)石斛小菇萌发菌的活化：从石斛小菇(山西自然科技资源共享平台，菌株保藏编号：BISX50487)萌发菌母种培养基上取1cm2的菌块，接种到斜面培养基上，置于霉菌培养箱中28℃扩大培养5d，待菌丝体长满斜面的2/3以上，获得活化好的菌种。斜面培养基组成：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000mL煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g葡萄糖和20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装，高压蒸汽灭菌(115℃)灭菌20min。
2)石斛小菇发酵液制备：挑取步骤1)活化好的菌种，转接入液体培养基中，置于摇床中28℃恒温培养5d，制得发酵液(OD＝0.6)，12000rpm、30min离心，得石斛小菇上清液。液体培养基组成：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000mL煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g葡萄糖，充分溶解后趁热纱布过滤，分装，高压蒸汽灭菌(115℃)灭菌20min。
3)独蒜兰自然种子的预处理：将独蒜兰果荚中自然种子浸泡于步骤2)制得的石斛小菇上清液中，28℃浸泡24h，每4h摇晃均匀一次，获得预处理后的独蒜兰种子。
实施例2、胚乳溶液、种皮溶液的筛选
1、胚乳溶液配方：
以MS+30g/L海藻酸钠+100.0g/L土豆汁(100g土豆，加水1000mL煮沸半个小时，纱布过滤)为基本包埋液，添加不同种类和浓度的植物生长调节剂、和/或抗菌剂配成不同配比的独蒜兰人工种子胚乳溶液。
2、植物生长调节剂单因素实验：按照表1添加不同种类和浓度的植物生长调节剂组成不同配比的胚乳溶液，调节pH为6.0。
将实施例1方法预处理后的独蒜兰种子0.1g，加入50mL含抗菌剂的胚乳溶液中，混匀；再用口径为5mm的滴管将含有种子的胚乳液滴入种皮溶液中，室温反应15min，然后再在4℃保存10-20d至种子破皮后，获得萌发的种子。
种皮溶液组成：0.2mol/L CaCl2+0.2mol/L SiO2，溶剂为水。
表1植物生长调节剂的种类和浓度
结果：由表1可以看出，0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L五个浓度的NAA(1-萘乙酸)、6-BA(6-氨苄基嘌呤)、2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、KT(氯吡脲)胚乳溶液处理得到的20组人工种子萌发率各不同，其中0.4mg/L的NAA组种子萌发率75％，0.2mg/L的6-BA组种子萌发率80％。
3、种皮溶液单因素实验
在步骤2的基础上，选择胚乳溶液为MS+30g/L海藻酸钠+100.0g/L土豆汁+0.4mg/L的NAA+0.2mg/L的6-BA，根据表2将种皮溶液中CaCl2和SiO2浓度分别改为0.1、0.2、0.3mol/L进行相同实验。
表2不同浓度CaCl2、SiO2及其组合对人工种子成形的影响
结果：0.1mol/L CaCl2+0.1mol/L SiO2制作的人工种子存在拖尾相互黏连的现象，0.3mol/L CaCl2+0.3mol/L SiO2制作的人工种子硬度偏大。因此，0.2mol/L CaCl2+0.2mol/L SiO2的种皮溶液形成的人工种子大小均一，硬度适中，透明且富有弹性，所以该条件是制备人工种子种皮的最佳条件。
4、抗菌剂的单因素实验：
胚乳溶液配方：MS培养基+30g/L海藻酸钠+100.0g/L土豆汁(100g土豆，加水1000mL煮沸半个小时，纱布过滤)+0.4mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+抗菌剂。按照表3添加抗菌剂，同步骤2条件进行实验。
表3、抗菌剂对种子抑菌效果
注：污染情况以种子表面有无菌、渗出液浑浊程度污染颗数为指标，用+表示，—表示没有明显污染，+表示有污染，++表示有较明显的污染。
结果：0.1g/L和0.5g/L的多菌灵以及0.1g/L和0.2g/L的青霉素有较明显污染；0.2g/L和0.4g/L多菌灵以及0.3g/L和0.5g/L的青霉素有轻度污染；0.4g/L的青霉素和0.3g/L的多菌灵抑菌作用最强，低浓度的多菌灵及青霉素不能有效控制菌类生长，人工种子的污染情况较明显；过高浓度的多菌灵及青霉素分别处理的人工种子萌发率较低。综合考虑抗菌效果和萌发率，0.4g/L青霉素为最佳抗菌剂。
5、正交实验
在步骤2、3和4单因素的基础上，选择海藻酸钠、NAA、6-BA、SiO2按表4设计正交实验表，同步骤2条件进行实验，结果见表4。
表4正交考察独蒜兰人工种子种皮胚乳的最佳配方L9(34)
结果：胚乳溶液的最佳配方为：MS培养基+30g/L海藻酸钠+100.0g/L土豆汁+0.4mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+0.4g/L青霉素。种皮溶液最佳配方为：0.2mol/L CaCl2+0.2mol/L SiO2，溶剂为水。
实施例3、离子交换时间筛选
胚乳溶液配方为：MS培养基+30g/L海藻酸钠+100.0g/L土豆汁+0.4mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+0.4g/L青霉素。种皮溶液配方为：0.2mol/L CaCl2+0.2mol/LSiO2，溶剂为水。
将实施例1方法预处理后的独蒜兰种子0.1g，浸泡在50mL胚乳溶液中，混合均匀后，获得包含种子的胚乳液；用口径为5mm的滴管将包含种子的胚乳液吸起，滴入100mL的种皮溶液中(表5)，25℃反应，然后再在4℃保存，选择CaCl2浓度(0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L)、反应时间(5、10、15min)、保存时间(5、10、15d)进行正交实验，设计三因素三水平L933正交实验表，检测种子保水率，结果见表5。
当胚乳液与种皮溶液接触时，两种溶液的离子(海藻酸钠与CaCl2)会进行相互的交换，不同时间对应的种皮硬度就会不同，一般来说，交换时间越长种皮越硬；选用30g/L海藻酸钠与0.2mol/L CaCl2，离子交换15min所得的独蒜兰人工种子，4℃保存15d对人工种子的保水最有利，保水率达90.3％。
表5离子交换时间和保存时间对人工种子保水率影响
保水率是指人工种子4℃储存前后含水量的比值。
综上，我们用石斛小菇萌发菌上清液浸泡过的独蒜兰种子作为人工种胚，以海藻酸钠和CaCl2为包埋基质，考察不同植物生长调节剂及浓度、离子交换时间对独蒜兰人工种子制作和人工种子萌发的影响；改变海藻酸钠浓度、CaCl2浓度、离子交换时间，探究人工种子保水率和储存情况。经过优化组合，以MS+30g/L海藻酸钠+100.0g/L土豆汁+0.4mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+0.4g/L青霉素为胚乳溶液，在0.2mol/L CaCl2+0.2mol/L SiO2的种皮溶液中反应15min为制备条件并进行人工种子的萌发研究。
实施例4、独蒜兰人工种子的制备及种植
(1)独蒜兰种子的预处理：同实施例1。
(2)种子萌发：
胚乳溶液配方为：MS培养基+30g/L海藻酸钠+100.0g/L土豆汁+0.4mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+0.4g/L青霉素。种皮溶液配方为：0.2mol/L CaCl2+0.2mol/L SiO2，溶剂为水。
将实施例1方法预处理后的独蒜兰种子0.1g，浸泡在50mL胚乳溶液中，混合均匀后，获得包含种子的胚乳液；用口径为5mm的滴管将含有种子的胚乳液吸起，滴入100mL的种皮溶液中，室温反应15min，然后再在4℃保存15d，种子破皮，获得萌发的种子，萌发率为80.0％。对照组不经菌悬液处理，其他操作相同，萌发率仅35％，见图1。
(3)种子种植：
步骤(2)萌发的种子移栽于铺有3-5cm厚的土壤基质的育苗盆(图2)中，温度保持在20～25℃，空气湿度为40％-70％，1-2d喷水一次；当种子长成为植株幼苗(图3)后移栽于大棚，然后进行正常的棚间管理(图4)，成活率可达90.5％。
土壤基质为重量比1:1的椰糠：蛭石组成的表面；所述椰糠性能接近于泥炭，有较强的保水能力，通气性能好，所述蛭石为天然、无机的矿物质，大小3-6mm，具有疏松土壤，透气性好，吸水力强，温度变化小等特点；培养皿中种子不被干死。

Claims (7)

1.一种独蒜兰人工培育的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)种子预处理：将独蒜兰果荚中自然种子浸泡于石斛小菇发酵上清液中，25-30℃浸泡10-30h，获得预处理后的独蒜兰种子；
(2)种子萌发：将步骤(1)预处理后的独蒜兰种子加入胚乳溶液中，混合均匀后，获得含种子的胚乳液；再将含种子的胚乳液滴入种皮溶液中，室温反应0-30min，然后再在4℃保存至种子破皮后，获得萌发的种子；所述胚乳溶液组成为：MS培养基+10-40g/L海藻酸钠+100.0g/L土豆汁+0.1-0.5mg/L NAA+0.1-0.5mg/L 6-BA+0.1-0.5g/L的抗菌剂；所述抗菌剂为多菌灵或青霉素；所述种皮溶液组成为：0.1-0.3mol/L CaCl2+0.1-0.3mol/LSiO2，溶剂为水；
(3)种子种植：步骤(2)萌发的种子移栽于装有土壤基质的育苗盆中，温度保持在20～25℃，空气湿度为40％-70％，1-2d喷水一次；当种子长成为植株幼苗后移栽于25℃温室大棚；所述土壤基质由椰糠和蛭石组成。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述石斛小菇发酵上清液按如下步骤制备：
1)石斛小菇的活化：将石斛小菇接种到斜面培养基上，置于霉菌培养箱中28℃扩大培养3-5d，待菌丝体长满斜面的2/3以上，得到活化好的菌种；斜面培养基组成：200g/L马铃薯、10-20g/L葡萄糖和17-20g/L琼脂，溶剂为水；
2)石斛小菇发酵上清液制备：待步骤1)活化好的菌种，转接入液体培养基中，置于摇床中28℃恒温培养至发酵液OD＝0.6～0.8，12000rpm离心30min，得石斛小菇发酵上清液；液体培养基组成：200g/L马铃薯、10-20g/L葡萄糖，溶剂为水。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述胚乳溶液组成为：MS培养基+30g/L海藻酸钠+100.0g/L土豆汁+0.4mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+0.4g/L青霉素。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述种皮溶液组成为：0.2mol/LCaCl2+0.2mol/L SiO2，溶剂为水。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)在25℃反应15min。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)土壤基质铺设厚度为3-5cm。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述土壤基质为重量比1:1的椰糠：蛭石组成。
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