CN101849503A

CN101849503A - 一种铁皮石斛人工种子的制作方法

Info

Publication number: CN101849503A
Application number: CN200910193294A
Authority: CN
Inventors: 刘宏源; 刘星华
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-10-26
Filing date: 2009-10-26
Publication date: 2010-10-06
Anticipated expiration: 2029-10-26
Also published as: CN101849503B

Abstract

本发明提供了一种应用人工种子繁育铁皮石斛的实用技术。本发明的目的在于提供一种高效率、低成本繁育铁皮石斛的技术。所述技术为将铁皮石斛种子在萌发培养基上诱导并获得原球茎，随后进行原球茎的增殖培养，再转入含有0.5mg/LABA的MS培养液内振摇培养(100r/min)，每10d更换培养液1次。30d后用6目尼龙网筛选择长×宽约为0.5-1.5mm×2.0-3.4mm原球茎作为包埋繁殖体，采用滴注法进行人工种子制作，以MS+0.5mg/LBA+0.5mg/LNAA+0.3％AC+3％海藻酸钠+0.3％百菌清为基本人工胚乳，在此基础上添加1.5-2.0％的淀粉、1.0-2.0％的保水剂和1.0-3.0％的纳米TiO₂，以海藻酸钠添加2％壳聚糖和5.0-10％纳米TiO₂为人工种皮基质，并进行人工种子的萌发和贮藏研究。

Description

一种铁皮石斛人工种子的制作方法

技术领域

本发明属生物工程技术领域。具体涉及一种应用人工种子繁育铁皮石斛的实用技术。

背景技术

铁皮石斛Dendrobium candidum Wall.ex Lindl.为兰科石斛属植物，是我国传统名贵中药，居“中华九大仙草”之首，具有滋阴清热、生津止渴的功效。现代药理研究表明，还具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、扩张血管及抗血小板凝集等作用，因此在临床及中药复方中被广泛应用。铁皮石斛是一种生长缓慢、自身繁殖能力极低的兰科附生植物，由于其具有巨大的药用价值和保健价值，导致被长期掠夺性采挖，致使野生资源严重枯竭。

为了更好地保护铁皮石斛野生资源，保障资源的可持续利用，将铁皮石斛野生变家种，发展规模化人工栽培，是保障铁皮石斛资源可持续利用的重要举措。人工种植铁皮石斛首先面临的就是种苗的来源问题。铁皮石斛种子极小、无胚乳，自然条件下需与某些真菌共生才能萌发，很难用实生苗栽培；而传统的分株、扦插等繁殖方式不仅繁殖率极低，而且长期无性繁殖，病原体逐代积累并传递，导致种质退化，品质变劣，产量降低，严重威胁其药材的生产。近年来国内外的研究者对铁皮石斛快繁方面积累了大量的工作经验，利用组织培养虽能在一定程度上解决快繁问题，但其试管苗生产周期长，成本高，还一直存在着移栽驯化过程长，脱瓶移栽存活率低等问题，且不便贮藏和运输，难以进行大规模栽培，远远不能适应国内外市场的需求，从而限制了铁皮石斛的规模化和产业化生产。人工种子技术的诞生为珍稀紧缺的铁皮石斛药材产业化提供了一条新的途径，它使得无菌生长的原球茎可以直接播入土壤，与试管苗相比，减少了移栽驯化过程，并且生产周期短，从而大大降低试管苗培育和移栽驯化中的风险。前人在人工胚乳、包埋方法、人工种皮、贮藏方法等方面做了很多探索，但是还存在如何提高人工种子的萌发率和成苗率、如何进行人工种子贮藏等问题。包埋剂的选择及制作工艺方面尚需改进，以提高原球茎到正常植株的转化率，并达到加工运输方便、防干防腐耐贮藏的目的。在人工胚乳或人工种皮中添加特殊材料来促进其萌发或延长人工种子的贮藏问题已成为人们研究的重点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效率、低成本繁育铁皮石斛的技术。

我们将铁皮石斛种子在萌发培养基上诱导并获得原球茎，随后进行原球茎的增殖培养，再转入含有0.5mg/LABA的MS培养液内振摇培养(100r/min)，每10d更换培养液1次。30d后用6目尼龙网筛选择长×宽约为0.5-1.5mm×2.0-3.4mm原球茎作为包埋繁殖体，采用滴注法进行人工种子制作，以MS+0.5mg/LBA+0.5mg/LNAA+0.3％AC+3％海藻酸钠+0.3％百菌清为基本人工胚乳，在此基础上添加1.5-2.0％的淀粉、1.0-2.0％的保水剂和1.0-3.0％的纳米TiO₂，以海藻酸钠添加2％壳聚糖和5.0-10％纳米TiO₂为人工种皮基质，并进行人工种子的萌发和贮藏研究。

本发明的铁皮石斛人工种子制作方法，其特征包括以下的步骤：

(1)种子无菌萌发

选取铁皮石斛成熟未开裂蒴果，自来水冲洗表面污渍5min，在超净工作台中，用70％酒精棉球擦拭果壳表面沟纹，然后将整个蒴果放入在0.1％升汞溶液中灭菌15-25min，无菌水冲洗4-5次，吸干表面水分。在超净工作台上，用消过毒的手术刀将果实切开，用接种针将粉末状胚接种到种子萌发培养基表面，接种两周后，种子萌发形成原球茎，从而建立原球茎诱导体系。

(2)原球茎增殖

将种子萌发的原球茎接种于增殖培养基中进行培养，接种量，以鲜重计，每瓶3g，原球茎增殖培养基为MS+1.0mg/LKT+0.2mg/LNAA，每升培养基添加50-100ml椰子汁和10-20g纳米TiO₂。

上述步骤(1)-(2)中培养基pH值为5.4-5.6，培养温度(25±2)℃，光照强度2000lx/10h。

(3)铁皮石斛人工种子制作

将增殖后的原球茎，转入含有0.5mg/LABA的MS培养液内振摇培养(100r/min)，每10d更换培养液1次。30d后用6目尼龙网筛选择长×宽约为(0.5-1.5mm×2.0-3.4mm)原球茎作为包埋繁殖体。以MS+0.5mg/LBA+0.5mg/LNAA+0.3％AC+3％海藻酸钠+0.3％百菌清为基本人工胚乳，在此基础上添加1.5-2.0％的淀粉、1.0-2.0％的保水剂和1.0-3.0％的纳米TiO₂，以海藻酸钠为人工种皮基质(用CaCl₂固化)。用蒸馏水配制2％的CaCl₂，经高压灭菌，冷却备用。采用滴注法，在超净台上，将原球茎浸入含有海藻酸钠的人工胚乳中，5min后用吸管将包有原球茎的半凝胶状态海藻酸钠滴到添加2％壳聚糖和5.0-10％纳米TiO₂的2％CaCl₂溶液中，确保每颗人工种子只包裹一个原球茎。在CaCl₂溶液中经过15min的离子交换，自动固化成粒，取出用蒸馏水冲洗干净，置于滤纸上吸去表面水分，获得铁皮石斛人工种子。

(4)人工种子萌发

在不同的萌发基质上进行萌发试验，萌发基质分别为：纯琼脂培养基、MS培养基、复合基质(无菌)、复合基质(有菌)，复合基质为砂土∶锯末＝1∶3(基质先经KMnO₄和甲醛熏蒸消毒，密封5天后敞开散尽甲醛蒸汽)。相同条件下制作的人工种子在不同萌发基质中的萌发率和成苗率也有较明显的差异，在MS琼脂培养基的萌发基质上，人工种子的萌发率、成苗率最高，其次是纯琼脂培养基，然后是复合基质(无菌萌发)，复合基质(有菌萌发)。在人工种子制作中添加纳米材料可阻止营养成分的外泄，并能增强铁皮石斛人工种子抗菌能力，从而提高人工种子在有菌条件下的萌发率。

(5)人工种子贮藏

将制作好的人工种子放入灭菌并烘干的三角瓶中，用封口膜封好，在4℃下分别贮藏30d和60d。

虽然国内有关于铁皮石斛人工种子制作的报道，但是制作出的人工种子仅在培养基中萌发成功，未实现在复合基质或有菌基质中的萌发。本发明利用纳米TiO₂制作的复合人工胚乳和人工种皮，不仅可以改善海藻酸钠包埋系统的透气性、保水性和吸水性，缩短人工种子萌发时间，而且可以抑制微生物的繁殖和生长，达到抑菌、防腐的作用，并能促进人工种子胶粒中的原球茎生长，从而提高人工种子的在复合基质中的萌发率和成苗率，为铁皮石斛人工种子实用化提供技术支持，从而为铁皮石斛的繁育开辟了一条新的途径。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。

实施例1：

选取广东永生源生物科技有限公司引种自云南省文山县生长健壮的铁皮石斛，开花时进行人工授粉，将授粉后100天的成熟未开裂果实作为外植体。用自来水冲洗表面污渍5min，在超净工作台中，用70％酒精棉球擦拭果壳表面沟纹，然后将整个蒴果放入在0.1％升汞溶液中灭菌15min，无菌水冲洗4-5次，吸干表面水分。在超净工作台上，用消过毒的手术刀将果实切开，用接种针将粉末状胚接种到种子萌发培养基(以MS培养基为基本培养基，每升含椰子汁50ml，活性炭10g，蛋白胨1g，蔗糖20g，琼脂9g，pH值为5.4)表面，接种两周后，种子萌发形成原球茎，从而建立原球茎诱导体系。

将种子萌发的原球茎接种于增殖培养基中进行培养，接种量，以鲜重计，每瓶3g，原球茎增殖培养基为MS+1.0mg/LKT+0.2mg/LNAA，每升培养基添加100ml椰子汁和10g纳米TiO₂，培养基pH值为5.6，培养温度(25±2)℃，光照强度2000lx/10h。

将增殖后的原球茎，转入含有0.5mg/LABA的MS培养液内振摇培养(100r/min)，每10d更换培养液1次。30d后用6目尼龙网筛选择长×宽约为(0.5-1.5mm×2.0-3.4mm)原球茎作为包埋繁殖体。以MS+0.5mg/LBA+0.5mg/LNAA+0.3％AC+3％海藻酸钠+0.3％百菌清为基本人工胚乳，在此基础上添加2％的淀粉、1.0％的保水剂和1.5％的纳米TiO₂，以海藻酸钠为人工种皮基质(用CaCl₂固化)。用蒸馏水配制2％的CaCl₂，经高压灭菌，冷却备用。采用滴注法，在超净台上，将原球茎浸入含有海藻酸钠的人工胚乳中，5min后用吸管将包有原球茎的半凝胶状态海藻酸钠滴到添加2％壳聚糖和10％纳米TiO₂的2％CaCl₂溶液中，确保每颗人工种子只包裹一个原球茎。在CaCl₂溶液中经过15min的离子交换，自动固化成粒，取出用蒸馏水冲洗干净，置于滤纸上吸去表面水分，获得铁皮石斛人工种子。

在不同的萌发基质上进行萌发试验，萌发基质分别为：纯琼脂培养基、MS培养基、复合基质(无菌)、复合基质(有菌)，复合基质为砂土∶锯末＝1∶3(基质先经KMnO4和甲醛熏蒸消毒，密封5天后敞开散尽甲醛蒸汽)。人工种子在MS培养基中30d萌发率为92.0％，在复合基质(无菌)中萌发率可达58.0％，在复合基质(有菌)中的萌发率为23.0％。

将制作好的人工种子放入灭菌并烘干的三角瓶中，用封口膜封好，在4℃下贮藏30d的萌发率为84.0％，60d后的萌发率仍可达52.0％，成苗率为48.0％。

实施例2：

选取广东永生源生物科技有限公司铁皮石斛种植基地人工栽培的生长健壮的铁皮石斛，开花时进行人工授粉，将授粉后110天的成熟未开裂果实作为外植体。用自来水冲洗表面污渍5min，在超净工作台中，用70％酒精棉球擦拭果壳表面沟纹，然后将整个蒴果放入在0.1％升汞溶液中灭菌20min，无菌水冲洗4-5次，吸干表面水分。在超净工作台上，用消过毒的手术刀将果实切开，用接种针将粉末状胚接种到种子萌发培养基(以MS培养基为基本培养基，每升含椰子汁80ml，活性炭10g，蛋白胨2g，蔗糖20g，琼脂9g，pH值为5.6)表面，接种两周后，种子萌发形成原球茎，从而建立原球茎诱导体系。

将种子萌发的原球茎接种于增殖培养基中进行培养，接种量，以鲜重计，每瓶3g，原球茎增殖培养基为MS+1.0mg/LKT+0.2mg/LNAA，每升培养基添加50ml椰子汁和15g纳米TiO₂，培养基pH值为5.6，培养温度(25±2)℃，光照强度2000lx/10h。

将增殖后的原球茎，转入含有0.5mg/LABA的MS培养液内振摇培养(100r/min)，每10d更换培养液1次。30d后用6目尼龙网筛选择长×宽约为(0.5-1.5mm×2.0-3.4mm)原球茎作为包埋繁殖体。以MS+0.5mg/LBA+0.5mg/LNAA+0.3％AC+3％海藻酸钠+0.3％百菌清为基本人工胚乳，在此基础上添加1.5％的淀粉、2.0％的保水剂和2.0％的纳米TiO₂，以海藻酸钠为人工种皮基质(用CaCl₂固化)。用蒸馏水配制2％的CaCl₂，经高压灭菌，冷却备用。采用滴注法，在超净台上，将原球茎浸入含有海藻酸钠的人工胚乳中，5min后用吸管将包有原球茎的半凝胶状态海藻酸钠滴到添加2％壳聚糖和5％纳米TiO₂的2％CaCl₂溶液中，确保每颗人工种子只包裹一个原球茎。在CaCl₂溶液中经过15min的离子交换，自动固化成粒，取出用蒸馏水冲洗干净，置于滤纸上吸去表面水分，获得铁皮石斛人工种子。

在不同的萌发基质上进行萌发试验，萌发基质分别为：纯琼脂培养基、MS培养基、复合基质(无菌)、复合基质(有菌)，复合基质为砂土∶锯末＝1∶3(基质先经KMnO4和甲醛熏蒸消毒，密封5天后敞开散尽甲醛蒸汽)。人工种子在MS培养基中30d萌发率为90.6％，在复合基质(无菌)中萌发率可达56.6％，在复合基质(有菌)中的萌发率为22.6％。

将制作好的人工种子放入灭菌并烘干的三角瓶中，用封口膜封好，在4℃下贮藏30d的萌发率为85.0％，60d后的萌发率仍可达53.3％，成苗率为49.4％。

Claims

1.一种铁皮石斛人工种子制作方法，其特征在于具体步骤如下：

(1)种子无菌萌发

选取铁皮石斛成熟未开裂蒴果，自来水冲洗表面污渍5min，在超净工作台中，用70％酒精棉球擦拭果壳表面沟纹，然后将整个蒴果放入在0.1％升汞溶液中灭菌15-25min，无菌水冲洗4-5次，吸干表面水分。在超净工作台上，将果实用消毒后手术刀切开，用接种针将粉末状胚接种到种子萌发培养基表面，接种两周后，种子萌发形成原球茎，从而建立原球茎诱导体系。

(2)原球茎增殖

(3)铁皮石斛人工种子制作

将增殖后的原球茎，转入含有0.5mg/LABA的MS培养液内振摇培养(100r/min)，每10d更换培养液1次。30d后用6目尼龙网筛选择长×宽约为(0.5-1.5mm×2.0-3.4mm)原球茎作为包埋繁殖体。

以MS+0.5mg/LBA+0.5mg/LNAA+0.3％AC+3％海藻酸钠+0.3％百菌清为基本人工胚乳，在此基础上添加1.5-2.0％的淀粉、1.0-2.0％的保水剂和1.0-3.0％的纳米TiO₂，以海藻酸钠为人工种皮基质(用CaCl₂固化)。用蒸馏水配制2％的CaCl₂，经高压灭菌，冷却备用。采用滴注法，在超净台上，将原球茎浸入含有海藻酸钠的人工胚乳中，5min后用吸管将包有原球茎的半凝胶状态海藻酸钠滴到添加2％壳聚糖和1.0-3.0％纳米TiO₂的2％CaCl₂溶液中，确保每颗人工种子只包裹一个原球茎。在CaCl₂溶液中经过15min的离子交换，自动固化成粒，取出用蒸馏水冲洗干净，置于滤纸上吸去表面水分，获得铁皮石斛人工种子。

(4)人工种子萌发

(5)人工种子贮藏

2.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛人工种子制作方法，其特征在于步骤(1)所述的铁皮石斛蒴果为在开花时选取生长健壮的铁皮石斛Dendrobium candidum Wall.ex Lindl.母株进行人工授粉，授粉后果实成熟，选取未开裂的成熟果实作为外植体；步骤(1)所述的种子萌发培养基以MS培养基为基本培养基，每升含椰子汁50-100ml，活性炭10g，蛋白胨1-2g，蔗糖20-30g，琼脂8-9g，pH值为5.4-5.6。

3.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛人工种子制作方法，其特征在于步骤(2)所述的原球茎增殖培养基为MS+1.0mg/LKT+0.2mg/LNAA，每升培养基添加50-100ml椰子汁和10-20g纳米TiO₂，蔗糖30g，琼脂8-9g，pH值为5.4-5.6。

4.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛人工种子制作方法，其特征在于步骤(3)所述的将增殖后的原球茎，转入含有0.5mg/LABA的MS培养液内振摇培养(100r/min)，用6目尼龙网筛选择长×宽约为(0.5-1.5mm×2.0-3.4mm)原球茎作为包埋繁殖体；步骤(3)所述的人工种子制作方法采用滴注法，以MS+0.5mg/LBA+0.5mg/LNAA+0.3％AC+3％海藻酸钠+0.3％百菌清为基本人工胚乳，在此基础上添加1.5-2.0％的淀粉、1.0-2.0％的保水剂和1.0-3.0％的纳米TiO₂，以海藻酸钠添加2％壳聚糖和5.0-10％纳米TiO₂为人工种皮基质(用CaCl₂固化)。

5.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛人工种子制作方法，其特征在于步骤(4)所述的人工种子萌发基质分别为：纯琼脂培养基、MS培养基、复合基质(无菌)、复合基质(有菌)，复合基质为砂土∶锯末＝1∶3(基质先经KMnO₄和甲醛熏蒸消毒，密封5天后敞开散尽甲醛蒸汽)。人工种子在培养基中萌发率为90％以上，在复合基质(无菌)中萌发率可达50％以上，在复合基质(有菌)中的萌发率为20％左右。目前，国内制作的人工种子多停留在实验室研究阶段，直接用于栽培的铁皮石斛人工种子尚无研究。铁皮石斛人工种子在复合基质中的萌发率，是直接关系到铁皮石斛人工种子能否应用到生产实践的一个难题和关键，

6.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛人工种子制作方法，其特征在于步骤(5)所述的人工种子在4℃下贮藏30d的萌发率为85.0％，60d后的萌发率仍可达53.3％，成苗率为49.4％，可实现铁皮石斛人工种子的短期贮藏和运输。。