CN105557528A

CN105557528A - 一种抗菌的诸葛菜人工种子制作方法

Info

Publication number: CN105557528A
Application number: CN201610058789.5A
Authority: CN
Inventors: 吴沿友; 谷睿智; 邢德科; 于睿; 胡林生; 吴沿胜; 黎明鸿; 姚香萍
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Wuxi Wisdom Xingyi Information Technology Co ltd
Priority date: 2016-01-28
Filing date: 2016-01-28
Publication date: 2016-05-11
Anticipated expiration: 2036-01-28
Also published as: CN105557528B

Abstract

本发明公开了一种抗菌的诸葛菜人工种子制作方法，属于生物技术和农业工程领域，本发明所述的方法包括诸葛菜的芽诱导、芽繁培养、芽的包埋和人工种子胶囊制备，所述芽的包埋和人工种子胶囊制备的过程中的包埋液是含纳米二氧化钛的质量浓度为7％海藻酸钠水溶胶。根据本发明制作方法制作出来的人工种子，在有菌环境下生根发芽率高，污染率低，相比于添加传统杀菌剂的人工种子具有抗菌效果更好，萌发率更高，对外植体毒害作用更低的特点，进一步将诸葛菜人工种子技术推向生产应用。

Description

一种抗菌的诸葛菜人工种子制作方法

技术领域

本发明属于生物技术和农业工程领域，具体涉及一种抗菌的诸葛菜人工种子的制作方法。

背景技术

诸葛菜属于十字花科一、二年生草本植物，广泛分布于我国东北、华北，适应性强，耐寒、耐旱、耐阴，病虫害少。花呈紫色或白色，生活史从每年9月至次年6月，甚至在寒冷冬季仍可保绿不枯，可以较好地覆盖地面，是北方地区不可多得的早春观花，冬季观绿的地被植物，因此深受人们喜欢。诸葛菜种子的脂肪酸组成中，芥酸、亚麻酸含量低，棕榈酸、油酸和亚油酸的含量为总脂肪的89.8％，即诸葛菜为高亚油酸低芥酸种质，其种子油是品质优良的食用油，尤其适合心血管病患者食用。近年来诸葛菜在组织培养、体细胞杂交等方面的研究多有进展，诸葛菜人工种子技术也颇有进展，现在已经建立了一套较为完整的诸葛菜人工种子制作方法，但距离实际应用还有一定距离。

人工种子技术的实质就是将组织培养产生的外植体，如芽或胚状体，包埋在人工制作的含有特定激素和营养的胶囊中，具有天然种子长成植株的功能。与天然种子不同，人工种子不受季节的影响，可以根据播种环境改变激素和营养物质配方，而且成本低廉，可控性强，研制成功必然会带来一场农业革命。

防腐抗菌问题一直是阻碍人工种子技术大规模推广的一大难题，常用杀菌剂如多菌灵、青霉素、先锋霉素等均对植物有一定负面影响，并且单独添加往往只能抵抗几种菌类污染。目前诸葛菜人工种子只能在无菌条件下萌发，并未有人进行过诸葛菜人工种皮抗菌性研究，因此抗菌能力的研究已经成为推广诸葛菜人工种子技术发展亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗菌的诸葛菜人工种子制作方法，制作出来的诸葛菜人工种子种皮具有较高的抗菌能力、种子可以在有菌环境中顺利萌发，为诸葛菜人工种子技术进一步走向实际应用提供技术支持。

本发明采用具体技术方案为：

一种抗菌的诸葛菜人工种子的制作，包括步骤：

步骤1，诸葛菜的芽诱导：取诸葛菜幼苗,无菌水冲洗，切取腋芽和顶芽，消毒后进行芽诱导培养；

步骤2，诸葛菜的芽繁培养：取步骤1芽诱导培养的诸葛菜组培苗，切取幼芽，转接到芽繁培养基上进行芽繁培养；

步骤3，诸葛菜芽的包埋和人工种子胶囊制备：取步骤2中在芽繁培养基上生长的幼芽，切取若干个一定长度的芽并逐个放在包埋液表面，所述包埋液是含纳米二氧化钛的质量浓度为7％海藻酸钠水溶胶；用玻璃吸管先吸取少量包埋液，再吸入一个诸葛菜芽，然后滴入质量浓度为2％的CaCl₂溶液中，络合反应形成固态人工种子，取出所述固态人工种子，于无菌水中清洗并吸干表面水分即可。

进一步，所述步骤1中的芽诱导培养使用的培养基的成分包括：MS培养基、2mg/L6-BA、0.2mg/LNAA、3％蔗糖、0.65％琼脂；芽诱导过程的光照强度为2000～3000Lux日光灯照射12小时。

进一步，所述步骤2中的芽繁培养基的成分包括：MS培养基、2.5mg/L6-BA、0.2mg/LNAA、3％蔗糖、0.65％琼脂；芽繁培养的光照强度为2000～3000Lux日光灯照射12小时。

进一步，所述步骤3中在芽繁培养基上生长的幼芽生长时间为30天；切取若干个芽的长度为8mm。

进一步，所述步骤3中包埋液的成分包括：质量浓度为7％海藻酸钠水溶胶、0.1-0.2mg/LNAA、20-40g/LnTiO₂、1/2MS培养基、3％蔗糖。

更进一步，所述nTiO₂为锐钛型纳米TiO₂，其粒径为15±5nm。

更进一步，所述NAA优选为0.1mg/L，所述nTiO₂优选为30g/L。

本发明的有益效果是：

1.因添加纳米二氧化钛，常规的海藻酸钠(质量浓度小于5％)难以使诸葛菜人工种子固化形成胶囊，本发明使用质量浓度为7％海藻酸钠浓度水溶胶作为包埋液，解决了诸葛菜人工种子难以固化的问题。

2.本发明生产的人工种子具有很好的抗菌效果，不需要在无菌环境下完成种子的制作，完全可用于有菌环境下播种，与添加传统抗菌剂的诸葛菜人工种子相比具有明显优势；可显著提高了种子的萌发率和萌发速度，对植株毒害作用小，为诸葛菜人工种子从实验室走进大田提供了技术支持。

3.本发明开展了不同配比的NAA和纳米TiO₂对诸葛菜人工种子萌发的影响研究以及有菌萌发实验，找出纳米二氧化钛和NAA的最佳配比，实现了纳米二氧化钛抗菌和促萌、促生的完美结合。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。

本发明的实施例中，一种抗菌的诸葛菜人工种子制作方法，包括以下步骤：

步骤1，诸葛菜的芽诱导：取诸葛菜幼苗,无菌水冲洗3分钟，切取腋芽和顶芽，在超净工作台上完成消毒,无菌接种在芽诱导培养基上进行芽诱导培养；芽诱导培养基的包括：MS培养基、2mg/L6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)、0.2mg/LNAA(α-萘乙酸)、3％蔗糖、0.65％琼脂；芽诱导过程的光照强度2000～3000Lux日光灯照射12小时；

步骤2，诸葛菜的芽繁培养：取步骤1芽诱导培养的诸葛菜组培苗，切取幼芽，转接到芽繁培养基上进行芽繁培养；芽繁培养基的包括：MS培养基、2.5mg/L6-BA、0.2mg/LNAA、3％蔗糖、0.65％琼脂；芽繁培养的光照强度为2000～3000Lux日光灯照射12小时；

步骤3，诸葛菜芽的包埋和人工种子胶囊制备：步骤2中的幼芽在芽繁培养基上生长30天后，取出，置于超净工作台上并切取8mm左右的芽若干个，将切取的若干个芽逐个放在包埋液表面，所述包埋液是含纳米二氧化钛的7％海藻酸钠水溶胶，其组成包括：质量浓度为7％海藻酸钠、0.1-0.2mg/LNAA、20-40g/LnTiO₂、1/2MS培养基、3％蔗糖，其中nTiO₂为锐钛型纳米TiO₂，其粒径为15±5nm；

所述步骤1、步骤2和步骤3中的MS培养基是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的培养基，包括：大量元素：NH₄NO₃为1650mg/L、KNO₃为1900mg/L、CaCl₂·2H₂O为440mg/L、MgSO₄·7H₂O为370mg/L、KH₂PO₄为170mg/L；微量元素：KI为0.83mg/L、H₃BO₃为6.2mg/L、MnSO₄·4H₂O为22.3mg/L、ZnSO₄·7H₂O为8.6mg/L、Na₂MoO₄·2H2O为0.25mg/L、CuSO₄·5H₂O为0.025mg/L、CoCl₂·6H₂O为0.025mg/L；铁盐：FeSO₄·7H₂O为27.8mg/L、Na₂-EDTA·2H₂O为37.3mg/L；有机物质：肌醇为100mg/L烟酸为0.5mg/L、盐酸吡哆醇(维生素B6)为0.5mg/L、盐酸硫胺素(维生素B1)为0.1mg/L、甘氨酸为2.0mg/L；

用内径8mm的玻璃吸管先吸取少量包埋液，再吸入一个诸葛菜芽，然后滴入质量浓度为2％的CaCl₂溶液中，络合反应10分钟，形成固态人工种子，取出所述固态人工种子在无菌水中清洗3分钟，置于滤纸上吸干表面水分即可用于播种。

下面根据本发明制作的诸葛菜人工种子进行无菌萌发实验和有菌萌发实验，验证本发明制作的诸葛菜人工种子的萌发能力和抗菌能力。

实验一：调节包埋液中NAA和纳米TiO₂的配比，进行诸葛菜人工种子的无菌萌发实验

对NAA和纳米TiO₂的配比进行调整，根据本发明的制作方法制作诸葛菜人工种子，并置于MS培养基上，观察诸葛菜人工种子在无菌环境下30天的萌发情况，实验分15组进行，结果如表1所示。

表1无菌环境下不同配比的NAA和纳米TiO₂对诸葛菜人工种子萌发的影响

实验组

NAA

纳米TiO₂

萌发率

生根率

萌发时间

生根时间

1

0mg/L

0g/L

0.00％

/

2

0mg/L

10g/L

20.00％

0.00％

10d

/

3

0mg/L

20g/L

66.67％

13.33％

6d

19d

4

0mg/L

30g/L

87.50％

37.50％

4d

18d

5

0mg/L

40g/L

56.25％

25.00％

4d

17d

6

0.1mg/L

0g/L

28.57％

0.00％

13d

/

7

0.1mg/L

10g/L

53.33％

33.33％

5d

20d

8

0.1mg/L

20g/L

73.33％

53.33％

3d

16d

9

0.1mg/L

30g/L

100.00％

80.00％

3d

14d

10

0.1mg/L

40g/L

100.00％

46.67％

4d

15d

11

0.2mg/L

0g/L

73.33％

33.33％

9d

22d

12

0.2mg/L

10g/L

100.00％

40.00％

5d

15d

13

0.2mg/L

20g/L

100.00％

73.33％

3d

13d

14

0.2mg/L

30g/L

93.33％

53.33％

3d

18d

15

0.2mg/L

40g/L

100.00％

21.43％

2d

21d

从表1可看出，在0、0.1、0.2mg/LNAA三个水平上添加纳米TiO₂都能显著提高诸葛菜人工种子的萌发率和萌发速度；在每个水平都存在一个纳米TiO₂的最佳浓度使生根率达到最大，生根速度达到最快。总体来看，第9组和第13组为最佳组合，萌发率均达到100％，生根率超过70％，取这两组进行抗菌性实验。

实验二：添加传统杀菌剂多菌灵，进行诸葛菜人工种子有菌萌发实验

设置添加不同浓度梯度多菌灵的实验组，再添加一个空白对照组(不添加杀菌剂)，于实验一中挑选出的萌发效果最好的两组，根据本发明的制作方法制作诸葛菜人工种子，在珍珠岩上进行有菌萌发实验，实验结果见表2。

表2有菌环境下诸葛菜人工种子的萌发率与污染率

从表2中可以看出，4、7组萌发率最高，污染率最低，添加30g/L纳米TiO₂的第7组15天污染率在10％以下，30天污染率也仅达到三成，并且萌发率达到83.33％，与2、3组对比可以看出抗菌能力明显强过多菌灵；与8、9组对比可以看出对外植体的毒害作用明显小于多菌灵，且与多菌灵同时作用反而使污染率升高。说明本发明中0.1mg/LNAA、30g/LnTiO₂、1/2MS培养基、3％蔗糖的组合是抗菌能力最强，综合效果最好的。

以上对本发明所提供的一种抗菌的诸葛菜人工种子制作方法进行了详细介绍，本文应用了具体个例对本发明的原理和实施方式进行了阐述，所要说明的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种抗菌的诸葛菜人工种子制作方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种抗菌的诸葛菜人工种子制作方法，其特征在于，所述步骤1中的芽诱导培养使用的培养基的成分包括：MS培养基、2mg/L6-BA、0.2mg/LNAA、3％蔗糖、0.65％琼脂；芽诱导过程的光照强度为2000～3000Lux日光灯照射12小时。

3.根据权利要求1所述的一种抗菌的诸葛菜人工种子制作方法，其特征在于，所述步骤2中的芽繁培养基的成分包括：MS培养基、2.5mg/L6-BA、0.2mg/LNAA、3％蔗糖、0.65％琼脂；芽繁培养的光照强度为2000～3000Lux日光灯照射12小时。

4.根据权利要求1所述的抗菌的一种抗菌的诸葛菜人工种子制作方法，其特征在于，所述步骤3中在芽繁培养基上生长的幼芽生长时间为30天；切取若干个芽的长度为8mm。

5.根据权利要求1所述的抗菌的一种抗菌的诸葛菜人工种子制作方法，其特征在于，所述步骤3中包埋液的成分包括：质量浓度为7％海藻酸钠水溶胶、0.1-0.2mg/LNAA、20-40g/LnTiO₂、1/2MS培养基、3％蔗糖。

6.根据权利要求5所述的抗菌的一种抗菌的诸葛菜人工种子制作方法，其特征在于，所述nTiO₂为锐钛型纳米TiO₂，其粒径为15±5nm。

7.根据权利要求5所述的抗菌的一种抗菌的诸葛菜人工种子制作方法，其特征在于，所述NAA优选为0.1mg/L，所述nTiO₂优选为30g/L。