CN104304030A

CN104304030A - 一种东方百合的繁殖方法

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Publication number: CN104304030A
Application number: CN201410607072.2A
Authority: CN
Inventors: 胡正峰; 张科锋; 靳慧霞; 张会宁; 甘慧慧; 吕慧捷; 张东霞; 陈靳曦
Original assignee: Ningbo Institute of Technology of ZJU
Current assignee: Ningbo Institute of Technology of ZJU
Priority date: 2014-10-31
Filing date: 2014-10-31
Publication date: 2015-01-28
Anticipated expiration: 2034-10-31
Also published as: CN104304030B

Abstract

本发明公开了一种东方百合的繁殖方法，即以东方百合的花丝为外植体，经消毒，愈伤组织诱导，不定芽的诱导，不定芽的增殖，不定芽的诱导生根，组培苗的炼苗和移栽等环节直至形成苗的过程。本法对于降低东方百合生产成本，提高百合品质具有巨大价值。本法涉及到东方百合外植体和消毒方法的选择，植物激素的选择，愈伤组织的诱导条件的优化，不定芽诱导和增殖条件的优化，生根培养条件的优化，以及炼苗和移栽等条件的优化。本法具有外植体消毒方法简单易行，外植体培养条件宽泛，培养难度低，组培苗成活率高的特点，是一种简单高效的东方百合快速繁殖方法。

Description

一种东方百合的繁殖方法

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及到一种东方百合外植体消毒方法，组织培养及植株再生过程即一种东方百合的繁殖方法。

背景技术

百合是市场上最畅销的花卉之一，东方百合因花色丰富，香气宜人，姿态优雅，寓意丰富，花朵保质期长而深受人们的喜爱。百合通常采用营养繁殖的方法，比如使用鳞茎及鳞片、株芽、茎等来繁殖，然而这些方法都会导致品种的严重退化，抗病性变差。解决这一问题最佳方法是采用植物组织培养技术，获得性状稳定的脱毒苗。

建立无菌培养体系是植物组织培养的第一步，通常采用的方法是使用乙醇、H₂O₂、NaClO、CaClO、HgCl₂等表面消毒剂来处理外植体，然后再接种到培养基中进行培养。但是外植体长期与外界接触，不可避免地带有微生物，尤其是对于百合而言，其生长周期较长，消毒起来比较费力。而且百合主要通过鳞茎来繁殖，鳞茎在土壤中生长，带有的病毒和病菌更多。在实验中，课题组发现百合鳞茎使用0.1％HgCl₂消毒15min后，污染率达80％左右。另外，上面提及的化学消毒试剂在使用时应特别注意，重金属汞会对操作人员和环境造成伤害，NaClO和CaClO能够产生氯气等毒性高的物质。

外植体的选择对于植物再生体系的建立也十分关键。由外植体到植株再生一般通过体细胞胚途径、愈伤组织和不定芽途径，只有选择合适的外植体才能够形成体细胞胚、愈伤组织或不定芽。百合植株再生过程中常常使用鳞茎、叶片作为外植体。比如付文奇等(NAA和2,4-D对东方百合组织培养的影响.西北林学院学报,2008.23(2):p.83-86)使用鳞片为外植体，建立了东方百合“蒂伯”小鳞茎培养体系。张文种等人(不同激素配比对麝香百合鳞茎芽诱导的影响.亚热带植物科学,2002.31(1):p.21-24)也使用鳞茎成功诱导出麝香百合小鳞茎。还有赵庆芳等(东方百合组织培养和快速繁殖研究.西北师范大学学报(自然科学版),2003.39(1):p.66-6)建立东方百合快速无性繁殖系也是通过鳞茎诱导出不定芽实现的。还有一些文献报道，通过叶片成功建立百合再生体系。如袁芳亭等(麝香百合的叶片离体培养及植株再生.湖北农业科学,2001(3):p.50-51)取麝香百合带芽的幼嫩叶片，在NAA 1.0mg L^-1+6-BA 0.1mg L^-1诱导下生长出愈伤组织，再由愈伤组织诱导不定芽。孟芮等(百合遗传转化受体系统的建立.西北农林科技大学学报(自然科学版),2006.34(4):p.32-38)在建立东方百合“索邦”再生体系时使用叶片作为外植体。这些研究虽然都成功建立了百合再生体系，但是由于鳞片、叶片等并不能实现脱除病毒，还有上面提及的消毒过程繁琐，一定程度上增加了技术难度。因此有研究人员提出使用生长速度快的组织作为外植体，如茎尖和花部组织。

花部组织作为外植体的诱导在于其在环境中暴露的时间短，消毒相对简单。许洁婷等(麝香百合花部组织离体培养与植株再生.上海交通大学学报(农业科学版),2008.26(1):p.13-16)比较了麝香百合花部组织诱导愈伤的效果，结果说明，诱导愈伤组织的能力由强到弱依次为花丝>花托>花梗>花柱>花瓣。但是一般认为外植体的分化程度越高其脱分化的能力就越弱，所以，如何使花部组织脱分化，对于东方百合的快速繁殖而言显得十分重要。植物激素，尤其是生长素和细胞分裂素的比例对于体细胞胚的形成、愈伤和不定芽的诱导具有决定性作用，它们的使用浓度精确到mg/L，使用时必须精确添加，否则结果将差距巨大。所以找到合适的激素及其使用浓度，是植物实现快速繁殖的关键。

植物快速繁殖的最后一步是生根和移栽。不定芽生根后或体细胞胚发育成熟后，就可以进行生根和移栽了。组培苗长期生长在高湿度、稳定恒定、光照柔和的环境中，需要一个适应的过程，需要对组培苗进行驯化，培养基质配比条件进行探索。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种不会对人体和环境造成伤害的灭菌方法，选用的外植体易于脱除病毒、取材方便，且经过试验优化的植物激素种类及其使用浓度能对愈伤组织诱导，不定芽的形成以及生根等具有决定性作用的东方百合的繁殖方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种东方百合的繁殖方法，该方法包括以下环节：以东方百合的花丝为外植体，经消毒，愈伤组织诱导，不定芽的诱导，不定芽的增殖，不定芽的诱导生根，组培苗的炼苗和移栽直至形成苗。

本发明上述以东方百合的花丝为外植体，经消毒具体为：取东方百合尚未开放的花苞去其花苞外侧的叶片、留少许叶柄(叶柄长度不超过5mm)，先用体积浓度为70-80％的酒精把花苞的表面擦拭2-3次，然后放在酒精灯的外焰上灼烧5-10min，灼烧时要均匀受热，且叶柄和叶片缝隙内要着重灼烧；然后剥去花苞，露出花苞内部花药和花丝等部位，将花丝切成0.5-1.5cm长的小段备用。

本发明上述的愈伤组织诱导，具体为：先配制愈伤组织诱导培养基并高压灭菌，待培养基凝固后将消毒后的花丝横着接种在培养基中，于22-25℃，光照强度1000～2000lux，持续光照时间8～12小时条件下培养6-10周的时间，花丝切口形成明显的凸起，即愈伤组织；愈伤组织诱导培养基为：在MS培养基中添加毒莠定0.6～5mg L^-1，蔗糖3％(质量百分比)，琼脂0.6％(质量百分比)。

本发明上述的不定芽的诱导，具体为：将花丝形成的愈伤组织切成0.3-0.7cm直径大小的小块(可以理解为边长为0.3-0.7cm的方块)接种在灭菌的添加了1.0mg L^-1的6-苄氨基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)MS培养基中，其中6-BA在高压灭菌前加入；然后于22-25℃，光照强度1000～2000lux，光照时间8～12小时条件下培养5-7周，愈伤组织上形成不定芽，不定芽进一步发育形成小鳞茎。

本发明上述的不定芽的增殖，具体为：将小鳞茎切成0.5cm×0.5cm大小的小片，置于高压灭菌的添加了0.6mgL^-1的6-BA和0.2mg L^-1的α-萘乙酸(NAA，1-naphthlceticacid)的MS培养基中，6-BA和NAA均在高压灭菌前加入；然后于22-25℃，光照强度1000～2000lux，光照时间8～12小时条件下培养3-5周，小鳞茎上出现丛状得不定芽的形成。

本发明上述的不定芽的诱导生根，具体为：将诱导出的呈丛状的不定芽分割为单株，然后转入生根培养基中，生根培养基采用低盐培养基，具体做法是将MS培养中的大量元素减半，其它的成分不变，具体生根培养为在加入了0.1mg L^-1α-萘乙酸和0.01mg L^-1吲哚丁酸(3-Indolebutyric acid，IBA)中1/2MS培养基中放置12-16天即可生根，生根率可达90％以上，根系健壮。

本发明上述的组培苗的炼苗和移栽直至形成苗，具体为：将装有组培苗即诱导生根的不定芽的组培瓶打开一个缝隙，置于温室大棚中进行炼苗，并向组培瓶中倒入无菌水以防止植株失水为限，控制湿度在75-85％，避免强光直射，炼苗6-8天；6-8天后将苗取出(组培苗根长到1.5-2.5cm)，用无菌水冲掉粘在苗上的培养基后，分别移入经高压灭菌锅灭菌的珍珠岩和蛭石体积之比为1:1的基质中，保持75％的湿度，50％的自然光照，8-12天喷一次稀释10倍的MS营养液，培养成幼苗；移栽成活率可达90％以上。

本发明上述的高压灭菌为121℃、103.4kPa下，高压灭菌20min。

上述添加到培养基中的各组分的量，均是以最终在配制好的培养基中的浓度或用量。

本发明的优点和有益效果：

1.本发明首次以东方百合的花丝作为外植体具有易于诱导，取材方便的特点，并结合酒精灼烧消毒的方法，克服了现有百合再生体系选用鳞片、叶片等脱除病毒困难、消毒过程繁琐、技术难度大的不足，并且提高了生长速度。同时，酒精灼烧的组织灭菌方法避免了使用NaClO、HgCl₂、H₂O₂等组织培养过程中常用的外植体消毒剂对人体和环境造成的伤害，而且操作极为简单，整个过程不超过10min，无菌外植体可达95％以上，灭菌简单。

2.本发明实现了对优选外植体的培养，成功诱导出愈伤组织，这种愈伤组织的形式是实现东方百合植株再生关键步骤；本发明严格控制了能够使这种愈伤组织诱导出不定芽的植物激素种类及浓度，而且植物激素使用浓度较为宽泛，实践操作性强，具体配方为MS+毒莠定0.6～5mg L^-1。

3.本发明实现了对不定芽的诱导培养条件的筛选，花丝形成的愈伤组织在优选的培养基中能够形成不定芽，成功率可达70％左右，具体培养基为MS+6-BA 1.0mg L^-1。

4.本发明实现了不定芽的增殖培养，上述愈伤组织形成不定芽后能够进一步长出小鳞茎，小鳞茎在MS+6-BA0.6mgL^-1+NAA 0.2mg L^-1中可以诱导出不定芽，平均每个外植体可形成4.28个不定芽。

5.本发明实现了对不定芽的生根培养，完成了东方百合由芽到植株的再生过程。在生根培养基1/2MS+NAA 0.1mg L^-1+IBA 0.01mg L^-1中，不定芽的生根率可达95％。

6.本发明实现了上述有根组培苗的移栽，将组培苗从组培瓶中移出，需要优化生长条件才能在室外存活，使用优化的炼苗方法，优化的比例为珍珠岩和蛭石比例为1:1，，以及合适的管理方法，成活率达90％以上。

附图说明：

图1花丝外植体诱导愈伤组织(早期)

图2花丝外植体诱导愈伤组织(后期)

图3愈伤组织诱导形成不定芽

图4不定芽的增殖培养

图5不定芽的生根培养

图6不定芽移栽

具体实施方式：

下面通过实施例进一步详细描述本发明，但本发明不仅仅局限于以下实施例。

实施例1 外植体消毒方法

取市售东方百合尚未开放的花苞去其叶片，留少许叶柄，先用75％的酒精把外植体的表面擦拭两次，然后手拿叶柄部分放在酒精灯的外焰上灼烧5-10min，灼烧时要均匀受热，且叶柄和叶片缝隙内要着重灼烧。然后剥去叶片，露出花药和花丝等部位，将花丝切成1cm长左右的小段备用。

实施例2 花丝愈伤组织的诱导

先配制MS培养基，具体方法如下，按照附表1的配方，将大量元素配制成20倍母液，其它按成分配制成微量元素、铁盐、有机成分200倍母液。配成1L培养基分别取上述母液50mL、5mL、5mL、5mL，混合后加入500mL蒸馏水和6g琼脂粉，加热充分溶解，最后加入30g蔗糖，加水定容至1L，调pH值至6.5左右，分装至组培瓶中。于121℃、103.4kPa下，高压灭菌20min(培养基配制和灭菌方法下同)，冷却到50℃左右，向培养基中加入毒莠定至终浓度2mg L^-1，待培养基凝固后，将花丝横着接种在培养基中，于22-25℃，光照强度1000～2000lux，光照时间8～12小时条件下培养。诱导8周左右时间，花丝切口会形成明显的凸起，即愈伤组织。

实施例3 愈伤组织诱导不定芽

花丝形成愈伤组织后，将愈伤组织切成0.5cm直径大小的小块接种在灭菌的MS+6-BA 1.0mg L^-1培养基中，其中6-BA在高压灭菌前加入；于22-25℃，光照强度1000～2000lux，光照时间8～12小时条件下培养6周，可见愈伤组织上形成不定芽，不定芽可进一步发育形成小鳞茎。

实施例4 不定芽的增殖

将小鳞茎切成0.5cm×0.5cm大小的小片，置于高压灭菌的MS+6-BA 0.6mgL^-1+NAA 0.2mg L^-1，6-BA和NAA均在高压灭菌前加入。于22-25℃，光照强度1000～2000lux，光照时间8～12小时条件下培养4周左右小鳞茎上可见不定芽的形成。

实施例5 不定芽的诱导生根

诱导出的不定芽呈丛状，将丛生芽分割为单株，转入生根培养基中，生根培养采用低盐培养基，具体做法是将MS培养中的大量元素减半，其它的成分不变。在培养基1/2MS+NAA 0.1mg L^-1+IBA 0.01mg L^-1中15d即可生根，生根率可达90％以上，根系健壮。

实施例6 组培苗的炼苗和移栽

组培苗根长到2cm左右即可移栽。稍稍打开组培瓶，置于温室大棚中进行炼苗，并向组培瓶中倒入少量无菌水防止植株失水，控制湿度在80％左右，避免强光直射，炼苗7d。7d后将苗取出，用无菌水冲掉粘在苗上的培养基后，分别移入经高压灭菌锅灭菌的珍珠岩和蛭石体积之比为1:1的基质中，保持75％的湿度，50％的自然光照，10d左右喷一次稀释10倍的MS营养液，移栽成活率可达90％以上。

表1 MS培养基母液的配制

Claims

1.一种东方百合的繁殖方法，其特征在于，该方法包括：以东方百合的花丝为外植体，经消毒，愈伤组织诱导，不定芽的诱导，不定芽的增殖，不定芽的诱导生根，组培苗的炼苗和移栽直至形成苗。

2.根据权利要求1所述东方百合的繁殖方法，其特征在于，所述的以东方百合的花丝为外植体，经消毒具体为：取东方百合尚未开放的花苞去其叶片、留少许叶柄，先用体积浓度为70-80％的酒精把花苞的表面擦拭2-3次，然后放在酒精灯的外焰上灼烧5-10min；然后剥去花苞露出内部的花药和花丝部位，将花丝切成0.5-1.5cm长的小段备用。

3.根据权利要求2所述东方百合的繁殖方法，其特征在于，所述的愈伤组织诱导，具体为：先配制愈伤组织诱导培养基，再对培养基进行高压灭菌，待培养基凝固后将消毒后的花丝接种在培养基中，于22-25℃，光照强度1000～2000lux，持续光照时间8～12小时条件下培养6-10周的时间，花丝切口形成明显的凸起即愈伤组织；愈伤组织诱导培养基为：在MS培养基中添加毒莠定0.6～5mg L^-1，蔗糖3％，琼脂0.6％。

4.根据权利要求3所述东方百合的繁殖方法，其特征在于，所述的不定芽的诱导，具体为：将花丝形成的愈伤组织切成0.3-0.7cm长度的小块接种在高压灭菌的、添加了1.0mg L^-1的6-苄氨基腺嘌呤的MS培养基中，其中6-苄氨基腺嘌呤在高压灭菌前加入；然后于22-25℃，光照强度1000～2000lux，光照时间8～12小时条件下培养5-7周，愈伤组织上形成不定芽，不定芽进一步发育形成小鳞茎。

5.根据权利要求4所述东方百合的繁殖方法，其特征在于，所述的不定芽的增殖，具体为：将小鳞茎切成0.5cm×0.5cm大小的小片，置于高压灭菌的添加了0.6mgL^-1的6-苄氨基腺嘌呤和0.2mg L^-1的α-萘乙酸的MS培养基中，6-苄氨基腺嘌呤和α-萘乙酸均在高压灭菌前加入；然后于22-25℃，光照强度1000～2000lux，光照时间8～12小时条件下培养3-5周，小鳞茎上出现呈丛状的不定芽。

6.根据权利要求5所述东方百合的繁殖方法，其特征在于，所述的不定芽的诱导生根，具体为：将诱导出的呈丛状的不定芽分割为单株，然后转入生根培养基中，生根培养基采用低盐培养基即是将MS培养中的元素减半，具体生根培养为在加入了0.1mg L^-1α-萘乙酸和0.01mg L^-1吲哚丁酸中1/2MS培养基中放置12-16天即可生根。

7.根据权利要求6所述东方百合的繁殖方法，其特征在于，所述的组培苗的炼苗和移栽直至形成苗，具体为：将装有组培苗即诱导生根后的不定芽的组培瓶打开一个缝隙，置于温室大棚中进行炼苗，并向组培瓶中倒入无菌水以防止植株失水，控制湿度在75-85％，避免强光直射，炼苗6-8天；6-8天后将苗取出，用无菌水冲掉粘在苗上的培养基后，分别移入经高压灭菌锅灭菌的珍珠岩和蛭石体积之比为1:1的基质中，保持75％的湿度，50％的自然光照，8-12天喷一次稀释10倍的MS营养液，培养成幼苗。