CN106134995B - 一种双层包埋的诸葛菜人工种子制作方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种双层包埋的诸葛菜人工种子制作方法，属于生物技术和农业工程领域，本发明所述的方法包括诸葛菜的芽簇诱导、芽繁培养和芽的包埋和人工种子胶囊制备，所述芽的包埋和人工种子胶囊制备过程中内种皮包埋液是含纳米二氧化钛nTiO2、NAA、MS培养基和蔗糖的质量浓度为6％海藻酸钠水溶胶、外种皮包埋液是含有纳米二氧化钛nTiO2、纳米二氧化硅nSiO2的质量浓度为7％或8％海藻酸钠水溶胶。本发明制作的人工种子，可以通过双层包埋技术将杀菌剂和营养物质分离，同时调节内外种皮机械强度；该人工种子在有菌环境下具有生根发芽率高，污染率低，对外植体毒害作用低等特点；利用双层包埋技术可以进一步将诸葛菜人工种子制作技术推向实际生产应用。

Description

一种双层包埋的诸葛菜人工种子制作方法
技术领域
本发明属于生物技术和农业工程领域，具体涉及一种双层包埋的诸葛菜人工种子制作方法。
背景技术
诸葛菜又称二月兰，十字花科诸葛菜属植物，一年或二年生草本，广泛分布于全国大部分地区，耐寒、耐旱、耐阴，病虫害少。花呈紫色或白色，生活史从每年9月至次年6月，甚至在寒冷冬季仍可保绿不枯，可以较好地覆盖地面，是北方地区不可多得的早春观花，冬季观绿的地被植物，因此深受人们喜欢。诸葛菜种子的脂肪酸组成中，芥酸、亚麻酸含量低，棕榈酸、油酸和亚油酸的含量为总脂肪的89.8％，即诸葛菜为高亚油酸低芥酸种质，其种子油是品质优良的食用油，尤其适合心血管病患者食用。近年来诸葛菜在组织培养、体细胞杂交等方面的研究多有进展，诸葛菜人工种子技术也颇有进展，现在已经建立了一套较为完整的诸葛菜人工种子制作方法，但距离实际应用还有一定距离。
根据人工种皮材料的不同，人工种子有不同的包埋方式。Kitto等试验了8种水溶性树脂，认为聚氧乙烯可作为内种皮；Redenbaugh(1986)试验了26中水凝胶最终确定用海藻酸钠制作的人工种子萌发率最高，由此开启了用海藻酸钠制作人工种皮的体系。现在的研究者普遍通过海藻酸钠与氯化钙络合反应制作人工种子，通过在海藻酸钠中加入不同添加剂改变人工种皮各种属性。
目前单层包埋人工种子技术已取得一定进展，添加了纳米二氧化钛的单层包埋诸葛菜人工种子可以在有菌环境中萌发，但抗菌能力不够强、萌发率不高等问题仍然制约着人工种子技术的发展。单层包埋技术是将一切营养物质和杀菌剂加入同一层种皮，这种做法既增加了外界微生物与营养物质的接触，也使得繁殖体完全包裹在有害的杀菌剂中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种双层包埋的诸葛菜人工种子制作方法，制作出来的诸葛菜人工种子具有较高的抗菌能力、萌发率和生根率。
本发明采用具体技术方案为：
一种双层包埋的诸葛菜人工种子制作方法，包括步骤：
步骤(1)，诸葛菜的芽簇诱导：取诸葛菜幼苗,无菌水冲洗，切取腋芽和顶芽，消毒后进行芽簇诱导培养；
步骤(2)，诸葛菜的芽繁培养：取步骤(1)芽诱导培养的诸葛菜组培苗，切取幼芽，转接到芽繁培养基上进行芽繁培养；
步骤(3)，诸葛菜芽的包埋和人工种子胶囊制备：取步骤(2)中在芽繁培养基上生长的幼芽，切取若干个一定长度的芽并逐个放在内种皮包埋液表面，所述内种皮包埋液是含纳米二氧化钛nTiO2、NAA、MS培养基和蔗糖的质量浓度为6％海藻酸钠水溶胶；用玻璃吸管先吸取少量包埋液，再吸入一个诸葛菜芽，然后滴入质量浓度为2％的CaCl2溶液中，络合反应9-11min形成固态人工种子；用镊子取出所述固态人工种子，放在外种皮包埋液中，使外种皮均匀裹上一层包埋液，所述外种皮包埋液是含有纳米二氧化钛nTiO2、纳米二氧化硅nSiO2的质量浓度为7％或8％海藻酸钠水溶胶；用镊子将人工种子取出，放入质量浓度为2％的CaCl2溶液中，络合反应1.5-2.5min形成双层包埋的固态人工种子。
进一步，所述步骤(1)中的芽簇诱导培养基的成分包括：MS培养基、2mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、3％蔗糖、0.65％琼脂；芽簇诱导过程的光照强度为2000～3000Lux日光灯照射12小时。
进一步，所述步骤(2)中的芽繁培养基的成分包括：MS培养基、2.5mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、3％蔗糖、0.65％琼脂；芽繁培养的光照强度为2000～3000Lux日光灯照射12小时。
进一步，所述步骤(3)中幼芽在芽繁培养基中的生长时间为30天；切取若干个芽的长度为8mm。
进一步，所述步骤(3)中内种皮包埋液的成分包括：质量浓度为6％海藻酸钠水溶胶、0.25-0.3mg/L NAA、10-15g/L nTiO2、1/2MS培养基、3％蔗糖；外种皮包埋液的成分包括：质量浓度为7-8％海藻酸钠水溶胶、30-40g/L nTiO2、15-30g/L nSiO2。
进一步，所述nTiO2为锐钛型纳米TiO2，其粒径为15±5nm；所述nSiO2粒径为15±5nm；
进一步，所述内种皮包埋液中NAA为0.25mg/L，nTiO2为15g/L；所述外种皮包埋液中nTiO2为30g/L，nSiO2为15g/L，海藻酸钠质量浓度为7％。
本发明的有益效果是：
1.因添加纳米二氧化钛，常规的海藻酸钠(质量浓度小于5％)难以使诸葛菜人工种子固化形成胶囊，本发明根据纳米二氧化钛的浓度调节海藻酸钠浓度，选择6％海藻酸钠浓度水溶胶作为内种皮包埋液，7-8％海藻酸钠浓度水溶胶作为内种皮包埋液，解决了诸葛菜人工种子难以固化的问题。
2.本发明生产的人工种子具有很好的抗菌效果，完全可用于有菌环境下播种，与单层包埋的诸葛菜人工种子相比具有明显优势；可显著提高种子的萌发率和生根率，对植株毒害作用较小，为诸葛菜人工种子从实验室走进大田提供了技术支持。
3.本发明开展了内种皮不同配比的NAA和纳米TiO2、外种皮不同配比的纳米TiO2和纳米SiO2对诸葛菜人工种子萌发、生根和抗菌能力影响的实验；内外种皮的最佳组合，实现了纳米二氧化钛的抗菌和促萌、促生能力和纳米二氧化硅的强化种皮机械强度能力的完美结合。
4.本发明通过将不同成分按不同比例分别加入内外种皮包埋液中，使各成分的优势得以彰显，劣势得以避免，从而使诸葛菜人工种子可以在有菌环境中生根发芽，为人工种子技术进一步走向实际应用提供技术支持。
5.实现内外种皮的双层包埋的人工种子更接近自然界的种子，为种子的形成和萌发研究提供生物学模型。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。
本发明的实施例中，一种双层包埋的诸葛菜人工种子制作方法，包括以下步骤：
步骤1，诸葛菜的芽簇诱导：取诸葛菜幼苗,无菌水冲洗3分钟，切取腋芽和顶芽，在超净工作台上完成消毒,无菌接种在芽簇诱导培养基上进行芽簇诱导培养；芽簇诱导培养基的成分包括：MS培养基、2mg/L 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)、0.2mg/L NAA(α-萘乙酸)、3％蔗糖、0.65％琼脂；芽诱导过程的光照强度2000～3000Lux日光灯照射12小时。
步骤2，诸葛菜的芽繁培养：取步骤1芽簇诱导培养的诸葛菜组培苗，切取幼芽，转接到芽繁培养基上进行芽繁培养；芽繁培养基的成分包括：MS培养基、2.5mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、3％蔗糖及0.65％琼脂；芽繁培养的光照强度为2000～3000Lux日光灯照射12小时。
步骤3，诸葛菜芽的双层包埋和人工种子胶囊制备：取步骤2中在芽繁培养基上生长30天的幼芽，切取若干个8mm的芽，并逐个放在内种皮包埋液表面，内种皮包埋液是含15g/L锐钛型纳米二氧化钛nTiO2(粒径为15±5nm)、0.25mg/L NAA、1/2MS培养基和3％蔗糖的质量浓度为6％海藻酸钠S.A水溶胶；用玻璃吸管先吸取少量包埋液，再吸入一个诸葛菜芽，然后滴入质量浓度为2％的CaCl2溶液中，络合反应10min形成固态人工种子；用镊子取出所述固态人工种子，放在外种皮包埋液中，使外种皮均匀裹上一层包埋液，外种皮包埋液是含有30g/L锐钛型纳米二氧化钛nTiO2(粒径为15±5nm)、15g/L纳米二氧化硅nSiO2(粒径为15±5nm)的质量浓度为7％海藻酸钠S.A水溶胶；用镊子将人工种子取出，放入质量浓度为2％的CaCl2溶液中，络合反应2min形成双层包埋的固态人工种子，于无菌水中清洗并吸干表面水分即可。
上述步骤1、步骤2和步骤3中的MS培养基是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的培养基，包括：大量元素：NH4NO3为1650mg/L、KNO3为1900mg/L、CaCl2·2H2O为440mg/L、MgSO4·7H2O为370mg/L、KH2PO4为170mg/L；微量元素：KI为0.83mg/L、H3BO3为6.2mg/L、MnSO4·4H2O为22.3mg/L、ZnSO4·7H2O为8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O为0.25mg/L、CuSO4·5H2O为0.025mg/L、CoCl2·6H2O为0.025mg/L；铁盐：FeSO4·7H2O为27.8mg/L、Na2-EDTA·2H2O为37.3mg/L；有机物质：肌醇为100mg/L烟酸为0.5mg/L、盐酸吡哆醇(维生素B6)为0.5mg/L、盐酸硫胺素(维生素B1)为0.1mg/L、甘氨酸为2.0mg/L。
下面根据本发明制作的诸葛菜人工种子进行有菌萌发实验，验证本发明制作的诸葛菜人工种子的萌发、生根和抗菌能力。
调节内外种皮包埋液成分的配比，进行诸葛菜人工种子的有菌萌发实验。
实验组设置如表1所示，根据本发明的制作方法制作诸葛菜人工种子，在珍珠岩上进行有菌萌发实验，实验结果见表2。
表1双层包埋诸葛菜人工种子有菌萌发实验组
表2双层包埋诸葛菜人工种子有菌萌发实验结果
从表2可看出，12个实验组中萌发率、生根率和污染率综合表现较好的是A8组，内种皮包埋液成分为6％S.A+15g/L nTiO2+0.25mg/L NAA，外种皮包埋液成分为7％S.A+30g/L nTiO2+15g/Ln SiO2，萌发率为91.7％，生根率为75％，30d污染率仅为25％。
以上对本发明所提供的一种双层包埋的诸葛菜人工种子制作方法进行了详细介绍，本文应用了具体个例对本发明的原理和实施方式进行了阐述，所要说明的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种双层包埋的诸葛菜人工种子制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)，诸葛菜的芽簇诱导：取诸葛菜幼苗,无菌水冲洗，切取腋芽和顶芽，消毒后接种在芽簇诱导培养基上进行芽簇诱导培养；
步骤(2)，诸葛菜的芽繁培养：取步骤(1)芽诱导培养的诸葛菜组培苗，切取幼芽，转接到芽繁培养基上进行芽繁培养；
步骤(3)，诸葛菜芽的包埋和人工种子胶囊制备：取步骤(2)中在芽繁培养基上生长的幼芽，切取若干个一定长度的芽并逐个放在内种皮包埋液表面，所述内种皮包埋液是含纳米二氧化钛nTiO2、NAA、MS培养基和蔗糖的质量浓度为6％海藻酸钠水溶胶；用玻璃吸管先吸取少量包埋液，再吸入一个诸葛菜芽，然后滴入质量浓度为2％的CaCl2溶液中，络合反应9-11min形成固态人工种子；用镊子取出所述固态人工种子，放在外种皮包埋液中，使外种皮均匀裹上一层包埋液，所述外种皮包埋液是含有纳米二氧化钛nTiO2、纳米二氧化硅nSiO2的质量浓度为7％或8％海藻酸钠水溶胶；用镊子将人工种子取出，放入质量浓度为2％的CaCl2溶液中，络合反应1.5-2.5min形成双层包埋的固态人工种子。
2.根据权利要求1所述的一种双层包埋的诸葛菜人工种子制作方法，其特征在于，所述步骤(1)中的芽簇诱导培养基的成分包括：MS培养基、2mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、3％蔗糖及0.65％琼脂；芽簇诱导过程的光照强度为2000～3000Lux日光灯照射12小时。
3.根据权利要求1所述的一种双层包埋的诸葛菜人工种子制作方法，其特征在于，所述步骤(2)中的芽繁培养基的成分包括：MS培养基、2.5mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、3％蔗糖及0.65％琼脂；芽繁培养的光照强度为2000～3000Lux日光灯照射12小时。
4.根据权利要求1所述的一种双层包埋的诸葛菜人工种子制作方法，其特征在于，所述步骤(3)中幼芽在芽繁培养基中的生长时间为30天；切取若干个芽的长度为8mm。
5.根据权利要求1所述的一种双层包埋的诸葛菜人工种子制作方法，其特征在于，所述步骤(3)中内种皮包埋液的成分包括：质量浓度为6％海藻酸钠水溶胶、0.25-0.3mg/L NAA、10-15g/L nTiO2、1/2MS培养基、3％蔗糖；外种皮包埋液的成分包括：质量浓度为7％或8％海藻酸钠水溶胶、30-40g/L nTiO2、15-30g/L nSiO2。
6.根据权利要求5所述的一种双层包埋的诸葛菜人工种子制作方法，其特征在于，所述nTiO2为锐钛型纳米TiO2，其粒径为15±5nm；所述nSiO2粒径为15±5nm。
7.根据权利要求5所述的一种双层包埋的诸葛菜人工种子制作方法，其特征在于，所述内种皮包埋液中NAA为0.25mg/L，nTiO2为15g/L；所述外种皮包埋液中nTiO2为30g/L，nSiO2为15g/L，海藻酸钠质量浓度为7％。
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