CN104737902A - 铁皮石斛纳米人工种子及其制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种铁皮石斛纳米人工种子及其制作方法，所述制作方法包括铁皮石斛原球茎的诱导与增殖、人工种子的制作与萌发。本发明将纳米技术与细胞工程技术相结合，利用其制作铁皮石斛人工种子的复合胚乳和人工种皮，既能改善传统包埋的透气性、保水性，又能促进原球茎生长，从而提高了人工种子的萌发率和成苗率，为铁皮石斛种质繁育实用化和产业化发展提供技术支持。

Description

铁皮石斛纳米人工种子及其制作方法

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，特别是涉及一种铁皮石斛纳米人工种子及其制作方法。

背景技术

铁皮石斛(Dendrobium officinal Kimura et Migo)为兰科石斛属多年生附生型草本植物，因其茎节处呈黑褐色，亦名黑节草。铁皮石斛为我国传统的名贵中草药，《中华人民共和国药典》2010版收录石斛来源于石斛属3种植物，将铁皮石斛单列，具有养胃生津、滋阴清热、润肺止咳等功效。现代药理研究表明，铁皮石斛含有多糖、生物碱、氨基酸等成分，具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、扩张血管及抗血小板凝集等作用，因此在临床及中药复方中被广泛应用。铁皮石斛在我国主要分布于云南、贵州、广东、广西、浙江、四川等地，其是一种生长缓慢、自身繁殖能力极低的兰科附生植物，且十分娇嫩，遇强光、直射光或暴雨、雪冻即死亡，水分过多也会使其根部腐烂，甚至整株死亡。由于铁皮石斛对生长环境的要求较高，且受到自身繁殖方式的限制及近年来过度采挖野生药材和整体生态环境的不断破坏，野生铁皮石斛资源已接近枯竭。

铁皮石斛的种子细如粉末，又缺乏胚乳营养，自然条件下必须飘落在非常适宜的环境与某些真菌共生才能萌发，很难用实生苗栽培；而传统的分株、扦插等方式的繁殖率极低。鉴于铁皮石斛的重要价值，从20世纪70年代起科研人员就开始对铁皮石斛人工栽培技术进行了研究，以便从根本上解决资源问题，因此发展铁皮石斛良种繁育和人工栽培成为保护和利用铁皮石斛资源的必然之路。

人工种子技术的诞生为珍稀紧缺的铁皮石斛药材产业化提供了一条新的途径，其本质为无性繁殖，与试管苗相比，人工种子使得无菌生长的原球茎可以直接播入土壤，繁殖速度快，从而减少了移栽驯化过程，且可大大降低试管苗培育和移栽驯化中的风险。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种铁皮石斛纳米人工种子及其制作方法。

解决上述技术问题的具体技术方案如下：

一种铁皮石斛纳米人工种子的制作方法，包括如下步骤：

（1）原球茎的诱导：

选取成熟未开裂的铁皮石斛蒴果，分别用清洁剂、自来水清洗，再于超净工作台中经体积分数为75%的酒精消毒、无菌水清洗、0.1%升汞水溶液浸泡、无菌水清洗后，吸干表面水分，切开，将种子均匀散布在种子萌发培养基上，于培养室内进行培养，即得原球茎；

（2）原球茎的增殖：

选取步骤（1）中所得的原球茎，接种于MS+（1-2mg/L）KT增殖培养基中进行培养，每30d转瓶一次；所述培养的条件为：温度24℃-26℃，光照12h/d，光照强度1500～2000lx；

（3）人工种子的制作：

以MS+1.8-2.2mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+1.5wt%木薯淀粉+0.1wt%保水剂+4.8-5.2wt%纳米TiO₂光半导体溶胶+2wt%蔗糖+2wt%CaCl₂+1.8-2.2wt%羧甲基纤维素钠为人工胚乳，以MS+1.8-2.2mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+1.5wt%木薯淀粉+0.1wt%保水剂+4.8-5.2wt%纳米TiO₂光半导体溶胶+2wt%蔗糖+1.3-1.7wt%海藻酸钠为人工种皮基质，将原球茎与人工胚乳混匀，再用口径为5mm的滴管吸起，滴到人工种皮基质中，震荡8-12min，无菌去离子水冲洗，得球体；将所述球体用2wt%的CaCl₂溶液固化18-22min，冲洗，于表面喷涂纳米TiO₂光半导体溶胶，吹干，即得人工种子。若羧甲基纤维素钠的浓度为3.0wt%时，其非常粘稠，在实际应用中难于操作，且由于包裹层较厚而粘稠，反而降低了人工种子的萌发率和成苗率。

在其中一些实施例中，步骤（3）中所述人工胚乳为：MS+2mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+1.5wt%木薯淀粉+0.1wt%保水剂+5wt%纳米TiO₂光半导体溶胶+2wt%蔗糖+2wt%CaCl₂+2wt%羧甲基纤维素钠。

在其中一些实施例中，步骤（3）中所述人工种皮基质为：MS+2mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+1.5wt%木薯淀粉+0.1wt%保水剂+5wt%纳米TiO₂光半导体溶胶+2wt%蔗糖+1.5wt%海藻酸钠。

在其中一些实施例中，步骤（1）中所述酒精消毒的时间为28-32s。

在其中一些实施例中，步骤（1）中所述0.1%升汞水溶液浸泡的时间为13-17min。

在其中一些实施例中，还包括步骤（4）人工种子的萌发：将步骤（3）制得的人工种子于萌发基质进行萌发。

在其中一些实施例中，所述萌发基质为：纯琼脂培养基或MS培养基。

在其中一些实施例中，所述萌发基质为：纯琼脂培养基。

根据上述制作方法制得的铁皮石斛纳米人工种子。

在其中一些实施例中，所述人工种子的直径为6.5-7.5mm，人工种皮的厚度为0.2-0.3mm。

本发明所述一种铁皮石斛纳米人工种子及其制作方法具有以下优点和有益效果：

（1）本发明所述制作方法将纳米技术和细胞工程技术相结合，制得铁皮石斛人工种子的复合胚乳和人工种皮，显著改善了传统包埋的透气性、保水性，又促进了原球茎生长，同时也显著提高了人工种子的萌发率和成苗率，该制作方法工艺流程简单、材料容易获得、不受季节影响、繁殖周期短、成本低廉，可有效解决铁皮石斛野生资源日益枯竭的问题，为铁皮石斛人工种子实用化和产业化发展提供技术支持，可通过规模化应用快速繁育铁皮石斛种质。

（2）本发明所述制备方法，经发明人大量的实验，确定人工胚乳中羧甲基纤维素钠和人工种皮基质中的海藻酸钠的含量，得出其制得的人工种子有较高的萌发率和成苗率；且得出人工胚乳中羧甲基纤维素钠的含量大于人工种皮基质中的海藻酸钠的含量，即存在浓度差，可使得包裹原球茎的人工胚乳的液滴，完全浸没在人工种皮基质中，确保由里向外络合时形成的人工种皮的完整性。

（3）本发明所制得的人工种子在自然环境下具有较高的萌发率和成苗率。

（4）本发明所制得的人工种子呈半透明，在离子交换时可看到包裹在里面的原球茎，以确保每粒人工种子中包裹一个原球茎。

具体实施方式

本发明所制得的人工种子核心为液体和表面为海藻酸钙膜；其中，海藻酸钙膜的厚度一般为0.2-0.3mm，该厚度可通过改变离子交换的时间进行适当的调整。

本发明所述MS即MS培养基，其配方为：按1000mL培养基计，硝酸钾(KNO₃)1900mg/L、硝酸铵(NH₄NO₃)1650mg/L、硫酸镁(MgSO₄.7H₂O)370mg/L、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)170mg/L、氯化钙(CaCl₂.2H₂O)440mg/L、硫酸锰(MnSO₄.4H₂O)22.3mg/L、硫酸锌(ZnSO₄.4H₂O)8.6mg/L、硼酸(H₃BO₃)6.2mg/L、碘化钾(KI)0.83mg/L、钼酸钠(Na₂MoO₄.2H₂O)0.25mg/L、硫酸铜(CuSO₄.5H₂O)0.025mg/L、氯化钴(CoCl₂.6H₂O)0.025mg/L、硫酸亚铁(FeSO₄.7H₂O)27.8mg/L、Na₂-EDTA37.3mg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L；

所述KT为激动素；6-BA为6-苄氨基嘌呤；NAA为萘乙酸；

所述纳米TiO₂光半导体溶胶购自杭州万景高新材料有限公司；

所述成熟未开裂的铁皮石斛蒴果购自广东永生源生物科技有限公司。

以下将结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

一种铁皮石斛纳米人工种子的制作方法，包括如下步骤：

（1）原球茎的诱导：

选取成熟未开裂的铁皮石斛蒴果，分别用开米洗洁精清洗3-5min、自来水清洗5-8min，再于超净工作台中经体积分数为75%的酒精消毒30s、无菌水清洗2次、然后用0.1%升汞溶液浸泡摇动消毒15min、无菌水清洗4-5次后，无菌纸巾吸干表面水分，备用。在超净工作台上，将消毒过的蒴果用解剖刀对半切开，用镊子夹紧蒴果的一端轻轻抖动，将种子均匀散布在添加10%椰乳的MS培养基上，盖上瓶盖，于培养室内进行培养，即得原球茎；

（2）原球茎的增殖：

从步骤（1）中经诱导获得的原球茎选取大小基本一致的原球茎，接种于MS+1.5mg/L KT增殖培养基中进行培养，每30d转瓶一次；所述培养的条件为：温度24℃-26℃，光照12h/d，光照强度1500～2000lx；

（3）人工种子的制作：

以MS+2mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+1.5wt%木薯淀粉+0.1wt%保水剂+5wt%纳米TiO₂光半导体溶胶+2wt%蔗糖+2wt%CaCl₂+2wt%羧甲基纤维素钠为人工胚乳，以MS+2mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+1.5wt%木薯淀粉+0.1wt%保水剂+5wt%纳米TiO₂光半导体溶胶+2wt%蔗糖+1.5wt%海藻酸钠为人工种皮基质，将原球茎与50mL人工胚乳混匀，再用口径为5mm的滴管吸起含有原球茎的人工胚乳，滴到100mL人工种皮基质中，进行离子交换10min，在这过程中需不断震荡，无菌去离子水冲洗2遍，洗掉未交换的人工种皮基质，防止人工种子互相粘附，最后，将包裹完成的球状体用2wt%的CaCl₂溶液固化18-22min，取出，用无菌水冲洗2遍，于表面喷涂纳米TiO₂光半导体溶胶，置于超净台上吹干表面，即得人工种子。

本实施例所制得的人工种子由核心为液体、表面为海藻酸钙膜组成；海藻酸钙膜（即种皮）的厚度一般为0.2-0.3mm，该厚度可通过改变离子交换的时间进行适当的调整。

将上述制得的人工种子于萌发基质中进行萌发，所述萌发基质为：纯琼脂培养基或自然环境下培养。

实施例2人工种子的萌发率和成苗率评价

一、实验目的

通过对比分析，评价实施例1制得的人工种子的萌发率和成苗率。

二、实验方法

以萌发率和成苗率作为考察人工种子的指标（通常人工种子考核萌发率，但成苗率才是决定人工种子制作是否成功的关键指标）。

（1）比较不同制作方法对人工种子的外观、萌发率和成苗率的影响

本实验设置实验组、对比例1和对比例2，具体如下：

实验组：实施例1；

对比例1：采用海藻酸钙球法制得的人工种子；

对比例2：采用常规中空海藻酸钙球法制得的人工种子；

对比例3：具体制作方法与实施例1基本相同，区别在于人工胚乳和人工种皮中添加纳米TiO₂粉末。

（2）比较不同萌发基质对人工种子萌发率和成苗率的影响

将实施例1制得的人工种子分别于纯琼脂培养基、MS培养基、自然环境下的混合基质进行培养，比较不同萌发基质对人工种子萌发率和成苗率的影响。

上述萌发率和成苗率的计算方法为：

萌发率（%）=（萌发数/播种数）×100%，

成苗率（%）=（成苗数/播种数)×100%，

萌发标准为突破种皮2mm，成苗转化以萌发的整株幼苗完全突破种皮，并能在琼脂胶或其他基质中成活为标准。

其中，对比例1中人工种子的制作方法，包括以下步骤：

（1）原球茎的诱导和增殖：参见实施例1；

（2）人工种子的制作：

以MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+1.0%活性炭+3%海藻酸钠+2%木薯淀粉+0.1%保水剂为基本人工胚乳，加入1～3%纳米TiO₂粉末混合，用玻璃棒搅匀；用口径约为5mm的滴管将含有原球茎的人工胚乳吸起滴入100ml的2%CaCl₂溶液中进行离子交换，形成具有一定硬度的人工种子，然后吸去多余的CaCl₂溶液，再用无菌重蒸水冲洗2次；

（3）人工种子的萌发：将上述制得的人工种子于萌发基质中进行萌发，所述萌发基质为：纯琼脂培养基或自然环境下培养。

对比例2中人工种子的制作方法，包括以下步骤：

（1）原球茎的诱导和增殖：参见实施例1；

（2）人工种子的制作：将MS+2.0mg/L BA+0.5mg/L NAA+1.0%活性炭+2%木薯淀粉+0.1%保水剂+1～3%纳米TiO₂，与50ml含有2%CaCl₂的3%羧甲基纤维素钠溶液混合搅匀；用口径约为5mm的滴管将含有原球茎的3%羧甲基纤维素钠溶液吸起滴入100ml的3%海藻酸钠溶液中进行离子交换，在这过程中不断振荡海藻酸钠溶液，然后用无菌重蒸水冲洗2次，洗掉未交换的海藻酸钠溶液，再用100ml的2%CaCl₂固化20min，用无菌重蒸水冲洗2次，即可获得铁皮石斛人工种子。

（3）人工种子的萌发：将上述制得的人工种子于萌发基质中进行萌发，所述萌发基质为：纯琼脂培养基或自然环境下培养。

三、实验结果

1、比较不同制作方法制得的人工种子的外观形态

（1）通过对比实施例1和对比例1制得的人工种子可知，两种包裹方法制得的人工种子外观形态上存在显著差异，对比例1制得的人工种子平均直径为6.0±0.5mm，且大多数人工种子呈现蝌蚪状的尾巴；而实施例1制得的人工种子为半透明状，直径平均为7.0±0.5mm，形状比较圆、一般不形成蝌蚪状的尾巴。

（2）通过对比实施例1和对比例1制得的人工种子可知，两种包裹方法制得的人工种子的种皮厚度不同，实施例1种皮厚度为0.2-0.3mm，对比例1为0.4-0.5mm。

2、不同制作方法和不同培养基质对人工种子的萌发率和成苗率的影响

两种不同的包裹方法和不同培养基质对人工种子萌发率和成苗率具有较大的影响，结果参见表1：

表1不同包埋制作方法对人工种子萌发率和成苗率的影响

从表1可知，在纯琼脂培养基或自然条件下的混合基质中，采用实施例1所述制作方法制得的人工种子，其萌发率和成苗率均显著高于对比例1-3所述制作方法制得的人工种子。

通常人工种子的萌发基质一般为MS或1/2MS培养基，原球茎萌发突破种皮后，即可吸收MS培养基中的营养，因此，不管人工种子包裹的好坏，萌发后成活率和成苗率都非常高，甚至包裹层薄的人工种子萌发和成苗率反而更高，但在实际的生产应用中，这种人工种子的成苗率却极低。而采用纯琼脂培养基和复合基质作为萌发基质，人工胚乳中的养分对原球茎萌发和成苗就非常重要，因此，人工种皮包裹层厚度、人工胚乳养分均应比较合适并且泄露率低才能有高的萌发率和成苗率。而实施例1所制得的人工种子在纯琼脂培养基和复合基质上萌发率和成苗率均较高，其实用性更强，更易于在生产中推广应用。

另外，从表1中还可得出：实施例1（纯琼脂培养基）制得的人工种子的萌发率和成苗率显著高于对比例3制得的人工种子的萌发率和成苗率，这是由于实施例1中人工胚乳和人工种皮中添加纳米TiO₂光半导体溶胶，其显著缩短了人工种子的萌发时间，提高了萌发率和成苗率。具体来说，在人工胚乳和人工种皮中添加一定量的纳米TiO₂光半导体溶胶，不仅可以提高成苗率，而且小苗长势好，这是纳米TiO₂光半导体溶胶具有一定的抗菌性能，人工种子在萌发过程中不易腐烂，另外，发明人研究发现在自然环境下的复合基质中成苗率有了突破，最高可达35.0%（传统滴注法制作的人工种子在自然条件下萌发率低，成苗率几乎为零）。该方法制作的人工种子可以初步应用于生产，而不是仅停留在实验室阶段，这为人工种子应用奠定良好的基础；人工胚乳中添加TiO₂光半导体溶胶提高了人工种子的萌发速度，90%以上的人工种子7d后已突破种皮，缩短了萌发时间，萌发率也明显高于对照组。原因可能是纳米TiO₂光半导体溶胶表现出的独特的空间效应，改善了致密的种皮结构，或者是种子将Ti做为一种营养元素被吸收，提供种苗发育和成长营养物质的需要。大量试验结果表明钛结构具有生物学特异性并且对植物生长发育有益，纳米溶胶结构的TiO₂赋予植物表皮细胞壁一定的物理刚性，改善光截获能力，提高光合效率，从而促进人工种子萌发及生长。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种铁皮石斛纳米人工种子的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）原球茎的诱导：

选取成熟未开裂的铁皮石斛蒴果，分别用清洁剂、自来水清洗，再于超净工作台中经体积分数为75%的酒精消毒、无菌水清洗、0.1%升汞水溶液浸泡、无菌水清洗后，吸干表面水分，切开，将种子均匀散布在种子萌发培养基上，于培养室内进行培养，即得原球茎；

（2）原球茎的增殖：

选取步骤（1）中所得的原球茎，接种于MS+（1-2mg/L）KT增殖培养基中进行培养，每30d转瓶一次；所述培养的条件为：温度24℃-26℃，光照12h/d，光照强度1500～2000lx；

（3）人工种子的制作：

以MS+1.8-2.2mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+1.5wt%木薯淀粉+0.1wt%保水剂+4.8-5.2wt%纳米TiO₂光半导体溶胶+2wt%蔗糖+2wt%CaCl₂+1.8-2.2wt%羧甲基纤维素钠为人工胚乳，以MS+1.8-2.2mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+1.5wt%木薯淀粉+0.1wt%保水剂+4.8-5.2wt%纳米TiO₂光半导体溶胶+2wt%蔗糖+1.3-1.7wt%海藻酸钠为人工种皮基质，将原球茎与人工胚乳混匀，再用口径为5mm的滴管吸起，滴到人工种皮基质中，震荡8-12min，无菌去离子水冲洗，得球体；将所述球体用2wt%的CaCl₂溶液固化18-22min，冲洗，于表面喷涂纳米TiO₂光半导体溶胶，吹干表面，即得人工种子。

2.根据权利要求1所述的铁皮石斛纳米人工种子的制作方法，其特征在于，步骤（3）中所述人工胚乳为：MS+2mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+1.5wt%木薯淀粉+0.1wt%保水剂+5wt%纳米TiO₂光半导体溶胶+2wt%蔗糖+2wt%CaCl₂+2wt%羧甲基纤维素钠。

3.根据权利要求1所述的铁皮石斛纳米人工种子的制作方法，其特征在于，步骤（3）中所述人工种皮基质为：MS+2mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+1.5wt%木薯淀粉+0.1wt%保水剂+5wt%纳米TiO₂光半导体溶胶+2wt%蔗糖+1.5wt%海藻酸钠。

4.根据权利要求1所述的铁皮石斛纳米人工种子的制作方法，其特征在于，步骤（1）中所述酒精消毒的时间为28-32s。

5.根据权利要求1所述的铁皮石斛纳米人工种子的制作方法，其特征在于，步骤（1）中所述0.1%升汞水溶液浸泡的时间为13-17min。

6.根据权利要求1-5任一项所述的铁皮石斛纳米人工种子的制作方法，其特征在于，还包括步骤（4）人工种子的萌发：将步骤（3）制得的人工种子于萌发基质进行萌发。

7.根据权利要求6所述的铁皮石斛纳米人工种子的制作方法，其特征在于，所述萌发基质为：纯琼脂培养基或MS培养基。

8.根据权利要求7所述的铁皮石斛纳米人工种子的制作方法，其特征在于，所述萌发基质为：纯琼脂培养基。

9.一种根据权利要求1-8任一项所述制作方法制得的铁皮石斛纳米人工种子。

10.根据权利要求9所述的铁皮石斛纳米人工种子，其特征在于，所述人工种子的直径为6.5-7.5mm，人工种皮的厚度为0.2-0.3mm。