CN102893865A - 铁皮石斛人工种子的制作和贮藏方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了铁皮石斛人工种子的制作和贮藏方法，包括以下步骤：(1)原球茎的诱导；(2)原球茎的液体悬浮培养增殖；(3)人工种子的制作；(4)人工种子的贮藏；与现有技术相比，本发明以液体悬浮培养(1/2MS培养基)增殖铁皮石斛原球茎，增殖效率较现有发明的固体培养基(MS培养基)增殖培养有显著提高，为人工种子生产提供了大量优质的人工种胚；本发明以海藻酸钠和硝酸钙溶液离子交换固化形成人工种皮，与现有发明的海藻酸钠和氯化钙溶液反应相比，制成的人工种子形状更规则、营养物质泄漏率较低；人工种子贮藏寿命延长，且发芽率较高。

Description

铁皮石斛人工种子的制作和贮藏方法

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种铁皮石斛人工种子的制作和贮藏方法。

背景技术

铁皮石斛(Dendrobium candicum Wall.ex Lindl.)，又名黑节草，为兰科多年附生草本植物。铁皮石斛具有重要的药用价值，始载于东汉《神农本草经》，以鲜茎或干燥茎入药，具益胃生津、滋阴清热之效；道家医学典籍《道藏》将其列为“九大仙草”之首，民间将其奉为“救命仙草”；《中华人民共和国药典》记载其可用于阴伤津亏，口干烦渴，胃阴不足，食少干呕，病后虚热不退，阴虚火旺，骨蒸劳热，目暗不明，筋骨痿软。现代药理学分析铁皮石斛具有增强机体免疫力、抗肿瘤、降血糖、抗氧化等作用，是许多中成药和保健品的重要原料。

铁皮石斛对生长环境要求特殊，加之长期无节制的采挖，导致其野生资源日益减少，濒临枯竭，已被列为中国珍稀濒危二级保护植物。铁皮石斛的种子细小，缺乏胚乳，且需与兰菌共生才能萌发，因此其自然繁殖率极低，难以满足大规模人工栽培的需要。传统的分株、扦插等繁殖方式繁殖率也较低。利用组织培养技术虽然能在一定程度上解决快速繁殖的难题，但是依然存在试管苗转接次数多、生产周期长、成本高、移栽成活率低且贮藏和运输不便等问题，同样限制了铁皮石斛的大规模生产。

人工种子技术可以将无菌生长的原球茎经过包埋之后直接播入土壤，为铁皮石斛的生产提供了一条新的途径。与试管苗相比，人工种子减少了生根和驯化移栽的过程，缩短了生产周期，大大降低了生产成本。但是铁皮石斛人工种子的研究刚刚起步，还存在着发芽率低、贮藏时间短和田间成苗率低等亟待解决的问题。

中国专利申请号200910193294.3，一种铁皮石斛人工种子的制作方法，提供了一种铁皮石斛人工种子的制作方法，但其增殖效率较低，生产成本较高，人工种子贮藏寿命短，且发芽率萌发率较低。

发明内容

本发明所要解决的主要问题是珍稀药用植物铁皮石斛的人工种子制作和贮藏技术，旨在利用现代生物技术有效缓解铁皮石斛野生资源濒临枯竭和大规模人工栽培种苗短缺的局面，充分满足人类生活中对铁皮石斛的需求。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

铁皮石斛人工种子的制作和贮藏方法，包括以下步骤：

(1)原球茎的诱导

将铁皮石斛成熟但尚未开裂的蒴果在自来水下冲洗1-2h，放入超净工作台中，先用75％酒精浸泡0.5-1min，无菌水冲洗3-5次，再用0.1％氯化汞溶液浸泡8-10min，无菌水冲洗3-5次，置于无菌滤纸上吸干表面水分，用解剖刀将蒴果切开，将蒴果内种子均匀撒播在原球茎诱导培养基上，置于25℃人工气候箱中，先进行5d黑暗培养，然后转入光照培养，光照强度为2000lx，每日光照时间为16h，培养15d后种子萌发形成绿色的原球茎；原球茎诱导培养基组成为MS+0.5mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+10％土豆汁+0.5％活性炭+0.7％琼脂，pH 5.8，培养基预先在121℃下高压灭菌15-20min；

(2)原球茎的液体悬浮培养增殖

将诱导获得的铁皮石斛原球茎接种于液体增殖培养基中进行悬浮培养，每瓶装培养基25-30ml，接种原球茎重量为1.5-2.0g，将培养瓶置于25℃恒温摇床上振荡培养，转速为80-100r/min，光照为自然漫射光，每培养15d更换一次培养液；

原球茎液体增殖培养基配方为1/2MS+0.5mg/L萘乙酸+2.0mg/L 6-苄氨基嘌呤+30g/L蔗糖+0.1-0.5g/L聚乙烯吡咯烷酮，pH 5.8，其中1/2MS为大量元素减半的MS基本培养基；

(3)人工种子的制作

以MS+0.5mg/L萘乙酸+2.5mg/L 6-苄氨基嘌呤+30g/L蔗糖+0.3-0.4wt％多菌灵+0.2wt％活性炭+20mg/L脱落酸为人工胚乳，在其中加入3-4wt％海藻酸钠熬制成半凝胶，经121℃高压灭菌20min后冷却备用，在超净工作台上，将经过30d液体悬浮增殖培养的大小为2-4mm的铁皮石斛原球茎均匀悬浮于半凝胶中，用内直径为4mm的滴管吸取半凝胶和原球茎滴入已灭菌冷却的50-150mmol/L硝酸钙溶液中，保证每滴半凝胶中只含有一颗原球茎，经过20-30min离子交换反应，倒去硝酸钙溶液，用无菌水漂洗3次即可得到人工种子；

(4)人工种子的贮藏

在超净工作台上，将制得的人工种子置于无菌滤纸上吸干表面水分，再将其放入已灭菌烘干的三角瓶中，用封口膜密封好后，放置在4℃冰箱中黑暗保存。

与现有技术相比，本发明存在以下有益效果：

1.本发明以液体悬浮培养(1/2MS培养基)增殖铁皮石斛原球茎，增殖效率较现有发明的固体培养基(MS培养基)增殖培养有显著提高，为人工种子生产提供了大量优质的人工种胚；

2.本发明以海藻酸钠和硝酸钙溶液离子交换固化形成人工种皮，与现有发明的海藻酸钠和氯化钙溶液反应相比，制成的人工种子形状更规则、营养物质泄漏率较低；

3.本发明在人工胚乳中添加多菌灵，而现有发明添加的是百菌清，与其相比较人工种子在有菌基质中有较高的萌发率；

4.本发明在人工胚乳中添加脱落酸并将人工种子置于4℃冰箱中保存，贮藏6个月后仍具有较高的萌发率，而现有发明未添加脱落酸并进行贮藏发芽试验。本发明发现随着贮藏时间的延长，不添加脱落酸的人工种子萌发率迅速降低，在贮藏5个月后种子萌发率降为0；添加20mg/L脱落酸的人工种子萌发率随贮藏时间延长降低较慢，贮藏6个月后萌发率仍可达45％。

5.本发明的原球茎诱导培养基组成为MS+0.5mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+10％wt土豆汁+0.5wt％活性炭+0.7wt％琼脂，而现有发明的种子萌发培养基以MS培养基为基本培养基，每升含椰子汁50-100ml，活性炭10g，蛋白胨1-2g，蔗糖20-30g，琼脂8-9g，pH值为5.4-5.6。本发明培养基中添加的土豆汁可以自己自作，比用椰子汁和蛋白胨成本低。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例一：铁皮石斛人工种子的制作和贮藏方法

1.原球茎的诱导

将铁皮石斛成熟但尚未开裂的蒴果在自来水下冲洗2h，放入超净工作台中，先用75％酒精浸泡0.5-1min，无菌水冲洗3-5次，再用0.1％氯化汞溶液浸泡8-10min，无菌水冲洗3-5次，置于无菌滤纸上吸干表面水分，用解剖刀将蒴果切开，将蒴果内种子均匀撒播在原球茎诱导培养基上，置于25℃人工气候箱中，先进行5d黑暗培养，然后转入光照培养，光照强度为2000lx，每日光照时间为16h，培养15d后种子萌发形成绿色的原球茎。原球茎诱导培养基组成为MS+0.5mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+10wt％土豆汁+0.5wt％活性炭+0.7wt％琼脂，pH 5.8，培养基预先在121℃下高压灭菌20min。

2.原球茎的液体悬浮培养增殖

将诱导获得的铁皮石斛原球茎接种于液体增殖培养基中进行悬浮培养，每瓶装培养基25-30ml，接种原球茎重量为1.5-2g，将培养瓶置于25℃恒温摇床上振荡培养，转速为80r/min，光照为自然漫射光，每培养15d更换一次培养液。原球茎液体增殖培养基配方为1/2MS+0.5mg/L萘乙酸+2.0mg/L 6-苄氨基嘌呤+30g/L蔗糖+0.1g/L聚乙烯吡咯烷酮，pH 5.8，其中1/2MS为大量元素减半的MS基本培养基。

3.人工种子的制作

以MS+0.5mg/L萘乙酸+2.5mg/L 6-苄氨基嘌呤+30g/L蔗糖+0.3-0.4wt％多菌灵+0.2wt％活性炭+20mg/L脱落酸为人工胚乳，在其中加入3-4wt％海藻酸钠熬制成半凝胶，经121℃高压灭菌20min后冷却备用，在超净工作台上，将经过30d液体悬浮增殖培养的大小为2-4mm的铁皮石斛原球茎均匀悬浮于半凝胶中，用内直径为4mm的滴管吸取半凝胶和原球茎滴入已灭菌冷却的50-150mmol/L硝酸钙溶液中，保证每滴半凝胶中只含有一颗原球茎，经过20-30min离子交换反应，倒去硝酸钙溶液，用无菌水漂洗3次即可得到人工种子。

4.人工种子的贮藏

在超净工作台上，将制得的人工种子置于无菌滤纸上吸干表面水分，再将其放入已灭菌烘干的三角瓶中，用封口膜密封好后，放置在4℃冰箱中黑暗保存。

实施例二：铁皮石斛人工种皮制作的正交试验

以MS+0.5mg/L萘乙酸+2.5mg/L 6-苄氨基嘌呤+30g/L蔗糖为人工胚乳，在其中加入2-4％海藻酸钠熬制成半凝胶，经121℃高压灭菌20min后冷却备用，在超净工作台上，将经过30d液体悬浮增殖培养的大小为2-4mm的铁皮石斛原球茎均匀悬浮于半凝胶中，用内直径为4mm的滴管吸取半凝胶和原球茎滴入已灭菌冷却的50-150mmol/L硝酸钙溶液中，保证每滴半凝胶中只含有一颗原球茎，经过20-30min离子交换反应，倒去硝酸钙溶液，用无菌水漂洗3次得到人工种子。

海藻酸钠浓度(2wt％、3wt％和4wt％)、硝酸钙浓度(50mmol/L、100mmol/L和150mmol/L)和离子交换反应时间(20min、25min和30min)组成一个三因素三水平的正交设计试验，如表1所示。记录各个处理人工种子的包埋效果和成形情况。每个处理选择100粒人工种子，播种于添加有无菌琼脂培养基的培养皿中，每个培养皿播种20粒。将其置于温度为25℃、光照强度为2000lx的人工气候箱中培养，每天光照16h。

表1铁皮石斛人工种皮制作的正交试验

营养物质泄漏率的统计和计算：培养在琼脂培养基上的人工种子，以开始培养20天后种子附近出现液体计为营养物质泄漏，泄漏种子数/人工种子总数X100％即为营养物质泄漏率。

萌发率的统计：将人工种子置于琼脂培养基上培养30天后统计萌发率，以幼芽突破种皮5mm以上计为萌发。

由表1可见，低浓度的海藻酸钠(2wt％)制作的人工种子硬度小、易粘连，虽然萌发率较高，但是营养物质泄漏率严重；高浓度的海藻酸钠(4wt％)制作的人工种子硬度高、边缘不整齐、有拖尾现象，虽然营养物质泄漏率较低，但萌发率也较低；3wt％海藻酸钠与50mmol/L硝酸钙反应25min制成的人工种子硬度较小，营养物质泄漏率较高；3％海藻酸钠与100和150mmol/L硝酸钙反应制成的人工种子形状规则整齐，营养物质泄漏率和萌发率均处于较优水平，是制作铁皮石斛人工种子较理想的人工种皮配方。

实施例三：铁皮石斛人工胚乳中添加多菌灵的有菌萌发试验

以MS+0.5mg/L萘乙酸+2.5mg/L 6-苄氨基嘌呤+30g/L蔗糖+0-0.5wt％多菌灵为人工胚乳，在其中加入3wt％海藻酸钠熬制成半凝胶，经121℃高压灭菌20min后冷却备用，在超净工作台上，将经过30d液体悬浮增殖培养的大小为2-4mm的铁皮石斛原球茎均匀悬浮于半凝胶中，用内直径为4mm的滴管吸取半凝胶和原球茎滴入已灭菌冷却的100mmol/L硝酸钙溶液中，保证每滴半凝胶中只含有一颗原球茎，经过25min离子交换反应，倒去硝酸钙溶液，用无菌水漂洗3次得到人工种子。多菌灵共设置6个浓度(wt％)梯度处理：0、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％。

从每个浓度处理中选择100粒人工种子，播种于铺有3cm腐殖土的培养盘中，播种密度为1粒/cm²，播种深度0.5cm。将培养盘放置于温度为25℃的恒温培养室中，每天喷水一次，20天后统计人工种子的污染率和非污染坏死率，30天后统计人工种子萌发率。统计结果见表2。

表2铁皮石斛人工胚乳中添加多菌灵的有菌萌发试验

污染率的统计：铁皮石斛人工胚乳中观察到菌落的人工种子计为污染。

非污染坏死率的统计：铁皮石斛人工胚乳中未观察到菌落、人工种胚由于多菌灵的毒害作用死亡的人工种子计为非污染坏死。

萌发率的统计：将人工种子置于腐殖土上培养30天后统计萌发率，以幼芽突破种皮5mm以上计为萌发。

由表2可知，低浓度的多菌灵(0、0.1wt％、0.2wt％)不能有效控制菌类生长，人工种子污染率较高，萌发率较低；高浓度的多菌灵(0.5wt％)虽能有效控制菌类生长，人工种子未发生污染，但是多菌灵对人工种子的毒害作用导致人工种子的非污染坏死率高，因而其萌发率也较低；0.3wt％和0.4wt％的多菌灵能将人工种子的污染率和非污染坏死率都控制在较低水平，因而其处理的人工种子在有菌基质上萌发率高。

实施例四：铁皮石斛人工胚乳中添加脱落酸的贮藏试验

以MS+0.5mg/L萘乙酸+2.5mg/L 6-苄氨基嘌呤+30g/L蔗糖+0.2wt％活性炭+0或20mg/L脱落酸为人工胚乳，在其中加入3wt％海藻酸钠熬制成半凝胶，经121℃高压灭菌20min后冷却备用，在超净工作台上，将经过30d液体悬浮增殖培养的大小为2-4mm的铁皮石斛原球茎均匀悬浮于半凝胶中，用内直径为4mm的滴管吸取半凝胶和原球茎滴入已灭菌冷却的100mmol/L硝酸钙溶液中，保证每滴半凝胶中只含有一颗原球茎，经过25min离子交换反应，倒去硝酸钙溶液，用无菌水漂洗3次得到人工种子。

不添加脱落酸和添加20mg/L脱落酸两个处理分别制作600粒人工种子，在超净工作台上，将制得的人工种子置于无菌滤纸上吸干表面水分，再将其分为100粒一份，分别放入已灭菌烘干的三角瓶中，用封口膜密封好后，放置在4℃冰箱中黑暗保存。

每隔30天，分别从不添加脱落酸和添加20mg/L脱落酸两个处理的人工种子中取出100粒，播种于添加有无菌琼脂培养基的培养皿中，每个培养皿播种20粒。将其置于温度为25℃、光照强度为2000lx的人工气候箱中培养，每天光照16h。培养30天后统计萌发率，以幼芽突破种皮5mm以上计为萌发。

表3铁皮石斛人工胚乳中添加脱落酸的贮藏试验

由表3可知，随着贮藏时间的延长，不添加脱落酸的人工种子萌发率迅速降低，在贮藏5个月后种子萌发率降为0；添加20mg/L脱落酸的人工种子萌发率随贮藏时间延长降低较慢，贮藏6个月后萌发率仍可达45％。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (1)

1.一种铁皮石斛人工种子的制作和贮藏方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)原球茎的诱导：

将铁皮石斛成熟但尚未开裂的蒴果在自来水下冲洗1-2h，放入超净工作台中，先用75％酒精浸泡0.5-1min，无菌水冲洗3-5次，再用0.1％氯化汞溶液浸泡8-10min，无菌水冲洗3-5次，置于无菌滤纸上吸干表面水分，用解剖刀将蒴果切开，将蒴果内种子均匀撒播在原球茎诱导培养基上，置于25℃人工气候箱中，先进行5d黑暗培养，然后转入光照培养，光照强度为2000lx，每日光照时间为16h，培养15d后种子萌发形成绿色的原球茎；原球茎诱导培养基组成为MS+0.5mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+10％上豆汁+0.5％活性炭+0.7％琼脂，pH 5.8，培养基预先在121℃下高压灭菌15-20min，

(2)原球茎的液体悬浮培养增殖

将诱导获得的铁皮石斛原球茎接种于液体增殖培养基中进行悬浮培养，每瓶装培养基25-30ml，接种原球茎重量为1.5-2.0g，将培养瓶置于25℃恒温摇床上振荡培养，转速为80-100r/min，光照为自然漫射光，每培养15d更换一次培养液；

原球茎液体增殖培养基配方为1/2MS+0.5mg/L萘乙酸+2.0mg/L 6-苄氨基嘌呤+30g/L蔗糖+0.1-0.5g/L聚乙烯吡咯烷酮，pH 5.8，其中1/2MS为大量元素减半的MS基本培养基：

(3)人工种子的制作

以MS+0.5mg/L萘乙酸+2.5mg/L 6-苄氨基嘌呤+30g/L蔗糖+0.3-0.4wt％多菌灵+0.2wt％活性炭+20mg/L脱落酸为人工胚乳，在其中加入3-4wt％海藻酸钠熬制成半凝胶，经121℃高压灭菌20min后冷却备用，在超净工作台上，将经过30d液体悬浮增殖培养的大小为2-4mm的铁皮石斛原球茎均匀悬浮于半凝胶中，用内直径为4mm的滴管吸取半凝胶和原球茎滴入已灭菌冷却的50-150mmol/L硝酸钙溶液中，保证每滴半凝胶中只含有一颗原球茎，经过20-30min离子交换反应，倒去硝酸钙溶液，用无菌水漂洗3次即可得到人工种子；

(4)人工种子的贮藏

在超净工作台上，将制得的人工种子置于无菌滤纸上吸干表面水分，再将其放入已灭菌烘干的三角瓶中，用封口膜密封好后，放置在4℃冰箱中黑暗保存。