CN102696480B

CN102696480B - 一种试管内沙基质培养油茶无菌芽的方法

Info

Publication number: CN102696480B
Application number: CN 201210137783
Authority: CN
Inventors: 陈博雯; 蔡玲; 刘海龙; 陈晓明; 王鹏良; 覃子海
Original assignee: Guangxi Zhuang Autonomous Region Forestry Research Institute
Current assignee: Guangxi Zhuang Autonomous Region Forestry Research Institute
Priority date: 2012-05-07
Filing date: 2012-05-07
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2032-05-07
Also published as: CN102696480A

Abstract

本发明公开了一种试管内沙基质培养油茶无菌芽的方法，其特征在于采用80～100目新鲜干净的河沙按1/4装入量装入试管，加入含0.01～0.02g/L抗坏血酸的MS液体培养基至湿润混匀作为培养基质，将1～5年生油茶龄植株树冠外围中上部带有腋芽的半木质化或刚木质化的嫩枝剪切成带腋芽1～2个、长3.0～4.0cm的小段，经消毒扦插至培养基质中培养，剪取新萌发的嫩芽转接至MS培养基中继续培养得到油茶无菌芽。采用河沙和培养液作为培养基质，与油茶的生长习性相适应，更适宜油茶新芽的生长和萌发，在简单接种后，减轻褐化程度，降低污染率，不需频繁转接，培养12～18天可见腋芽开始萌发，萌发时间缩短，且萌发率达85～93%，培养油茶无菌芽成功率高，经济效益好。

Description

一种试管内沙基质培养油茶无菌芽的方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，涉及无菌外植体培养技术，尤其是涉及一种试管内沙基质培养油茶无菌芽的方法。

背景技术

油茶是我国特有的重要食用油料树种，适应性强，耐干旱、瘠薄，适宜南方丘陵山区种植。茶油不饱和脂肪酸含量达94%，为天然植物油中之冠，是优质功能性保健油和纯天然的绿色食用油。油茶的育苗技术方面的研究，初期主要集中在实生苗和扦插苗培育方面。但是，由于实生苗遗传不稳定，培育苗木的质量差异较大;而扦插苗虽然能够稳定的保持母株的优良性状，但由于生产周期较长，需要较长的时间才能建立规模化的生产。相比之下，采用“以芽繁芽”的组织培养技术培育的组培苗，遗传稳定性好，生产周期大大缩短，可以在较短时间内培育大量优质种苗，并且建立规模化生产。组培快繁技术是保持油茶优良性状的有效途径，同时也是大规模推广油茶良种的捷径。无菌茎段芽培养是“以芽繁芽”组培快繁技术的基础步骤，目前的培养方法多是将消毒处理后的带芽茎段接种至固体或液体培养基中，应用此种方法培养存在多种不足。首先，油茶中富含酚类化合物和多酚氧化酶，茎段组织被切割接种时,破损细胞中酚类化合物和多酚氧化酶分泌至培养基中并混合,酚类化合物在酶的催化下迅速氧化而形成褐色醌类物质。由于培养基不能流动，醌类物质聚集在茎段周围，对组织产生毒害作用，导致整个外植体褐化死亡，需将外植体频繁转移至新培养基中以减轻褐化的影响，耗时耗力。其次，油茶茎段从自然条件接种至培养基中，需要植物内部调整以适应新的营养条件，影响及延缓腋芽的萌发，有时腋芽还未萌发已褐化死亡。加之油茶本身生长慢，外植体接种至培养基到腋芽完全萌发一般需要40到60天的培养时间，而细菌和霉菌生长速度极快，培养基中营养丰富，湿度较高，极利于细菌和霉菌的生长，若外植体又经频繁转移，极易造成污染，极大地降低了无菌芽培养的成功率。

发明内容

本发明的目的：为了克服现有培养油茶无菌芽方法的不足，减轻褐化程度，降低污染率，不需频繁转接，提高无菌芽培养的成功率,适宜油茶腋芽萌发而提供一种试管内沙基质培养油茶无菌芽的方法。

本发明是这样实现的：

一种试管内沙基质培养油茶无菌芽的方法，包括外植体采集、培养基质准备、培养和转接工序，以河沙和培养液作为培养基质，将经消毒油茶茎段扦插至培养基质中培养，剪取新萌发的嫩芽转接至MS培养基中继续培养得到油茶无菌芽，其操作步骤如下：

（1）外植体采集：选择１～５年生油茶植株树冠外围中上部的半木质化或刚木质化并带有腋芽的嫩枝;

（2）外植体消毒：将采集的嫩枝去除叶片、老茎段部分，用清水洗净，再用沾有肥皂粉或洗洁精的软毛刷进行刷洗，再用去离子水清洗1～3次，将嫩枝剪切成带腋芽1～2个、长2.5～4.0cm的小段，用去离子水洗2～3次后置于超净台上进行外植体消毒;

（3）培养基质准备：将河沙装入试管长度1/4～1/5，再加入少量培养液至湿润，用玻棒混匀，在121℃灭菌30～40分钟得到河沙培养液混合的培养基质;

（4）接种：在超净台中将消毒处理后的茎段两端伤口剪去处2～3mm,以扦插的方式接种于试管内的培养基质中;

（5）培养：接种后的试管置于培养室中培养，室温控制在25±2℃，光照采用自然散射光，光照强度控制为1000～25OOLX,每天光照10～14h。

（6）转接：外植体在基质中培养至腋芽萌发，剪取新萌发出的嫩芽转接至MS培养基中继续培养，7天后观察检测污染情况，无污染的新芽再用于进行后续组培操作。

以上所述的外植体消毒采用75％酒精浸泡外植体，搅拌10～30s，再用无菌水充分漂洗3～4次，用0.1%氯化汞药液以振荡的方式处理10～15min，无菌水充分漂洗3～4次，再用无菌滤纸吸干表面水分。

以上所述的河沙采用80～100目新鲜干净的河沙。

以上所述的培养液是含0.01～0.02g/L抗坏血酸的MS培养基。

以上所述的扦插是插入培养基质的部分占茎段长度的1/4～1/5。

本发明与现有技术相比的有益效果和显著进步：

（1）本发明由于采用河沙和培养液作为培养基质，与油茶的生长习性相适应，更适宜油茶新芽的生长和萌发，在简单接种后，培养12～18天可见腋芽开始萌发，萌发时间缩短，且萌发率达85～93%，培养油茶无菌芽成功率高。

（2）河沙和培养液作为培养基质，河沙具有渗透和吸附效应，水分可以通过虹吸作用到达茎段，满足茎段生长需要，又不增加表面湿度;抗坏血酸可以抑制酚类物质的氧化，同时醌类物质可被基质吸附并渗透扩散，茎段周围积聚量较少，对外植体毒害作用小，不需频繁转接，减少人力物力消耗。

（3）基质已经过高温高压灭菌，与用培养基直接培养茎段相比，营养物质少，湿度低，能抑制残留细菌霉菌的生长，降低了外植体培养的污染率，茎段在沙基质中培养污染率4～17%，萌发后的嫩芽再接种至MS培养基中，培养7天后检测污染率为1～4%，而已有用培养基接种外植体的污染率都在10%以上，用沙基质接种外植体则未见文献报道。本发明方法远低于已有培养基的污染率。

具体实施方式

下面结合实施例,对本发明的一种试管内沙基质培养油茶无菌芽的方法进一步描述。

实施例1：

将80目筛新鲜干净的河沙按1/4装入量装入试管，加入含0.01g/L抗坏血酸的MS液体培养基至湿润，用玻棒混匀，试管用棉球塞好，外包牛皮纸，捆扎完毕后，121℃灭菌40分钟备用。在3月份连续放晴2天以上的上午11～12点采集3年生油茶植株树冠外围中上部的带有腋芽半木质化的嫩枝，采下的穗条因路途远需长途运输，要防晒保湿，用干净湿润的毛巾包扎伤口浸于干净的水中储藏待处理。将枝条去除叶片、老茎段部分，用清水将附着于枝条表面的泥土等污染物清洗干净，再用沾有肥皂粉的软毛刷进行刷洗，后用去离子水彻底清洗3次。将枝条剪切成带腋芽1～2个、长3.0～4.0cm的小段，用去离子水洗3次后置于超净台上。用75％酒精浸泡外植体，搅拌15s，无菌水充分漂洗3次。后用0.1%氯化汞药液以振荡的方式处理11min，再用无菌水充分漂洗3次，最后用无菌滤纸吸干表面水分。

在超净台中将消毒处理后的茎段两端伤口剪去处2～3mm,以扦插的方式接种于试管内的培养基质中，插入基质的部分占茎段长度的1/4。然后将接种的试管置于培养室培养，室温控制为25±1℃，采用自然散射光光照，其强度控制为1200～130OLX,每天光照13～14h。外植体在基质中培养１５天后可见腋芽萌发，萌发率85.4%，污染率12%，剪取新萌发出的嫩芽转接至MS培养基中继续培养，7天后观察检测，污染率为3%，无污染的新芽用于进行后续组培操作。

实施例2：

将100目筛新鲜干净的河沙按1/5装入量装入试管，加入含0.02g/L抗坏血酸的MS液体培养基至湿润，用玻棒混匀，试管用棉球塞好，外包牛皮纸，捆扎完毕后，121℃灭菌30分钟备用。在5月份连续放晴2天以上的上午9～10点采集1年生油茶植株树冠外围中上部的带有腋芽刚木质化的嫩枝，采下的穗条因路途远需长途运输，要防晒保湿，即采即用。将枝条去除叶片、老茎段部分，用清水将附着于枝条表面的泥土等污染物清洗干净，再用沾有肥皂粉的软毛刷进行刷洗，后用去离子水彻底清洗3次。将枝条剪切成带腋芽1～2个、长3.0～4.0cm的小段，用去离子水洗3次后置于超净台上。用75％酒精浸泡外植体，搅拌15s，无菌水充分漂洗3次。后用0.1%氯化汞药液以振荡的方式处理12min，再用无菌水充分漂洗4次，最后用无菌滤纸吸干表面水分。

在超净台中将消毒处理后的茎段两端伤口剪去处2～3mm,以扦插的方式接种于试管内的培养基质中，插入基质的部分占茎段长度的1/4。然后将接种的试管置于培养室培养，室温控制为25±2℃，采用自然散射光光照，其强度控制为1300～150OLX,每天光照10～11h。外植体在基质中培养１3天后可见腋芽萌发，萌发率87.2%，污染率8.4%，剪取新萌发出的嫩芽转接至MS培养基中继续培养，7天后观察检测，污染率为2.1%，无污染的新芽用于进行后续组培操作。

实施例3：

将90目筛新鲜干净的河沙按1/4装入量装入试管，加入含0.02g/L抗坏血酸的MS液体培养基至湿润，用玻棒混匀，试管用棉球塞好，外包牛皮纸，捆扎完毕后，121℃灭菌35分钟备用。在4月份连续放晴2天以上的上午11～12点采集2年生油茶植株树冠外围中上部的带有腋芽半木质化的嫩枝，采下的穗条因路途远需长途运输，要防晒保湿，用干净湿润的毛巾包扎伤口浸于干净的水中储藏待处理。将枝条去除叶片、老茎段部分，用清水将附着于枝条表面的泥土等污染物清洗干净，再用沾有肥皂粉的软毛刷进行刷洗，后用去离子水彻底清洗3次。将枝条剪切成带腋芽1～2个、长3.0～4.0cm的小段，用去离子水洗2次后置于超净台上。用75％酒精浸泡外植体，搅拌25s，无菌水充分漂洗3次。后用0.1%氯化汞药液以振荡的方式处理14min，再用无菌水充分漂洗3次，最后用无菌滤纸吸干表面水分。

在超净台中将消毒处理后的茎段两端伤口剪去处2～3mm,以扦插的方式接种于试管内的培养基质中，插入基质的部分占茎段长度的1/4。然后将接种的试管置于培养室培养，室温控制为25±1℃，采用自然散射光光照，其强度控制为1800～230OLX,每天光照10～11h。外植体在基质中培养１6天后可见腋芽萌发，萌发率93%，污染率9.2%，剪取新萌发出的嫩芽转接至MS培养基中继续培养，7天后观察检测，污染率为0.5%，无污染的新芽用于进行后续组培操作。

Claims

1.一种试管内沙基质培养油茶无菌芽的方法，包括外植体采集、培养基质准备、培养和转接工序，其特征在：以河沙和培养液作为培养基质，将经消毒油茶茎段扦插至培养基质中培养，剪取新萌发的嫩芽转接至MS培养基中继续培养得到油茶无菌芽，其操作步骤如下：

（1）外植体采集：选择1～5年生油茶植株树冠外围中上部的半木质化或刚木质化并带有腋芽的嫩枝；

（2）外植体消毒：将采集的嫩枝去除叶片、老茎段部分，用清水洗净，再用沾有肥皂粉或洗洁精的软毛刷进行刷洗，再用去离子水清洗1～3次，将嫩枝剪切成带腋芽1～2个、长2.5～4.0cm的小段，用去离子水洗2～3次后置于超净台上进行外植体消毒；

（3）培养基质准备：将河沙装入试管长度1/4～1/5，再加入少量培养液至湿润，用玻棒混匀，在121℃灭菌30～40分钟得到河沙培养液混合的培养基质；

（4）接种：在超净台中将消毒处理后的茎段两端伤口处剪去2～3mm,以扦插的方式接种于试管内的培养基质中；

（5）培养：接种后的试管置于培养室中培养，室温控制在25±2℃，光照采用自然散射光，光照强度控制为1000～2500LX,每天光照10～14h；

（6）转接：外植体在基质中培养至腋芽萌发，剪取新萌发出的嫩芽转接至MS培养基中继续培养，7天后观察检测污染情况，无污染的新芽再用于进行后续组培操作；

所述的河沙采用80～100目新鲜干净的河沙；

所述的培养液是含0.01～0.02g/L抗坏血酸的MS培养基。

2.根据权利要求1所述的一种试管内沙基质培养油茶无菌芽的方法，其特征在于：所述的外植体消毒采用75％酒精浸泡外植体，搅拌10～30s，再用无菌水充分漂洗3～4次，用0.1%氯化汞药液以振荡的方式处理10～15min，无菌水充分漂洗3～4次，再用无菌滤纸吸干表面水分。

3.根据权利要求1所述的一种试管内沙基质培养油茶无菌芽的方法，其特征在于：所述的扦插是插入培养基质的部分占茎段长度的1/4～1/5。