CN100429972C - 晚春含笑的组织培养繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
一种以球花含笑(M.sphaerantha)为母本，云南含笑(M.yunnanensis)为父本，属内种间杂交F1筛选培育出来的晚春含笑组织培养快速繁殖的方法，该方法取1-2年生晚春含笑幼龄树茎段作外植体，用幼龄树外植体建立起无菌系，增殖系数高，采用二步法生根使小苗健壮，繁殖过程畅通，生根效果好，移栽成活率可达到90%。晚春含笑树形优美、常绿、白色花有香味、灌木，是理想的庭园观赏树种；进行组织培养无性繁殖技术研究对保持它的杂交优势，新品种推广具有现实应用价值。
Description
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种木兰科植物晚春含笑的组织培养繁殖方法。
背景技术：
木兰科(Magonliaceae)是古老的被子植物类群，该种群植物日趋减少濒危。其中含笑属(Michelia)植物有许多是重要的园林观赏植物，并具有较高经济价值，从该属中分离出多种倍半萜内酯，有些具有抗癌活性；晚春含笑是以球花含笑(M.sphaerantha)为母本，云南含笑(M.yunnanensis)为父本，属内种间杂交F1筛选培育出来的品种。树形优美、常绿、白色花有香味、灌木，是理想的庭园观赏树种；进行组织培养无性繁殖技术研究对保持它的杂交优势，新品种推广具有现实应用价值。 目前，木兰科植物一般通过播种和嫁接来繁殖，扦插繁殖生根率低对母树伤害大，组织培养技术难度较大，现有技术中未有晚春含笑组织培养快速繁殖的方法的报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种晚春含笑组织培养快速繁殖的方法，该方法取1-2年生晚春含笑幼龄树茎段作外植体，用幼龄树外植体建立起无菌系，增殖系数高，采用二步法生根使小苗健壮，繁殖过程畅通，生根效果好，移栽成活率可达到90％。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
晚春含笑的组织培养繁殖方法，主要包括诱导分化培养、继代增植培养、生根培养、移栽步骤，以MS+BA1mg/l+NAA0.2mg/l为诱导分化培养基，MS+BA0.8mg/l+NAA0.2mg/l为继代增殖培养基，1/4MS+NAA2mg/l为生根培养基进行二次生根。
上述方法中，诱导分化培养优选晚春含笑1-2年生幼龄树茎段为外植体，洗净，洒精浸泡，转入0.1％的HgCl2溶液中消毒8-10分钟，再用无菌水冲洗4-5次，切为0.5cm带腋芽的小段，接种于已加入0.8％琼脂固化，蔗糖3％并在120℃条件中灭菌18分钟，PH为5.6的MS+BA1mg/l+NAA0.2mg/l培养基中培养，培养温度24±2℃，光照强度2000lx，光照时间12h.d-1。
二次生根是将已生根的苗取出，将根截短保留一小部分集中接入培养基3-4周，待长出5-7条侧根时，将未诱导出根的苗切掉底部愈伤组织，再接入生根培养基进行二次生根培养。
移栽所用基质优选过筛的红土和腐质土2∶1的混合基质，栽培场地优选玻璃钢温室。移栽所用基质进一步优选草莓土加红土1∶1的混和基质，过筛后500倍液白菌清消毒，初期放入温室，保持80％以上的湿度，白天温度25℃，夜间不低于5℃。
更具体地，本发明的技术方案优选晚春含笑1-2年生幼龄树茎段为外植体，洗净，洒精浸泡，转入0.1％的HgCl2溶液中消毒8-10分钟，再用无菌水冲洗4-5次，切为0.5cm带腋芽的小段，接种于已加入0.8％琼脂固化，蔗糖3％并在120℃条件中灭菌18分钟，PH为5.6的MS+BA1mg/l+NAA0.2mg/l培养基中培养，培养温度24±2℃，光照强度2000lx，光照时间12h.d-1；培养4-5周后，转入MS+BA0.8mg/l+NAA0.2mg/l培养基中继代增殖培养，8-10周，待分化出丛芽后，将1cm以上的芽留2-3片叶切下，接入生根培养基1/4MS+NAA2mg/l中50-60天，将已生根的苗取出，将根截短保留一小部分集中接入培养基3-4周，待长出5-7条侧根时，将未诱导出根的苗切掉底部愈伤组织，再接入生根培养基进行二次生根培养；然后将具有3条根的苗移栽入草莓土加红土1∶1的混和移栽基质，过筛后500倍液白菌清消毒，移栽初期放入温室，保持80％以上的湿度，白天温度25℃，夜间不低于5℃。
具体实施方式：
下面用本发明的实施例来进一步说明本发明，但本发明内容不以实施例为限。
实施例1：
取以球花含笑(M.sphaerantha)为母本，云南含笑(M.yunnanensis)为父本，属内种间杂交F1筛选培育出来的晚春含笑1-2年生幼龄树茎段为外植体，洗净，洒精浸泡，转入0.1％的HgCl2溶液中消毒8-10分钟，再用无菌水冲洗4-5次，切为0.5cm带腋芽的小段，接种于已加入0.8％琼脂固化，蔗糖3％并在120℃条件中灭菌18分钟，PH为5.6的MS+BA1mg/l+NAA0.2mg/l培养基中培养，培养温度24±2℃，光照强度2000lx，光照时间12h.d-1；培养4-5周后，转入MS+BA0.8mg/l+NAA0.2mg/l培养基中继代增殖培养，8-10周，待分化出丛芽后，将1cm以上的芽留2-3片叶切下，接入生根培养基1/4MS+NAA2mg/l中50-60天，将已生根的苗取出，将根截短保留一小部分集中接入培养基3-4周，待长出5-7条侧根时，将未诱导出根的苗切掉底部愈伤组织，再接入生根培养基进行二次生根培养；然后将具有3条根的苗移栽入草莓土加红土1∶1的混和移栽基质，过筛后500倍液白菌清消毒，移栽初期放入温室，保持80％以上的湿度，白天温度25℃，夜间不低于5℃。
下面用本发明的详细试验过程和结果来进一步详细阐述本发明。
一.材料和方法
取以球花含笑(M.sphaerantha)为母本，云南含笑(M.yunnanensis)为父本，属内种间杂交F1筛选培育出来的能开花结籽的晚春含笑成年树的当年生枝条，叶片；取扦插试验成活的晚春含笑1-2年生植株上萌发的枝条、叶片，作外植体诱导对象，取材时间分不同时期，成年树取材分基部和中部以上两种。
材料取回后将老叶剪去露出腋芽，去掉已木质化部分茎段，留下嫩茎、幼叶，用自来水冲洗一段时间，毛笔轻轻刷干净后，75％酒精浸泡30s，转入0.1％的HgCl2溶液消毒，叶片消毒5-6min，茎段消毒8-10min，然后用无菌水冲洗4-5次备用。培养基(1)MS+KT2mg/l(单位下同)+NAA0.2，(2)MS+KT1+NAA0.2，(3)MS+BA1+NAA0.2，(4)MS+BA0.8+NAA0.2，(5)MS+2，4-D1，(6)MS+BA1+NAA0.2+AC0.3g/l，(7)MS+BA0.8+NAA0.2+AC0.3g/l，以上培养基均加入0.8％琼脂固化，蔗糖3％，PH5.6，50ml三角瓶作初次接种培养容器，高压锅蒸汽灭菌120℃、18min，培养室温度24±2℃，光照强度2000lx，光照时间12h.d-1。生根培养(8)1/4MS+IBA3，(9)1/4MS+NAA3，将消毒好的茎段切为0.5cm带腋芽的小段，叶片切割为0.5cm2的片状，分别接种到以上(1)-(7)培养基中，放入培养室培养。移栽基质为过筛的红土和腐质土，混合物比例为2∶1，栽培场地为玻璃钢温室。
二.结果与分析
1.叶接种在(1)(2)(3)(4)(5)培养基培养2-3周，在材料切口四周，叶背面的叶脉上，生长出许多愈伤组织，它们呈绿色颗粒状，有的呈白色粉状，其中(3)(4)(5)比(1)(2)生长快，4-5周后将它们转入相同的新鲜培养基中培养观察，愈伤组织能继续增多，但未见分化出苗，若不转瓶，在原培养基继续培养到6-8周，培养基褐化严重，材料也逐渐褐化死亡，成年树、幼树叶片培养表现基本一致无差别。
2.幼树茎段接种在(1)(2)(3)(4)培养基中，四种激素组合都能使茎段腋芽分化，但诱导出芽的外形差异较大，(1)(2)诱导出的芽叶子细长、硬，丛芽萌发少或不发，(3)(4)诱导出的形态较粗壮正常，丛芽数较多。经多次试验总结认为，(3)MS+BA1+NAA0.2，最适合作外植体诱导培养基。继代增殖培养采用(4)MS+BA0.8+NAA0.2效果较好。培养过程中，培养基有褐化现象，但与成年树的对照相比较，褐化基本不影响生长分化，在现有设定的培养条件下，75天可以扩大4-6倍，用加活性碳的(6)(7)培养基来继代培养，能减少褐化，但同时也会抑制丛芽的生长分化，活性炭的用量不高但抑制现象却很明显。
3.成年树不同部位茎段培养结果差异较大，本实验将50cm以下划为基部，50cm以上划为上部，经过不同时期多次试验小结表明，上部茎段外植体接到培养基上成活率极低，几乎全部褐化死亡，基部茎段培养情况好于上部，有8-10％接种存活，这一现象与木兰科枝条扦插生根实验报道有相似之处，接活的材料在后期培养中褐化严重，经多次转代增殖效果仍然很差。
4.取自不同时期、不同植株的茎段外植体，诱导分化表现出的差异很大。成年树和扦插成活的幼树茎段对比实验表明：幼树材料比成年树材料容易接种成活，褐化现象较轻，诱导分化时间短，相反，成年树外植体褐化严重，诱导分化时间较长(见表1)，
表1不同时期不同植株茎段外植体接种生长情况
从表中统计的数字可看出，幼树外植体诱导分化较容易，接种死亡的原因主要是由于污染，材料褐化死亡数极少，接种最低成活率在50％以上，受季节影响不大；相反，成年树材料褐化严重，接种成活率低，诱导时间长，受季节影响大，诱导时间长，12月接种情况稍好，8月表现最差，接种存活的无菌系在后期的继代培养中，褐化严重，难分化。而幼树材料诱导出的丛芽长势明显好于成年树，后期增殖培养也明显有
5.二步法生根法，将1cm以上的芽留2-3片叶切下，接入生根培养基(8)1/4MS+IBA3，(9)1/4MS+NAA3两种培养，30天左右开始长根，60天后进行生根统计，生根率在82％-88％，两种培养基生根情况不同，(8)诱导出的根约有1-2条，较细颜色较深，(9)诱导出的根约有2-3条，较粗色白，相比之下(9)比(8)诱导出的苗健壮；以下实验都用(9)作生根培养基，第一次生根完毕，苗的长势及根的长短参差不齐，不便于栽种，因此采用二次生根，将已生根的苗统一取出，将根截短保留一小部分集中接入培养基，3-4周可促发5-7条侧根，将未诱导出根的苗切掉底部愈伤组织，集中接入培养基再次生根培养；这样可大大提高生根率，可形成健壮整齐的试管苗，便于统一移栽管理，用二步法生根可使晚春含笑的整个组培法繁殖过程畅通。
6.移栽，一般取具有3条根以上的正常苗移栽，移栽基质采用草莓土加红土1∶1的混和基质，过筛后500倍液白菌清消毒可用；移栽初期放入温室，保80％以上的湿度、白天温度25℃夜间不低于5℃，移栽成活率可达到90％以上。
下面再详细说明晚春含笑的杂交过程：
晚春含笑：球花含笑(Michelia sphaerantha)(♀)X云南含笑(M.yunnanensis)(♂)，在母本花朵还未张开时，轻轻扳开花被片，去掉雄蕊，用父本的花粉给其受粉，然后将花被片复原而包裹雌蕊群，并套袋，约1星期后去袋。杂交时间为上午8:00-9:00。未成功的一个月左右落果。种子成熟后采集果实并阴干后收集种子，洗去油质外种皮，在室温下保湿沙藏。第二年早春播种，适时分苗移栽。观察实生苗的适应性及形态形状。
母本：球花含笑(Michelia sphaerantha)：常绿大乔木，幼枝被褐色绒毛。叶革质，倒卵状长圆形，先端具骤尖头，叶上面无毛，下面被短柔毛，中脉在叶面凹下，侧脉网络致密；叶柄无托叶痕。花白色，下垂，不张开，花被片12，长6-7.5cm，宽1-2.5cm，狭倒卵形，雄蕊长约2cm，雌蕊群被短柔毛，花期4-5月。
父本：云南含笑(M.yunnanensis)：常绿灌木，枝叶茂密，高可达4米芽、嫩枝、嫩叶上面及叶柄、花梗密被深红色平伏毛。叶硬革质，倒卵形、狭倒卵形或狭倒卵状椭圆形，长4-10cm，宽1.5-3.5cm，先端圆钝或短急尖，基部楔形，上面深绿色，下面残留平伏毛；托叶痕为叶柄长的2/3或达顶端毛下面灰白色。花梗粗壮，花白色，张开成一个平面或呈杯状，芳香，花被片6-12(17)，倒卵形或倒卵状椭圆形，长3-3.5cm，内轮较狭小，雄蕊长0.5-1cm，雄蕊群及雌蕊群柄均被红褐色平伏细毛，花期3-4月。
晚春含笑：常绿灌木至小乔木，从茎基部开始分枝，分枝多而密，呈塔形：芽、叶柄、幼叶两面被棕色短绒毛。叶革质，倒长卵形或长圆形，长6.5-16cm，宽2.5-5cm，先端具骤尖头或稍圆钝，基部楔形，叶面深绿色，叶面无毛，背面残留棕色短绒毛，中脉在叶面凹下，侧脉每边9-11，叶柄上托叶痕为叶柄长的1/3。花乳白色，花被片(7)11-12，狭倒卵形或匙形，长3.5-6cm，宽1-2cm，呈3轮排列，张开呈钟形。花期4-5月。晚春含笑于1998年首次育成，此后多次培育出了该杂交种，2003年春首次开花。
晚春含笑已于2005年6月21日提出植物品种权申请，已受理。受理部门：国家林业局植物新品种保护办公室，申请号：20050039，申请日：2005年6月21日。
三.结论
晚春含笑组织培养快速繁殖外植体适宜选择1-2年生幼龄树茎段。诱导分化培养基：MS+BA1+NAA0.2，继代增殖培养基：MS+BA0.8+NAA0.2，生根培养基为：1/4MS+NAA3。采用二步法生根，可使整个繁殖过程畅通。
杂交F1新品种“晚春含笑”的组织培养繁殖研究表明：叶片较容易诱导出愈伤组织，但愈伤组织难以分化出芽，茎段培养能诱导出丛芽。 成年树茎段诱导时间长、褐化严重、后期继代增殖表现差，不适合作外植体，取1-2年生幼龄树茎段较容易诱导分化，用幼龄树外植体建立的无菌系增殖系数高，适宜作组织培养快速繁殖的外植体来源。MS+BA1mg/l+NAA0.2mg/l，MS+BA0.8mg/l+NAA0.2mg/l，以上两种培养基对诱导和增殖培养效果较好，将1cm以上的芽留2-3片叶剪下，放在1/4MS+NAA2mg/l比1/4MS+IBA2mg/l生根培养基上生根效果好，采用二步法生根能使小苗健壮，繁殖过程畅通，在条件适宜有保护设施条件下，移栽成活率达到90％以上。
Claims (5)
1、晚春含笑的组织培养繁殖方法，主要包括诱导分化培养、继代增殖培养、生根培养和移栽步骤，其特征在于以MS+BA1mg/l+NAA0.2mg/l为诱导分化培养基，MS+BA0.8mg/l+NAA0.2mg/l为继代增殖培养基，1/4MS+NAA2mg/l为生根培养基进行二次生根培养；所说二次生根培养是将已生根的苗取出，将根截短保留一小部分，然后将苗集中接入培养基3-4周，待长出5-7条侧根时，将未诱导出根的苗切掉底部愈伤组织，再接入生根培养基进行第二次生根培养。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于诱导分化培养选晚春含笑1-2年生幼龄树茎段为外植体，洗净，酒精浸泡，转入0.1％的HgCl2溶液中消毒8-10分钟，再用无菌水冲洗4-5次，切为0.5cm带腋芽的小段，接种于已加入0.8％琼脂固化的，含蔗糖3％并在120℃条件中灭菌18分钟且pH为5.6的MS+BA1mg/l+NAA0.2mg/l培养基中培养，培养温度24±2℃，光照强度2000lx，光照时间12h.d-1。
3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于移栽所用基质选过筛的红土和过筛的腐质土为2∶1的混合基质，栽培场地选玻璃钢温室。
4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于移栽所用基质选草莓土和红土为1∶1的过筛的混和基质，然后500倍液白菌清消毒，移栽初期放入温室，保持80％以上的湿度，白天温度25℃，夜间不低于5℃。
5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于选晚春含笑1-2年生幼龄树茎段为外植体，洗净，酒精浸泡，然后转入0.1％的HgCl2溶液中消毒8-10分钟，再用无菌水冲洗4-5次，切为0.5cm带腋芽的小段，接种于已加入0.8％琼脂固化的，含蔗糖3％并在120℃条件中灭菌18分钟且pH为5.6的MS+BA1mg/l+NAA0.2mg/l培养基中培养，培养温度24±2℃，光照强度2000lx，光照时间12h.d-1；培养4-5周后，转入MS+BA0.8mg/l+NAA0.2mg/l培养基中继代增殖培养，培养8-10周，待分化出丛芽后，将1cm以上的芽切下，芽上留2-3片叶，然后将芽接入生根培养基1/4MS+NAA2mg/l中培养50-60天；将已生根的苗取出，将根截短保留一小部分，然后将苗集中接入培养基3-4周，待长出5-7条侧根时，将未诱导出根的苗切掉底部愈伤组织，再接入生根培养基进行第二次生根培养；然后将具有3条根以上的苗移栽入草莓土和红土为1∶1的过筛的混和移栽基质，然后500倍液白菌清消毒，移栽初期放入温室，保持80％以上的湿度，白天温度25℃，夜间不低于5℃。
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