CN102405843B - 大果红花油茶组织培养快速繁殖的育苗方法 - Google Patents

大果红花油茶组织培养快速繁殖的育苗方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种大果红花油茶组织培养快速繁殖的育苗方法，包括用来繁殖的外植体采集、无菌分化、壮苗培养和袋装苗移栽。选取芽尖或叶片作繁殖的外植体，经消毒，去除杂质，用分化培养基培养形成小植株，将诱导出的小植株切割后接入新的分化培养基中多次继代，获得的小植株接种到特制的壮苗培养基上培养，最后进行袋装苗移栽。本发明采用独创的培养基成分，培养基使用定向聚丙烯薄膜袋作为培养皿器。茶苗繁殖快；可以脱除多种植物病毒，使原来的优良种性得到保持；种苗品质好、移栽成活率高；开花挂果快；出油高、油质优；丰产期长。具有操作性强，应用价值高，具有独创性，为油茶种苗繁殖开辟了一条新的快速繁殖，投产快的途径。

Description

大果红花油茶组织培养快速繁殖的育苗方法
技术领域
本发明涉及一种珍稀食用植物油种苗繁育方法，具体地说，涉及一种大果红花油茶的组织培养快速繁殖的育苗方法。 
背景技术
大果红花油茶属山茶科山茶属，为常绿小乔木，每年12月至次年3月开花，花果大，是生产食用油、观赏植物和荒山绿化的优良树种；秋季采果榨油。 
大果红花油茶经济价值大，全树是宝。油茶果实，是由果壳、种壳、种仁组成，比例为63.64∶14.38∶21.98，单果重在0.5～1.5公斤，干籽出油率在50～62％，树木叶片大而厚常绿，有利于涵养水源、保护生态环境。果壳可提取栲胶，制糠醛、碳酸钾、活性炭、木糠醇等，还可以与锯木屑搭配可做成食用菌培养基质。茶饼是油茶籽加工后的残渣，可提取粗茶油，提皂素，还应用于医药、农药、化肥、有机肥、饲料。茶油是天然木本油料之一，生长于野外山地，可不施任何化肥农药，不含普通茶油中的芥酸，不含豆油、花生油中的黄曲霉素、不含动物油中的高胆固醇，属纯天然绿色食品。精制茶油已被国内外营养学界、医疗界广泛公认富含油酸和亚油酸，富含多种氨基酸和维生素，对肝炎、高血压、肥胖症、心脑血管、动脉硬化、哮喘、胃溃疡等疾病具有疗效，长期食用有提高人体机能、延年益寿等功效，被誉为“油中之王”，成为最新的高级烹调食用油。是食、药并用的保健佳品。 
由于普通油茶分布范围广，油茶果小，结实率低，出油低，多含多酚、芥酸等不良物质；传统繁殖方法用实生苗和嫁接苗，育苗时间要2～3年，开花挂果投产慢，实生苗要种植10～15年才能开花挂果，嫁接苗也要6～7年才开花挂果。采用藤县天平镇罗漫村大果红花油茶原种源(原产地)作外植体进行组织细胞培养，培育成小苗，再培育成可移栽的中苗，本方法具有繁殖快，增殖达3倍以上，3～8个月可以成苗；移栽成活率高；基因不变异，能保持原来品种的优良性状；开花挂果快；出油高，油质优；丰产期长等特点。 
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过组织培养技术可以脱除多种植物病毒，避免病毒引起的品种退化和减产造成的损失，使原来的优良种性得到保持；繁殖快且量大、成苗快、种苗品 质好、移栽成活率高，品种遗传物质变异小，开花挂果快、出油高、油质优、丰产期长的大果红花油茶的种苗繁殖方法。 
本发明人通过选定的大果红花油茶树芽苞和叶片作为外植体，经消毒去掉杂质，将芽尖组织和叶片放在分化培养基上进行无菌培育成小植株，将诱导出的小植株切割后接入新的分化培养基中，多次继代采用分化培养，结果丛生芽数量多，生长快。再转移到壮苗培养基上培养，形成袋装苗，经过自然光照下炼苗后出袋栽培，移栽到营养杯中育中苗，成活率达到98％以上。经十三年摸索筛选，由于靠本发明人利用了培养基上培养出壮苗，终于找到适合细胞分化，壮苗的培养基作为发明点，从而实现了本发明。 
本发明的大果红花油茶组织培养快速繁殖的育苗方法，包括以下技术工艺步骤： 
1、一种大果红花油茶组织培养快速繁殖的育苗方法，其特征在于：采用大果红花油茶树芽苞和叶片作为外植体，消毒，配制分化培养基，壮苗培养基，用定向聚丙烯薄膜袋作为培养皿器，接种，培养，其技术工艺步骤如下， 
(1)采外植体，选定大果红花油茶树的嫩枝条剪下，连芽和叶片保湿保鲜采集，选取芽苞和嫩叶放清水冲洗，然后用饱和洗衣粉水清洗，再用流动的清水漂洗2～5分钟， 
(2)无菌分化，把漂洗干净的油茶树芽苞或嫩叶片作为外植体，在无菌接种室工作台上用72％～75％的酒精消毒10～15秒后，用无菌水冲洗2～5次后置于0.1％～0.2％的升汞中消毒8～15分钟，再用无菌水漂洗4～6次，去掉外表杂物。把所消毒的芽苞、叶片放到150倍以上的电子显微镜下，用解剖刀切割外表的杂物，清理外表杂物后取下最顶的芽尖0.2～0.25mm组织，用接种针接种到分化培养基上培养15～20天得到小植株，所述的分化培养基每升含椰子汁50～150ml，蔗糖15～45g，卡拉胶6～10g，肌醇50～150mg，甘氨酸1～3mg，烟酸0.1～0.35mg，D-泛酸钙0.1～0.54mg，吡哆辛盐酸0.2～3.5mg，生长素0.09～0.25mg，分裂素6BA0.1～0.3mg，羟烯腺嘌呤0.1～0.3mg，烯腺嘌呤0.01～0.03mg，其余为MS培养基中的1/2大量元素和微量元素成分， 
(3)快速增殖，培养15～20天后，将诱导出的小植株切割成0.3～0.5mm后接入新的分化培养基中，多次继代采用分化培养基，在每次转袋过程中，不断淘汰白化苗和污染袋苗，剪除枯黄叶片，经3～5次转袋培养后，得到的小植株再进行壮苗培养， 
(4)壮苗培养，将无菌分化增殖获得的小植株接种到壮苗培养基上培养60～80天得到小苗，所述的壮苗培养基每升含水解酪蛋白0.1～0.5g，蔗糖10～35g，卡拉胶6～10g，a-萘乙酸0.2～5.0mg，肌醇20～120mg，盐酸硫胺4.5～15mg，甘氨酸1.5～6.0mg，烟酸0.5～5.5mg， 吲哚丁酸0.1～3mg，D-泛酸钙1～6mg，吡哆辛盐酸0.4～1.5mg，生长素0.09～0.25mg，苹果汁10～15g，其余为MS培养基中的1/2大量元素和1/2微量元素成分。 
2、如权利要求1所述的大果红花油茶组织培养快速繁殖的育苗方法，其特征在于步骤(2)分化培养基每升含椰子汁100ml，蔗糖25～30g，卡拉胶8g，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.25mg，D-泛酸钙0.44mg，吡哆辛盐酸0.4～1.5mg，生长素0.09～0.25mg，分裂素6BA0.1mg，羟烯腺嘌呤0.2mg，烯腺嘌呤0.02mg， 其余为MS培养基中的1/2大量元素和微量元素成分。 
3、如权利要求1所述的大果红花油茶组织培养快速繁殖的育苗方法，其特征在于步骤(4)壮苗培养基每升含水解酪蛋白0.12g，蔗糖22g，卡拉胶8g，a-萘乙酸0.8mg，肌醇60mg，盐酸硫胺6mg，甘氨酸3.0mg，烟酸1.5mg，吲哚丁酸0.3mg，D-泛酸钙1.5mg，吡哆辛盐酸0.8mg，生长素0.12mg，苹果汁12g，其余为MS培养基中的1/2大量元素和1/2微量元素成分。 
4、如权利要求1所述的大果红花油茶组织培养快速繁殖的育苗方法，其特征在于步骤(2)～(4)中所用的培养基PH为4.5～7.5，培养温度18～32℃，每天光照6～16小时，光照度800～2500Lx，芽尖为芽苞生长点0.1～0.5mm组织，叶片为顶尖叶片1/2处0.1～0.8mm组织，小植株的高度最好为1～3cm，小苗最好为苗高3～8cm，每株苗有2～8条根，无变异苗，白化苗。 
5、如权利要求1所述的大果红花油茶组织培养快速繁殖的育苗方法，其特征在于步骤(2)～(4)中所用的培养基均分装入薄膜袋中，每袋20ml，分装好后密封、高温消毒10～20分钟，取出放在无菌室降温贮存，在无菌室的超净工作台上接上对应的外植体或小植株后，用封口机把接好种的培养基袋封口，再放到培养室培养，培养基分装的薄膜袋，均为定向聚丙烯薄膜袋。 
6、如权利要求1所述的大果红花油茶组织培养快速繁殖的育苗方法，其特征在于步骤(4)当小苗形成的植株长至3～8厘米时，将培养袋苗转移到自然光下炼苗7～14天，然后将其从袋中取出，洗净根部的培养基，移至装有营养土的营养杯栽培，经2～8个月生长得到中苗，成为生产栽培的种苗。 
7、如权利要求1所述的大果红花油茶组织培养快速繁殖的育苗方法，其特征在于中苗最好为苗高50cm以上，每株苗有分枝2～8条，有3～10条根以上，须根多，叶片厚浓绿，无病虫，无变异苗，白化苗。 
本发明与现有技术相比具有的优点是：国内外没有关于利用组培技术生产油茶类种苗的专利和相关报道，只有实生苗和嫁接育苗繁殖的应用。本发明采用独创的培养基，使用定向聚丙烯薄膜袋作培养器皿，降低成本，可以脱除多种植物病毒，避免病毒引起的品种退化和减产造成的损失，使原来的优良种性得到保持；繁殖快且量大、成苗快、种苗品质好、移栽成活率高，品种遗传物质变异小，开花挂果快、出油高、油质优、丰产期长。本发明具有操作性强，应用价值高，环保，对环境无任何不良影响，具有独创性等特点。 
具体实施方式
本发明的最佳实施例是这样的，以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制： 
实施例1 
(1)采外植体：选用广西藤县天平镇罗漫村大果红花油茶百年老茶树的嫩枝条剪下，连芽和叶片保湿保鲜采回，选取芽苞放清水冲洗，然后用洗衣粉水清洗，再用流动的清水漂洗。 
(2)无菌分化：把漂洗干净的油茶树芽苞作为外植体，在无菌接种室工作台上用72％～75％的酒精消毒10～15秒后，用无菌水冲洗2～5次后置于0.1％～0.2％的升汞中消毒8～15分钟，再用无菌水漂洗4～6次，去掉外表杂物。把所消毒的芽苞放到150倍以上的电子显微镜下，用解剖刀切割外表的杂物，清理外表杂物后用接种针将芽尖0.2～0.25mm组织接种到分化培养基上培养得到小植株。所述的分化培养基每升含椰子汁100ml、蔗糖25～30g、卡拉胶8g、肌醇100mg、甘氨酸2mg、烟酸0.25mg、D-泛酸钙0.44mg、吡哆辛盐酸0.4～1.5mg、生长素0.09～0.25mg、分裂素6BA0.1mg、羟烯腺嘌呤0.2mg、烯腺嘌呤0.02mg，其余为MS培养基中的1/2大量元素和微量元素成分。 
(3)壮苗培养：将无菌分化获得的小植株接种到壮苗培养基上培养得到小苗。所述的壮苗培养基每升含水解酪蛋白0.1～0.5g，蔗糖20～25g，卡拉胶8g，a-萘乙酸0.5～3.0mg，肌醇40～100mg，盐酸硫胺4.5～12mg，甘氨酸1.5～4.0mg，烟酸1.0～2.5mg，吲哚丁酸0.3mg，D-泛酸钙1.5mg，吡哆辛盐酸0.4～1.5mg，生长素0.09～0.25mg，苹果汁10～15g，其余为MS培养基中的1/2大量元素和1/2微量元素成分。 
(4)袋装苗移栽：当小苗形成的植株长至4～6厘米时，将培养袋苗转移到自然光下炼苗7～14天，然后将其从袋中取出，洗净根部的培养基，移至装有营养土的营养杯栽培，得到中苗，成为生产栽培的种苗。 
在上述(2)～(3)各步骤中所用的培养基均为PH5.4～5.8，培养温度24～28℃，每天光照 10～12小时，光照度1500～2000Lx。 
步骤(1)所述的采外植体为当年开花成年树嫩枝条的芽苞。 
步骤(2)所述的芽尖为芽苞生长点。 
步骤(2)所述的小植株的高度最好为1～2cm。 
步骤(3)所述的小苗最好为苗高4～6cm，每株苗有3～5条根。 
实施例2 
(1)采外植体：选用广西藤县天平镇罗漫村大果红花油茶百年老茶树的嫩枝条剪下，连芽和叶片保湿保鲜采回，选取嫩叶放清水冲洗，然后用洗衣粉水清洗，再用流动的清水漂洗。 
(2)无菌分化：把漂洗干净的油茶树嫩叶片作为外植体，在无菌接种室工作台上用72％～75％的酒精消毒10秒，用无菌水冲洗2～5次后，置于0.1％的升汞中消毒5～15分钟，再用无菌水漂洗4～6次。把所消毒的叶片放到150倍以上的电子显微镜下，用解剖刀切割嫩叶叶尖下1/2处0.3～0.5mm组织，接种到分化培养基上培养得到小植株。所述的分化培养基每升含椰子汁120ml、蔗糖22～30g、卡拉胶7～8g、肌醇100mg、甘氨酸2mg、烟酸0.25mg、D-泛酸钙0.44mg、吡哆辛盐酸0.4～1.5mg、生长素0.09～0.25mg、分裂素6BA0.2mg、羟烯腺嘌呤0.2mg、烯腺嘌呤0.03mg，其余为MS培养基中的1/2大量元素和微量元素成分。 
(3)壮苗培养：将无菌分化获得的小植株接种到壮苗培养基上培养得到小苗。所述的壮苗培养基每升含水解酪蛋白0.1～0.5g，蔗糖20～25g，卡拉胶8g，a-萘乙酸0.5～3.0mg，肌醇40～100mg，盐酸硫胺4.5～12mg，甘氨酸1.5～4.0mg，烟酸1.0～2.5mg，吲哚丁酸0.2mg，D-泛酸钙1.5mg，吡哆辛盐酸0.4～1.5mg，生长素0.09～0.25mg，苹果汁25g，其余为MS培养基中的大量元素和1/2微量元素成分。 
(4)袋装苗移栽：当小苗形成的植株长至4～6厘米时，将培养袋苗转移到自然光下炼苗7～14天，然后将其从袋中取出，洗净根部的培养基，移至装有营养土的营养杯栽培，得到中苗，成为生产栽培的种苗。 
在上述(2)～(3)各步骤中所用的培养基均为PH5.4～6.1，培养温度24～30℃，每天光照10小时，光照度1500～2000Lx。 
步骤(1)所述的采外植体为当年开花成年树嫩枝条的叶片。 
步骤(2)所述的叶片为顶尖叶片1/2处0.3～0.5mm组织。 
步骤(2)所述的小植株的高度最好为1～2cm。 
步骤(3)所述的小苗最好为苗高4～6cm，每株苗有3～5条根。 
实施例3 
(1)采外植体：选用江西省种植的大果红花油茶树的嫩枝条剪下，连芽和叶片保湿保鲜采回，选取芽苞放清水冲洗，然后用洗衣粉水清洗，再用流动的清水漂洗。 
(2)无菌分化：把漂洗干净的油茶树芽苞作为外植体，在无菌接种室工作台上用71％～76％的酒精消毒15秒后，用无菌水冲洗2～5次后置于0.2％的升汞中消毒7～15分钟，再用无菌水漂洗4～6次，去掉外表杂物。把所消毒的芽苞放到150倍以上的电子显微镜下，用解剖刀切割外表的杂物，清理外表杂物后用接种针将芽尖0.3mm组织接种到分化培养基上培养得到小植株。所述的分化培养基每升含椰子汁100ml、蔗糖25～30g、卡拉胶8g、肌醇100mg、甘氨酸2mg、烟酸0.25mg、D-泛酸钙0.44mg、吡哆辛盐酸0.4～1.5mg、生长素0.09～0.25mg、分裂素6BA0.1mg、羟烯腺嘌呤0.25mg、烯腺嘌呤0.03mg，其余为MS培养基中的大量元素和微量元素成分。 
(3)壮苗培养：将无菌分化获得的小植株接种到壮苗培养基上培养得到小苗。所述的壮苗培养基每升含水解酪蛋白0.1～0.5g，蔗糖20～25g，卡拉胶8g，a-萘乙酸0.5～3.0mg，肌醇40～120mg，盐酸硫胺4.5～12mg，甘氨酸1.5～5.0mg，烟酸1.0～2.5mg，吲哚丁酸0.6mg，D-泛酸钙1.5mg，吡哆辛盐酸0.4～1.5mg，生长素0.09～0.25mg，苹果汁10～35g，其余为MS培养基中的1/2大量元素和1/2微量元素成分。 
(4)袋装苗移栽：当小苗形成的植株长至4～6厘米时，将培养袋苗转移到自然光下炼苗7～14天，然后将其从袋中取出，洗净根部的培养基，移至装有营养土的营养杯栽培，得到中苗，成为生产栽培的种苗。 
在上述(2)～(3)各步骤中所用的培养基均为PH5.4～6.0，培养温度23～29℃，每天光照12小时，光照度1500～2000Lx。 
步骤(1)所述的采外植体为当年开花成年树嫩枝条的芽苞。 
步骤(2)所述的芽尖为芽苞生长点。 
步骤(2)所述的小植株的高度最好为1～3cm。 
步骤(3)所述的小苗最好为苗高4～8cm，每株苗有3～8条根。 
实施例4。 
(1)采外植体：选用广西玉林市容县种植的大果红花油茶树的嫩枝条剪下，连芽和叶片保湿保鲜采回，选取芽苞放清水冲洗，然后用洗衣粉水清洗，再用流动的清水漂洗。 
(2)无菌分化：把漂洗干净的油茶树芽苞作为外植体，在无菌接种室工作台上用72％～ 75％的酒精消毒10～15秒后，用无菌水冲洗2～5次后置于0.1％～0.2％的升汞中消毒8～15分钟，再用无菌水漂洗4～6次，去掉外表杂物。把所用消毒的芽苞、叶片放到150倍以上的电子显微镜下，用解剖刀切割外表的杂物，清理外表杂物后用接种针将芽尖0.2～0.25mm组织接种到分化培养基上培养得到小植株。所述的分化培养基每升含椰子汁100ml、蔗糖25～30g、卡拉胶8g、肌醇100mg、甘氨酸2mg、烟酸0.25mg、D-泛酸钙0.44mg、吡哆辛盐酸0.4～1.5mg、生长素0.09～0.25mg、分裂素6BA0.1mg、羟烯腺嘌呤0.2mg、烯腺嘌呤0.02mg，其余为MS培养基中的1/2大量元素和微量元素成分。 
(3)壮苗培养：将无菌分化获得的小植株接种到壮苗培养基上培养得到小苗。所述的壮苗培养基每升含水解酪蛋白0.1～0.5g，蔗糖20～25g，卡拉胶8g，a-萘乙酸0.5～3.0mg，肌醇50～120mg，盐酸硫胺4.5～12mg，甘氨酸2.5～5.5mg，烟酸2.0～3.5mg，吲哚丁酸0.55mg，D-泛酸钙1.5mg，吡哆辛盐酸0.4～1.5mg，生长素0.1～0.35mg，苹果汁35g，其余为MS培养基中的1/2大量元素和1/2微量元素成分。 
(4)袋装苗移栽：当小苗形成的植株长至4～6厘米时，将培养袋苗转移到自然光下炼苗7～14天，然后将其从袋中取出，洗净根部的培养基，移至装有营养土的营养杯栽培，得到中苗，成为生产栽培的种苗。 
在上述(2)～(3)各步骤中所用的培养基均为PH5.5～6.0，培养温度24～30℃，每天光照12小时，光照度1500～2200Lx。 
步骤(1)所述的采外植体为当年开花成年树嫩枝条的芽苞。 
步骤(2)所述的芽尖为芽苞生长点。 
步骤(2)所述的小植株的高度最好为1～2cm。 
步骤(3)所述的小苗最好为苗高4～6cm，每株苗有5条根。 
实施例5 
(1)采外植体：选用广西藤县天平镇罗漫村大果红花油茶百年老茶树的嫩枝条剪下，连芽和叶片保湿保鲜采回，选取芽苞放清水冲洗，然后用洗衣粉水清洗，再用流动的清水漂洗。 
(2)无菌分化：把漂洗干净的油茶树芽苞作为外植体，在无菌接种室工作台上用72％～75％的酒精消毒10～15秒后，用无菌水冲洗2～5次后置于0.1％～0.2％的升汞中消毒8～15分钟，再用无菌水漂洗4～6次，去掉外表杂物。把所用消毒的芽苞、叶片放到150倍以上的电子显微镜下，用解剖刀切割外表的杂物，清理外表杂物后用接种针将芽尖0.2～0.25mm组织接种到分化培养基上培养得到小植株。所述的分化培养基每升含椰子汁100ml、蔗糖25～ 30g、卡拉胶8g、肌醇100mg、甘氨酸2mg、烟酸0.25mg、D-泛酸钙0.44mg、吡哆辛盐酸0.4～1.5mg、生长素0.09～0.25mg、分裂素6BA0.1mg、羟烯腺嘌呤0.2mg、烯腺嘌呤0.02mg，其余为MS培养基中的1/2大量元素和微量元素成分。 
(3)快速增殖：培养15～20天后，将诱导出的小植株切割后接入新的分化培养基中，结果丛生芽数量多，生长快。多次继代采用分化培养基。在每次转袋过程中，应切除顶端优势，且丛生芽块不能切得太小，以免影响增殖速度。同时，应不断淘汰白化苗和污染袋苗，剪除枯黄叶片，经几次转袋后，增殖速度可达2.5～3倍。 
(4)壮苗培养：将培养增殖获得的小植株接种到壮苗培养基上培养得到小苗。所述的壮苗培养基每升含水解酪蛋白0.1～0.5g，蔗糖20～25g，卡拉胶8g，a-萘乙酸0.5～3.0mg，肌醇40～100mg，盐酸硫胺4.5～12mg，甘氨酸1.5～4.0mg，烟酸1.0～2.5mg，吲哚丁酸0.3mg，D-泛酸钙1.5mg，吡哆辛盐酸0.4～1.5mg，生长素0.09～0.25mg，苹果汁10～15g，其余为MS培养基中的1/2大量元素和1/2微量元素成分。 
(5)袋装苗移栽：当小苗形成的植株长至4～6厘米时，将培养袋苗转移到自然光下炼苗7～14天，然后将其从袋中取出，洗净根部的培养基，移至装有营养土的营养杯栽培，经2～4个月得到中苗，成为生产栽培的种苗。 
在上述(2)～(3)各步骤中所用的培养基均为PH5.4～5.8，培养温度24～28℃，每天光照10～12小时，光照度1500～2000Lx。 
步骤(1)所述的采外植体为当年开花成年树嫩枝条的芽苞。 
步骤(2)所述的芽尖为芽苞生长点。 
步骤(2)所述的小植株的高度最好为1～2cm。 
步骤(3)～(4)所述的小苗最好为苗高4～6cm，每株苗有3～5条根。 
步骤(5)所述的中苗最好为苗高50cm以上，每株苗有8条根以上，须根多。 

Claims (4)

1.一种大果红花油茶组织培养快速繁殖的育苗方法，其特征在于：采用大果红花油茶树芽苞作为外植体，消毒，配制分化培养基，壮苗培养基，用定向聚丙烯薄膜袋作为培养皿器，接种，培养，其技术工艺步骤如下，
(1)采外植体，选定大果红花油茶树的嫩枝条剪下，连芽和叶片保湿保鲜采集，选取芽苞和嫩叶放清水冲洗，然后用饱和洗衣粉水清洗，再用流动的清水漂洗2～5分钟，
(2)无菌分化，把漂洗干净的油茶树芽苞作为外植体，在无菌接种室工作台上用72％～75％的酒精消毒10～15秒后，用无菌水冲洗2～5次后置于0.1％～0.2％的升汞中消毒8～15分钟，再用无菌水漂洗4～6次，去掉外表杂物，把所消毒的芽苞放到150倍以上的电子显微镜下，用解剖刀切割外表的杂物，清理外表杂物后取下最顶的芽尖0.2～0.25mm组织，用接种针接种到分化培养基上培养15～20天得到小植株，所述的分化培养基每升含椰子汁50～150ml，蔗糖15～45g，卡拉胶6～10g，肌醇50～150mg，甘氨酸1～3mg，烟酸0.1～0.35mg，D-泛酸钙0.1～0.54mg，吡哆辛盐酸0.2～3.5mg，生长素0.09～0.25mg，分裂素6BA0.1～0.3mg，羟烯腺嘌呤0.1～0.3mg，烯腺嘌呤0.01～0.03mg，其余为MS培养基中的1/2大量元素和微量元素成分，
(3)快速增殖，培养15～20天后，将诱导出的小植株切割成0.3～0.5mm后接入新的分化培养基中，多次继代采用分化培养基，在每次转袋过程中，不断淘汰白化苗和污染袋苗，剪除枯黄叶片，经3～5次转袋培养后，得到的小植株再进行壮苗培养，
(4)壮苗培养，将无菌分化增殖获得的小植株接种到壮苗培养基上培养60～80天得到小苗，所述的壮苗培养基每升含水解酪蛋白0.1～0.5g，蔗糖10～35g，卡拉胶6～10g，a-萘乙酸0.2～5.0mg，肌醇20～120mg，盐酸硫胺4.5～15mg，甘氨酸1.5～6.0mg，烟酸0.5～5.5mg，吲哚丁酸0.1～3mg，D-泛酸钙1～6mg，吡哆辛盐酸0.4～1.5mg，生长素0.09～0.25mg，苹果汁10～15g，其余为MS培养基中的1/2大量元素和1/2微量元素成分，
在上述(2)～(4)各步骤中所用的培养基均为pH5.4～6.1，培养温度24～30℃，每天光照10小时，光照度1500～2000Lx，所述的小植株的高度为1～2cm，所述的小苗为苗高4～6cm，每株苗有3～5条根。
2.如权利要求1所述的大果红花油茶组织培养快速繁殖的育苗方法，其特征在于步骤(2)分化培养基每升含椰子汁100ml，蔗糖28g，卡拉胶8g，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.25mg，D-泛酸钙0.44mg，吡哆辛盐酸1.2mg，生长素0.15mg，分裂素6BA0.1mg，羟烯腺嘌呤0.2mg，烯腺嘌呤0.02mg，其余为MS培养基中的1/2大量元素和微量元素成分。
3.如权利要求1所述的大果红花油茶组织培养快速繁殖的育苗方法，其特征在于步骤(4)壮苗培养基每升含水解酪蛋白0.12g，蔗糖22g，卡拉胶8g，a-萘乙酸0.8mg，肌醇60mg，盐酸硫胺6mg，甘氨酸3.0mg，烟酸1.5mg，吲哚丁酸0.3mg，D-泛酸钙1.5mg，吡哆辛盐酸0.8mg，生长素0.12mg，苹果汁12g，其余为MS培养基中的1/2大量元素和1/2微量元素成分。
4.如权利要求1所述的大果红花油茶组织培养快速繁殖的育苗方法，其特征在于步骤(2)～(4)中所用的培养基均分装入薄膜袋中，每袋20ml，分装好后密封、高温消毒10～20分钟，取出放在无菌室降温贮存，在无菌室的超净工作台上接上对应的外植体或小植株后，用封口机把接好种的培养基袋封口，再放到培养室培养，培养基分装的薄膜袋，均为定向聚丙烯薄膜袋。
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