CN102696579A - 一种石斛原球茎包埋玻璃化法超低温保存方法 - Google Patents

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本发明公开了一种石斛原球茎包埋玻璃化法超低温保存方法：取幼嫩石斛原球茎在预培养基中，4℃下黑暗培养7天后分别用褐藻酸钠包埋液和钙离子包埋液进行包埋，将石斛原球茎的包埋颗粒置于质量浓度60%的PVS2混合溶液中，0℃下处理30~60min，移去PVS2混合溶液，加入PVS2溶液，0℃下平衡2~3h，将装载后的包埋颗粒迅速置于液氮中保存在冷冻管中；使用时，将液氮中保存的冷冻管取出，解冻后的包埋颗粒置于MS基本培养基中可恢复培养，实现所述石斛种子的超低温保存；本发明可以有效降低玻璃化法带来的二甲基亚砜对组织的毒害，能较好的保存石斛种质资源，减少多次继代培养过程中产生的突变和生长活力下降等问题。

Description

一种石斛原球茎包埋玻璃化法超低温保存方法
（一）技术领域
本发明涉及植物组织超低温保存方法，特别涉及一种石斛原球茎包埋玻璃化法超低温保存方法。
（二）背景技术
石斛兰属是兰科植物中的第二大家族，为多年生草本植物。原产地主要分布在亚热带和热带地区，共有1000多个种，其中我国有约76种。石斛兰花姿有没。花色艳丽，花期较长，且大部分都有芳香性。是深受人们喜爱的观赏花卉。同时石斛兰有着极高的药用价值。我国76个种的石斛兰在那个有40种可做药用。其中比较著名的有金钗石斛、铁皮石斛和霍山石斛等。古籍上记载石斛具有强阴益精，补肾益力，轻身延年等作用，此外还有益胃生津，滋阴清热，止咳润肺的功效。现代研究也表明石斛中含有抗肿瘤，抗衰老和增加人体免疫力的成分。
但是石斛兰本身繁殖能力极弱，石斛果实种子量大，无胚乳，在野生条件下必须与特定的兰菌结合才能萌发。加上花卉市场和药用市场对石斛兰的需求日益增加，似的野生资源被过度采伐，使得石斛已被列为濒危物种，采用石斛兰组织培养技术成为石斛兰大量繁殖的主要手段，但是长期继代培养导致种质资源流失，子代生长力下降等问题，形态发生能力和遗传稳定性下降。因此石斛兰超低温保存技术成为石斛种质资源保存和保护濒危物种的关键办法。
（三）发明内容
本发明目的是提供一种石斛原球茎包埋玻璃化法超低温保存方法，为石斛兰的种子资源保存提供理论和技术支持。
本发明采用的技术方案是：
一种石斛原球茎包埋玻璃化法超低温保存方法，所述方法为：
（1）预处理：取直径为3~4mm的幼嫩石斛原球茎，置于预培养基中，4℃下黑暗培养7天，获得预培养后的石斛原球茎；所述预培养基为添加终浓度4g/L琼脂粉、终浓度0.4mol/L山梨醇或蔗糖的1/2MS培养液；
（2）两步法包埋：将步骤（1）预培养后的石斛原球茎在褐藻酸钠包埋液中室温下浸泡20min，再移取石斛原球茎和褐藻酸钠包埋液的混合液置于钙离子包埋液中室温下浸泡2~3h，获得石斛原球茎的包埋颗粒；所述褐藻酸钠包埋液为添加终浓度20g/L褐藻酸钠、终浓度2mol/L甘油和质量终浓度4~5%高渗溶质a的MS基本培养液，所述高渗溶质a为蔗糖、二甲基亚砜或山梨醇；所述钙离子包埋液为添加终浓度0.3mol/L氯化钙和质量终浓度4~5%高渗溶质b的1/2MS培养液，所述高渗溶质b为蔗糖、二甲基亚砜或山梨醇；
（3）两步法装载：将步骤（2）石斛原球茎的包埋颗粒置于质量浓度60%的PVS2（玻璃化溶液）混合溶液中，0℃下处理30~60min（优选60min），移去PVS2混合溶液，加入PVS2溶液，再在0℃下平衡2~3h（优选2h），获得装载后的包埋颗粒；所述质量浓度60%的PVS2混合溶液为PVS2溶液与MS基本培养液以体积比3:2的混合溶液，所述PVS2溶液质量终浓度组成为：0.4mol/L蔗糖、体积浓度30%甘油、体积浓度15%二甲基亚砜和体积浓度15%乙二醇，溶剂为水；
（4）冷冻：将步骤（3）获得装载后的包埋颗粒装入冷冻管中，每管3~5个，将冷冻管迅速置于液氮中保存；使用时，将液氮中保存的冷冻管取出，解冻后的包埋颗粒置于MS基本培养基中可恢复培养，实现所述石斛种子的超低温保存。
进一步，步骤（1）所述幼嫩石斛原球茎优选为金钗石斛原球茎，所述石斛幼嫩原球茎的获得方法为：采用石斛组织（本发明优选金钗石斛组织，取自《一种诱导石斛原球茎发生的方法》(申请号：201110445130.2)）方法诱导培养的，增殖30d左右的原球茎，取直径3~4cm的幼幼嫩原球茎进行包埋玻璃化法超低温保存。
进一步，步骤（2）所述褐藻酸钠包埋液为添加质量终浓度20g/L褐藻酸钠、终浓度2mol/L甘油和质量终浓度4%山梨醇的MS基本培养液。
进一步，步骤（2）所述钙离子包埋液为添加终浓度33.3g/L氯化钙和质量终浓度4%山梨醇的1/2MS培养液。
进一步，步骤（3）所述方法优选为：将步骤（2）石斛原球茎的包埋颗粒置于质量浓度60%的PVS2混合溶液中，0℃下处理60min，移去PVS2混合溶液，加入PVS2溶液，再在0℃下平衡2~3h（优选2h），获得装载后的包埋颗粒。
本发明所述1/2MS培养液终浓度组成为硝酸铵1650mg/L，硝酸钾1900mg/L，二水氯化钙440mg/L，MgSO4·7H2O 370mg/L，KH2PO4170mg/L，KI 0.83mg/L，H3BO3 6.2mg/L，MnSO4·4H2O 22.3mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6mg/L，NaMoO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，NaEDTA·2H2O 37.3mg/L，肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，烟酸吡哆醇（B6）0.5mg/L，烟酸硫胺素（B1）0.1mg/L，甘氨酸2mg/L，溶剂为水。
本发明所述MS基本培养液终浓度组成为硝酸铵3300mg/L，硝酸钾3800mg/L，二水氯化钙880mg/L，MgSO4·7H2O 740mg/L，KH2PO4340mg/L，KI 1.96mg/L，H3BO3 12.4mg/L，MnSO4·4H2O 44.6mg/L，ZnSO4·7H2O 17.2mg/L，NaMoO4·2H2O 0.5mg/L，CuSO4·5H2O 0.05mg/L，CoCl2·6H2O 0.05mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，NaEDTA·2H2O 37.3mg/L，肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，烟酸吡哆醇（B6）0.5mg/L，烟酸硫胺素（B1）0.1mg/L，甘氨酸2mg/L，溶剂为水。
本发明所述超低温保存的石斛种子的解冻及恢复培养方法为：
解冻：将液氮中保存的冷冻管取出，在40℃水浴中解冻，取出包埋颗粒，并用25℃预热的去离子水冲洗包埋颗粒表面，再在高渗MS液体培养基中润洗3次，获得解冻后的包埋颗粒，所述高渗MS液体培养基为添加质量终浓度3.5%蔗糖或质量终浓度4%山梨醇的MS基本培养基。
恢复培养：将上述解冻后的包埋颗粒置于MS基本培养基中，25℃、黑暗条件下培养7d，获得恢复后的石斛原球茎。
本发明所述高渗溶质a和高渗溶质b均为高渗溶质，为便于区分不同步骤所用高渗溶质不同而命名，字母a和b本身没有含义。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明可以有效降低玻璃化法带来的二甲基亚砜对组织的毒害，能较好的保存石斛种质资源，减少多次继代培养过程中产生的突变和生长活力下降等问题。
（四）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
1/2MS培养液终浓度组成为：硝酸铵1650mg/L，硝酸钾1900mg/L，二水氯化钙440mg/L，MgSO4·7H2O 370mg/L，KH2PO4 170mg/L，KI 0.83mg/L，H3BO3 6.2mg/L，MnSO4·4H2O 22.3mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6mg/L，NaMoO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，CoCl2·6H2O0.025mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，NaEDTA·2H2O 37.3mg/L，肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，烟酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L，溶剂为水。
MS基本培养液终浓度组成为：硝酸铵3300mg/L，硝酸钾3800mg/L，二水氯化钙880mg/L，MgSO4·7H2O 740mg/L，KH2PO4 340mg/L，KI 1.96mg/L，H3BO3 12.4mg/L，MnSO4·4H2O 44.6mg/L，ZnSO4·7H2O 17.2mg/L，NaMoO4·2H2O 0.5mg/L，CuSO4·5H2O 0.05mg/L，CoCl2·6H2O 0.05mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，NaEDTA·2H2O 37.3mg/L，肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，烟酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L，溶剂为水。
实施例1
（1）石斛原球茎的获得：通过金钗石斛组织原球茎诱导技术获得增殖30d的无菌石斛原球茎（参见申请号为201110445130.2的专利申请），获得直径3~4cm的幼嫩原球茎。
（2）预培养：将上述方法获得的幼嫩原球茎置于预培养基中，4℃下黑暗培养7天，获得预培养后的石斛原球茎；所述预培养基为添加终浓度4g/L琼脂粉和终浓度0.4mol/L山梨醇的1/2MS培养液，pH5.8；
（3）两步法包埋：将步骤（2）将预培养后的石斛原球茎在褐藻酸钠包埋液中室温（25℃）下浸泡20min，再移取石斛原球茎和褐藻酸钠包埋液的混合液置于钙离子包埋液中室温下浸泡2h，获得石斛原球茎的包埋颗粒；所述褐藻酸钠包埋液为添加质量终浓度20g/L褐藻酸钠、2mol/L甘油和质量终浓度4%山梨醇（即山梨醇终浓度为74g/L）的MS基本培养液；所述钙离子包埋液为添加终浓度0.3mol/L氯化钙和质量终浓度4%山梨醇（即山梨醇终浓度为74g/L）的1/2MS培养液；
（4）两步法装载：将步骤（3）石斛原球茎的包埋颗粒置于质量浓度60%的PVS2混合溶液中，0℃下处理60min，移去PVS2混合溶液，加入PVS2溶液，再在0℃下平衡2h，获得装载后的包埋颗粒；所述质量浓度60%的PVS2混合溶液为PVS2溶液与MS基本培养液以体积比3:2的混合溶液，所述PVS2溶液质量终浓度组成为：0.4mol/L蔗糖、体积终浓度30%甘油、体积终浓度15%二甲基亚砜和体积终浓度15%乙二醇，溶剂为水；
（5）冷冻：将步骤（4）获得装载后的包埋颗粒装入冷冻管中，每管3~5颗，迅速置于液氮中，实现所述石斛种子的超低温保存。
（6）解冻：将上述液氮中保存的冷冻管取出，在40℃水浴中解冻，取出包埋颗粒，并用25℃预热的去离子水冲洗包埋颗粒表面，再在高渗MS液体培养基中润洗3次，获得解冻后的包埋颗粒；所述高渗MS液体培养基为添加质量终浓度4%山梨醇的MS基本培养基。
（7）恢复培养：将上述解冻后的包埋颗粒置于MS基本培养基中，25℃、黑暗条件下培养7d，获得恢复后的石斛原球茎。
实施例2
一种利用包埋玻璃化法对石斛原球茎进行超低温保存的方法：
（1）原球茎的获得：通过金钗石斛组织原球茎诱导技术获得增殖30d的无菌石斛原球茎（获取方法同实施例1），获得直径3~4cm的幼嫩原球茎。
（2）预培养：预培养基为添加终浓度4g/L琼脂粉和终浓度0.4mol/L蔗糖的1/2MS培养液，pH5.8，其它操作同实施例1步骤（2），获得预培养后的石斛原球茎；
（3）两步法包埋：所述褐藻酸钠包埋液为添加质量终浓度20g/L褐藻酸钠、2mol/L甘油和质量终浓度4%（即40g/L）蔗糖的MS基本培养液；所述钙离子包埋液为添加终浓度0.3mol/L氯化钙和质量终浓度4%（即40g/L）蔗糖的1/2MS培养液；其它操作同实施例1步骤（3），获得石斛原球茎的包埋颗粒；
（4）两步法装载：所述PVS2溶液质量终浓度组成为：0.4mol/L蔗糖、体积终浓度30%甘油、体积终浓度15%二甲基亚砜和体积终浓度15%乙二醇，溶剂为水；其它操作同实施例1，获得装载后的包埋颗粒；
（5）冻存：操作同实施例1；
（6）解冻：所述高渗MS液体培养基为添加质量终浓度3.5%（即35g/L）蔗糖的MS基本培养基，其它操作同实施例1。
（7）恢复培养：将上述解冻后的包埋颗粒置于MS基本培养基中，25℃、黑暗条件下培养7d，获得恢复后的石斛原球茎。

Claims (8)

1.一种石斛原球茎包埋玻璃化法超低温保存方法，其特征在于：所述方法为：
（1）预处理：取直径为3~4mm的幼嫩石斛原球茎，置于预培养基中，4℃下黑暗培养7天，获得预培养后的石斛原球茎；所述预培养基为添加4g/L琼脂粉、0.4mol/L山梨醇或蔗糖的1/2MS培养液；
（2）两步法包埋：将步骤（1）预培养后的石斛原球茎在褐藻酸钠包埋液中室温下浸泡20min，再移取石斛原球茎和褐藻酸钠包埋液的混合液置于钙离子包埋液中室温下浸泡2~3h，获得石斛原球茎的包埋颗粒；所述褐藻酸钠包埋液为添加终浓度20g/L褐藻酸钠、终浓度2mol/L甘油和质量终浓度4~5%高渗溶质a的MS基本培养液，所述高渗溶质a为蔗糖、二甲基亚砜或山梨醇；所述钙离子包埋液为添加终浓度0.3mol/L氯化钙和质量终浓度4~5%高渗溶质b的1/2MS培养液，所述高渗溶质b为蔗糖、二甲基亚砜或山梨醇；
（3）两步法装载：将步骤（2）石斛原球茎的包埋颗粒置于质量浓度60%的PVS2混合溶液中，0℃下处理30~60min，移去PVS2混合溶液，加入PVS2溶液，再在0℃下平衡2~3h，获得装载后的包埋颗粒；所述质量浓度60%的PVS2混合溶液为PVS2溶液与MS基本培养液以体积比3:2的混合溶液，所述PVS2溶液的质量终浓度组成为：0.4mol/L蔗糖、体积终浓度30%甘油、体积终浓度15%二甲基亚砜和体积终浓度15%乙二醇，溶剂为水；
（4）冷冻：将步骤（3）获得装载后的包埋颗粒保存在冷冻管中迅速置于液氮中；使用时，将液氮中保存的冷冻管取出，解冻后的包埋颗粒置于MS基本培养基中可恢复培养，实现所述石斛种子的超低温保存。
2.如权利要求1所述的石斛种子包埋玻璃化法超低温保存方法，其特征在于：步骤（1）所述幼嫩石斛原球茎为金钗石斛原球茎。
3.如权利要求1所述的石斛种子包埋玻璃化法超低温保存方法，其特征在于：步骤（2）所述褐藻酸钠包埋液为添加质量终浓度20g/L褐藻酸钠、终浓度2mol/L甘油和质量终浓度4%山梨醇的MS基本培养液。
4.如权利要求1所述的石斛种子包埋玻璃化法超低温保存方法，其特征在于：步骤（2）所述钙离子包埋液为添加终浓度0.3mol/L氯化钙和质量终浓度4%山梨醇的1/2MS培养液。
5.如权利要求1所述的石斛种子包埋玻璃化法超低温保存方法，其特征在于：步骤（3）所述方法为：将步骤（2）石斛原球茎的包埋颗粒置于质量浓度60%的PVS2混合溶液中，0℃下处理60min，移去PVS2混合溶液，加入PVS2溶液，再在0℃下平衡2~3h，获得装载后的包埋颗粒。
6.如权利要求1所述的石斛种子包埋玻璃化法超低温保存方法，其特征在于：所述1/2MS培养液终浓度组成为硝酸铵1650mg/L，硝酸钾1900mg/L，二水氯化钙440mg/L，MgSO4·7H2O 370mg/L，KH2PO4 170mg/L，KI 0.83mg/L，H3BO3 6.2mg/L，MnSO4·4H2O 22.3mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6mg/L，NaMoO4·2H2O0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，NaEDTA·2H2O 37.3mg/L，肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，烟酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L，溶剂为水。
7.如权利要求1所述的石斛种子包埋玻璃化法超低温保存方法，其特征在于：所述MS基本培养液终浓度组成为硝酸铵3300mg/L，硝酸钾3800mg/L，二水氯化钙880mg/L，MgSO4·7H2O 740mg/L，KH2PO4 340mg/L，KI 1.96mg/L，H3BO3 12.4mg/L，MnSO4·4H2O 44.6mg/L，ZnSO4·7H2O 17.2mg/L，NaMoO4·2H2O 0.5mg/L，CuSO4·5H2O 0.05mg/L，CoCl2·6H2O 0.05mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，NaEDTA·2H2O 37.3mg/L，肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，烟酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L，溶剂为水。
8.如权利要求1所述的石斛种子包埋玻璃化法超低温保存方法，其特征在于步骤（4）使用时，将液氮中保存的冷冻管取出，在40℃水浴中解冻，取出包埋颗粒，并用25℃预热的去离子水冲洗包埋颗粒表面，再在高渗MS液体培养基中润洗3次，获得解冻后的包埋颗粒；再将上述解冻后的包埋颗粒置于MS基本培养基中，25℃、黑暗条件下培养7d，获得恢复后的石斛原球茎；所述高渗MS液体培养基为添加质量终浓度3.5%蔗糖或质量终浓度4%山梨醇的MS基本培养基。
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