CN106561637A - 一种大薯类原球茎的超低温保存及恢复培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种大薯类原球茎超低温保存及恢复培养方法，属于植物细胞工程领域。超低温保存步骤有：无菌苗诱导及继代培养，类原球茎诱导，梯度驯化培养，剥取类原球茎及固定到装载条，然后置放于预处理溶液处理，转入玻璃化保护剂中冰浴处理，再迅速投入液氮中保存。恢复培养步骤有：从液氮中取出带类原球茎的装载条，放入1/2MS液体培养基中解冻并洗涤，用滤纸吸干后置于不含激素1/2MS培养基中暗培养，在解剖镜下将类原球茎逐一由装载条剥离，转移到含BA及GA₃的培养基上进行暗培养，再生后转入含BA及NAA的培养基中光照培养。其有益效果是，通过类原球茎为材料超低温保存大薯资源可获得大量可供保存及容易再生的材料。

Description

一种大薯类原球茎的超低温保存及恢复培养方法

技术领域

本发明涉及一种大薯类原球茎的超低温保存方法。同时，本发明还涉及到大薯类原球茎的超低温保存后的恢复培养方法，属于植物细胞工程技术领域。

背景技术

大薯（Dioscorea alata）为薯蓣科薯蓣属藤本植物，为药、食、饲兼用的经济作物及发展前景的能源作物。但由于其很少开花或不开花，结实率低、种子休眠期长及发芽率低等，造成种质资源退化，故对大薯遗传多样性的保护刻不容缓。目前，对大薯的保护措施主要有以种茎保存的种质圃及通过植物组织培养保存，田间保存易受自然灾害影响而导致种质变异或毁灭，通过组织培养保存中因多次继代引起遗传性状变异或污染的危险，均不利于种质资源的长期稳定保存。

超低温保存是指在液氮（-196℃）下的低温保存。在此条件下，植物的生物化学活性近乎停止，贮藏过程中的生理和遗传变化能够控制在最低限度内，被认为是此类植物遗传资源长期保存的最优选择。

植物组织与细胞培养物因具有能迅速大量繁殖, 再生植株可保持原有的遗传特性，常做为植物种质资源超低温保存的材料。常用的材料有悬浮细胞、愈伤组织、茎尖、芽尖、胚等。其中细胞及愈伤组织可大量获得，但因含有大量的水分，对冷冻伤害特别敏感，冻后不易成活；根尖，茎尖等分生组织须保持结构的完整性才能快速分化，要求较高的操作水平，费时费力。国外有关于大薯细胞培养、茎尖培养、愈伤组织分化及微型块茎诱导的报导，其中通过愈伤组织分化成苗可产生大量无菌苗，但由于分化及脱分化的过程，在培养过程中容易造成遗传性状改变，产生玻璃化苗及弱苗，不利于以后的超低温保存。类原球茎（PLB）是植物在组培条件下诱导产生的兼备胚胎发生和器官发育两个过程的整合体，可成功应用于种质资源保存。国内外关于类原球茎的报导多集中于兰科植物上，2014年许云等首次报导了大薯类原球茎体系的再生体系构建。类原球茎（PLB）由于数量大，细胞质浓厚，在冻存过程中不易形成冰晶，并具胚胎发生性，易再生，是超低温保存的优良材料。目前同类植物中相关报导多集中于马铃薯、甘薯、山药等作物的胚性细胞、茎尖等超低温保存，关于大薯类原球茎的超低温保存技术体系构建尚未见报导。

发明内容

本发明的目的是提供一种大薯类原球茎的超低温保存方法，同时还提供一种大薯类原球茎超低温保存方法后解冻恢复培养方法。

为了实现本发明的目的，本发明提供了一种大薯类原球茎的超低温保存方法，包括如下步骤：

步骤a、类原球茎的诱导：取继代3个月以上的大薯无菌组培苗，切取上部约1cm左右带腋芽的茎段，接种到含BA1 mol·L^-1，NAA0.2 mol·L^-1，GA₃0.5mol·L^-1的MS培养基中，黑暗中培养8-10d诱导类原球茎。

步骤b、类原球茎的驯化培养：带类原球茎的茎段转入含氯化钙0.1 mol·L^-1、蔗糖0.3mol·L^-1及脱落酸0.5-5mg·L^-1的第一培养基上培养3-7天后，

步骤c、然后转入含氯化钙0.1 mol·L^-1、蔗糖0.7mol·L^-1及脱落酸0.5-5mg·L^-1的第二培养基上黑暗预培养16小时。

步骤d、包埋、装载及玻璃化处理：解剖镜下剥取2-3mm的类原球茎，用镊子将类原球茎在2-4%的无钙离子海藻酸钠溶液中轻蘸，然后整齐放在5mm×20mm金属网状装载条上，每条装载条上5-10个类原球茎，

步骤e、再然后将带类原球茎的装载条浸入含有0.1-0.3%氯化钙、0.8 mol·L^-1蔗糖及2mol·L^-1甘油的MS液体培养基，经10-30min固定后，将装载条在无菌滤纸上吸去多余液体。

步骤f、将固定好的带类原球茎的装载条放于预处理溶液，所述预处理溶液中含有蔗糖0.4mol·L^-1、甘油2mol·L^-1、氯化钙0.1mol·L^-1的MS液体培养基，于室温下处理120-180min后，转入玻璃化保护剂PVS2中进行60-90min的冰浴处理，然后将带类原球茎的装载条迅速投入液氮中保存，其中，玻璃化保护剂PVS2含氯化钙0.1mol·L^-1。

本发明的优选实施方案是，所述含BA1 mol·L^-1，NAA0.2 mol·L^-1，GA₃0.5 mol·L^-1的MS培养基中含有3倍的氯化钙。

本发明的优选实施方案是，带类原球茎的茎段在经过步骤b至步骤c处理过程中的MS培养基的蔗糖浓度由0.3mol·L^-1递增到蔗糖0.7 mol·L^-1进行预培养，

本发明的优选实施方案是，所述含BA1mol·L^-1，NAA0.2mol·L^-1，GA₃0.5molL^-1的MS培养基含有氯化钙0.1 mol·L^-1及脱落酸0.5-5mg·L^-1。

本发明的优选实施方案是，所述步骤f是将5-10个类原球茎固定于5mm×20mm金属网状装载条上，然后对装载条作为整体进行玻璃化及冻存操作。

本发明的优选实施方案是，所述玻璃化保护剂PVS2含氯化钙0.1mol·L^-1。

本发明的优选实施方案是，所述步骤f中的预处理溶液为含有蔗糖0.4mol·L^-1、甘油2mol·L^-1的MS液体培养基。

本发明的优选实施方案是，所述含有0.4mol·L^-1蔗糖和2mol·L^-1甘油的MS液体培养基中含有氯化钙0.1 mol·L^-1。

冻存、解冻及恢复培养：超低温保存后的大薯类原球茎解冻时从液氮中取出带类原球茎的装载条，立即放入含蔗糖1.2mol·L^-1，含氯化钙0.1mol·L^-1的1/2MS液体培养基中快速解冻2min，并在培养基中洗涤20min。将带类原球茎的装载条在滤纸上吸干后置于不含激素1/2MS培养基中暗培养1天，然后在解剖镜下将类原球茎逐一由装载条剥离，转移到含BA及GA₃的培养基上进行暗培养，待类原球茎再生后转入含BA及NAA的培养基光照培养。

本发明的有益效果是，通过类原球茎为材料超低温保存大薯资源可获得大量可供保存及容易再生的材料，其超低温保存方法稳定可靠，保存后大薯恢复生长状况良好。同时，通过添加外源激素及逐步提高预培养基中蔗糖浓度两者结合提高类原球茎的抗性，通过采用金属网格作为类原球茎的载体以减少各步骤中的损伤，在类原球茎的玻璃化处理环节，通过对大量元素的调整，增加了细胞膜的抗性及稳定性，最终得到大薯的再生植株，并为薯蓣类植物的超低温保存作了技术储备。有效保存大薯种质资源，为大薯的工厂化生产育苗作技术支持。

附图说明

图1是本发明中大薯超低温保存及恢复培养方法的流程图。

图2是本发明中原球茎的状态示意图。

图3是本发明中包埋过程的状态示意图。

图4是本发明中再生苗的状态示意图。

具体实施方式

为了更清楚地叙述本发明的具体实施方式，下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1、大薯无菌苗的获得及类原球茎的诱导

参照图1和图2所示，取大薯苗带节茎段，在自来水流水下反复冲洗约1小时后，用70%酒精消毒1 min，0.1%的升汞消毒10min，无菌水冲洗若干次后，接种于含2 mg·L^-1BA、0.5mg·L^-1 NAA的MS培养基上诱导腋芽。培养温度为25±2℃, 光照12 h·d^-1，光照强度36µmolm^-2s^-1。腋芽切离并接种在含0.1 mg·L^-1NAA的MS培养基上继代培养。每3个月继代一次。取继代3个月以上的大薯无菌组培苗，切取上部约1cm左右带腋芽的茎段，接种到含BA1mol·L^-1，NAA 0.2mol·L^-1，GA₃0.5mol·L^-1的MS培养基，其中，MS培养基含3倍的氯化钙，黑暗中培养8-10d诱导类原球茎。

实施例2、大薯类原球茎的梯度预培养

取实施例1所得的带类原球茎的茎段转入含氯化钙0.1mol·L^-1、蔗糖0.3mol·L^-1及脱落酸0.5-5mg·L^-1的培养基上培养3-7天后，转入含氯化钙0.1mol·L^-1、蔗糖0.7mol·L^-1及脱落酸0.5-5mg·L^-1的培养基上黑暗预培养16小时。

实施例3、大薯类原球茎的装置固定

参照图3所示，类原球茎固定到装载条的步骤是：解剖镜下剥取2-3mm的类原球茎，用镊子将类原球茎在2-4%的无钙离子海藻酸钠溶液中轻蘸，然后整齐放在5mm×20mm金属网状装载条上，每条装载条上5-10个类原球茎。再然后将带类原球茎的装载条浸入含有0.1-0.3%氯化钙、0.8mol·L^-1蔗糖及2mol·L^-1甘油的MS液体培养基，经10-30min固定后，将装载条在无菌滤纸上吸去多余液体。

实施例4、大薯类原球茎的玻璃化处理及冻存

参照图1所示，类原球茎的液氮超低温保存的步骤是：取实施例3所得的带类原球茎的装载条放于预处理溶液，所述预处理溶液含有蔗糖0.4mol·L^-1、甘油2mol·L^-1、氯化钙0.1mol·L^-1的MS液体培养基，于室温下处理120-180min后，转入玻璃化保护剂PVS2中进行60-90min的冰浴处理，将带类原球茎的装载条迅速投入液氮中保存，其中，玻璃化保护剂PVS2含氯化钙0.1mol·L^-1。

实施例5、大薯的类原球茎恢复培养与植株再生

参照图1、图3、图4所示，恢复培养方法的所需步骤是：从液氮中取出带类原球茎的装载条，立即放入1.2mol·L^-1，含氯化钙0.1mol·L^-1的1/2MS液体培养基中快速解冻2min，并在培养基中洗涤20min，将带类原球茎的装载条在滤纸上吸干后置于不含激素1/2MS培养基中暗培养1天，然后在解剖镜下将类原球茎逐一由装载条剥离，转移到含BA及GA₃的培养基上进行暗培养。

待类原球茎再生后转入含BA及NAA的培养基光照培养，培养约14～28天后在解培镜下观察，即可见到有类原球茎再生，待类原球茎再生后转入含BA及NAA的培养基光照培养。部分成活类原球茎褐变，部分再生成绿苗，再生率最高可达50%。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为详细，只要本领域的技术人员在查看到本发明的实施例后，不脱离本发明构思的前提下，所做的改变都属于本发明的保护范围。但本文所述的实施例不能理解为对本发明的保护范围限制。

Claims (9)

1.一种大薯类原球茎的超低温保存方法，其特征在于，所述超低温保存方法包括如下步骤：

步骤a: 取继代3个月以上的大薯无菌组培苗，切取上部约1cm左右带腋芽的茎段，接种到含BA1mol·L^-1，NAA0.2mol·L^-1，GA₃0.5molL^-1的MS培养基中，黑暗中培养8-10天后，获得诱导类原球茎；步骤b:取步骤a获取的诱导类原球茎的茎段转入到含氯化钙0.1mol·L^-1、蔗糖0.3mol·L^-1、脱落酸0.5-5mg·L^-1的培养基上培养3-7天；

步骤c:取经过步骤b处理的茎段转入到含氯化钙0.1mol·L^-1、蔗糖0.7mol·L^-1、脱落酸0.5-5mg·L^-1的培养基上黑暗中预培养16小时；

步骤d:经过步骤c处理的茎段置于解剖镜下，剥取2-3mm类原球茎，用镊子将类原球茎在含2-4%的无钙离子海藻酸钠溶液中轻蘸，然后置放在5mm×20mm金属网状装载条上，其中，每条装载条上有5-10个类原球茎；

步骤e:将带类原球茎的装载条浸入含有0.1-0.3%氯化钙、0.4mol·L^-1蔗糖和2mol·L^-1甘油的MS液体培养基中，经10-30min固定后，将装载条在无菌滤纸上吸去多余液体

步骤f: 将步骤e固定的带类原球茎的装载条放入预处理溶液中，于室温下处理120-180min后，然后转入玻璃化保护剂PVS2中进行60-90min的冰浴处理，然后将带类原球茎的装载条迅速投入液氮中保存。

2.根据权利要求1所述的大薯类原球茎的超低温保存方法，其特征在于，所述含BA1mol·L^-1，NAA0.2 mol·L^-1，GA₃0.5 mol·L^-1的MS培养基中含有3倍的氯化钙。

3.根据权利要求1所述的大薯类原球茎的超低温保存方法，其特征在于，带类原球茎的茎段在经过步骤b至步骤c处理过程中的MS培养基的蔗糖浓度由0.3mol·L^-1递增到蔗糖0.7mol·L^-1进行预培养。

4.根据权利要求3所述的大薯类原球茎的超低温保存方法，其特征在于，所述含BA1mol·L^-1，NAA0.2mol·L^-1，GA₃0.5molL^-1的MS培养基含有氯化钙0.1 mol·L^-1及脱落酸0.5-5mg·L^-1。

5.根据权利要求1所述的大薯类原球茎的超低温保存方法，其特征在于，所述步骤f是将5-10个类原球茎固定于5mm×20mm金属网状装载条上，然后对装载条作为整体进行玻璃化及冻存操作。

6.根据权利要求5所述的大薯类原球茎的超低温保存方法，其特征在于，所述玻璃化保护剂PVS2含氯化钙0.1mol·L^-1。

7.根据权利要求5所述的大薯类原球茎的超低温保存方法，其特征在于，所述步骤f中的预处理溶液为含有蔗糖0.4mol·L^-1、甘油2mol·L^-1的MS液体培养基。

8.根据权利要求7所述的大薯类原球茎的超低温保存方法，其特征在于，所述含有0.4mol·L^-1蔗糖和2mol·L^-1甘油的MS液体培养基中含有氯化钙0.1 mol·L^-1。

9.一种大薯类原球茎超低温保存后的恢复培养方法，其特征在于，所述恢复培养方法包含如下步骤:

步骤 a':超低温保存后的大薯类原球茎解冻时从液氮中取出带类原球茎的装载条，立即放入含蔗糖1.2mol·L^-1，含氯化钙0.1mol·L^-1的1/2MS液体培养基中快速解冻2min，并在培养基中洗涤20min；

步骤b':将经过步骤b'处理的带类原球茎的装载条在滤纸上吸干后置于不含激素1/2MS培养基中暗培养1天，然后在解剖镜下将类原球茎逐一由装载条剥离，转移到含BA及GA₃的培养基上进行暗培养；

步骤c':待类原球茎再生后转入含BA及NAA的第三培养基中光照培养。