CN107155878B - 一种紫参薯种质离体保存和恢复方法 - Google Patents
一种紫参薯种质离体保存和恢复方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种紫参薯种质的离体保存和恢复方法，其包括以下步骤：取健康、无病害的紫参薯块茎的中部切块盆栽沙培获得幼苗，以幼苗茎段为外植体经消毒处理接种于固体培养基中，获得无菌试管苗。切取无菌试管苗茎段接于保存培养基:1/3～1/2MS+2.0mg/L KT+0.2mg/L NAA+20～30mg/L甘露醇+60mg/L蔗糖+7mg/L琼脂+0.1％AC，pH＝5.8。常温条件下，试管苗能健壮保存16个月以上，存活率达85％以上；与常规继代培养苗相比，其植株根系较粗壮发达，节间明显缩短，叶片小，分蘖多，叶色深。试管苗继代恢复生长后，植株生长正常，与常规组培苗无差异。
Description
技术领域
本发明涉及植物种质资源保存技术领域，具体涉及一种紫参薯种质的离体保存和恢复方法。
背景技术
紫参薯(Dioscorea alata.L)为薯蓣科薯蓣属缠绕草质藤本植物，又名紫人参、紫山药，在我国南方的浙江、江西、福建、台湾地区、广东等省区有广泛栽培，其块茎椭圆形至扁圆形，表皮紫褐色，肉质亮紫色，含有丰富的蛋白质、维生素、薯蓣皂苷和花青素等营养物质，具有滋肺益肾、健脾止泻、降血脂血糖、调节人体免疫力等功效，是药食兼用的作物之一。紫参薯为无性繁殖作物，在田间正常条件下不结零余子，主要以块茎进行繁殖。目前紫参薯种质资源保存主要采用大田块茎繁殖保存，该方法费时费力，且易遭受各种自然灾害和病虫害的影响，造成种质丢失，保存时间短，保存效果差。利用一般的组织培养技术保存紫参薯种质资源，试管苗需要定期继代培养(每隔1-2个月转接一次)，不断的重复工作造成大量人力物力的浪费，同时污染机会也可能提高。而采用低温或超低温保存技术，操作程序较繁琐、设备成本大、耗能高。为此，在常温条件下，探索适合紫参薯种质缓慢生长，以延长继代周期和降低保存成本的种质保存技术对当前种质资源离体保存具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种紫参薯种质离体保存与恢复方法，以解决现有技术中存在的上述问题。
本发明提供的技术方案如下：
一种紫参薯种质离体保存与恢复方法，包括如下步骤：
1)外植体的获得与消毒处理
取健康、无病害的紫参薯块茎中部切块盆栽沙培获得紫参薯幼苗，切取幼苗带节嫩茎于烧杯中，流水冲洗1～2h后，用洗衣粉浓溶液15～30min，自来水荡洗干净后，转置超净工作台上用体积浓度为70％酒精浸泡30～60s，转入2％次氯酸钠溶液中浸泡10～15min，然后无菌水漂洗3-5次，每次漂洗时间为1～3min；无菌水洗净后获得消毒的紫参薯嫩茎外植体；
2)无菌苗的获得：将步骤1)已消毒的嫩茎放于超净工作台上，切成带单节茎段，长约2cm左右，同时切除叶柄、枝茎等多余部分，接种于以MS培养基为基本培养基，附加激动素1.0～2.0mg/L、萘乙酸0.2～0.5mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7～8g/L的固体诱导培养基上；培养基用1mol/L HCl或1mol/L NaOH，调整pH值到5.8，并加入0.1％活性炭，搅拌均匀后，分装于200ml组培瓶，每升分装40瓶，在121℃下灭菌25min后，拿出冷切后即可用；将消毒处理好的外植体接种于上述诱导培养基中，密封无菌培养，培养条件为光照强度2000LuX，光照时间8～12h/d，温度为25±2℃，培养3～4周后为获得无菌试管苗。
3)试管苗的继代培养：取步骤2)获得的无菌试管苗，于超净工作台上用手术剪刀剪除叶片后，将试管苗切成带单节茎段，长约为1～1.5cm，节上部分长约为节下部分长的 2倍，取茎段形态学下端分别插入固体保存培养基和对照继代培养基中，密封无菌培养，观察统计存活率；所述固体保存培养基以1/3～1/2MS为基本培养基，添加激动素2.0mg/L、萘乙酸0.2mg/L、20～30mg/L甘露醇、60mg/L蔗糖、7～8mg/L琼脂、0.1％活性炭，pH＝5.8；培养条件为光照强度2000LuX，光照时间8～12h/d，温度为25±2℃。
4)继代恢复培养：取步骤3)已在固体保存培养基中保存培养16个月的紫参薯试管苗，切取试管苗带单节茎段，长约为1～1.5cm，接种于恢复培养基以MS为基本培养基，添加激动素1.0mg/L、萘乙酸0.2mg/L、30mg/L蔗糖、7～8mg/L琼脂、0.1％活性炭，pH＝5.8；培养条件为光照强度2000LuX，光照时间8～12h/d，温度为25±2℃。
紫参薯试管苗在步骤3)固体保存培养基中常温培养，植株生长非常缓慢，根系变粗变短，节间明显缩短，叶片小、多且密，分蘖多，保存后期部分叶片变黄，培养16个月后，存活率仍达85％；保存时间是常规继代培养的8倍以上。步骤4)继代恢复培养2 个月后，形成的试管苗植株生长正常，与常规组培苗无显著差异。
本发明提供了一种紫参薯种质离体保存与恢复方法，该保存方法具有操作简单，所需设备简单，节省大量人力物力，成本低，保存时间长，不受季节限制，安全可靠，便于种质交流等优点。
附图说明
图1为紫参薯种质组培苗接种在常规继代培养基培养2个月的图；
图2为紫参薯种质组培苗接种到本发明保存培养基培养12个月左右图；
图3为紫参薯种质组培苗接种到本发明保存培养基培养16个月左右图；
图4为紫参薯种质在本发明固体保存培养基保存16个月后继代恢复培养2个月图。
具体实施方式
实施例1
一种紫参薯种质离体保存与恢复方法，其具体步骤如下：
1、外植体的获得与消毒处理
取健康、无病害的紫参薯块茎中部切块盆栽沙培获得紫参薯幼苗，切取幼苗带节嫩茎于烧杯中，流水冲洗2h后，用洗衣粉浓溶液浸泡15min，自来水荡洗干净后，转置超净工作台上用体积浓度为70％酒精浸泡30s，转入2％次氯酸钠溶液中浸泡15min，然后无菌水漂洗3次，每次漂洗时间为2min；无菌水洗净后获得消毒的紫参薯嫩茎外植体；
2、无菌苗的获得：
将步骤1已消毒的嫩茎放于超净工作台上，切成带单节茎段，长约2cm左右，同时切除叶柄、枝茎等多余部分，接种于以MS培养基为基本培养基，附加激动素1.5mg/L、萘乙酸0.2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L的固体诱导培养基上；培养基用1mol/L HCl或 1mol/LNaOH，调整pH值到5.8，并加入0.1％活性炭，搅拌均匀后，分装于200ml组培瓶，每升分装40瓶，在121℃下灭菌25min后，拿出冷切后即可用；将消毒处理好的外植体接种于上述诱导培养基中，密封无菌培养，培养条件为光照强度2000LuX，光照时间10/d，温度为25±2℃，培养3周后为获得无菌试管苗。
3、试管苗的继代培养：
取步骤2获得的无菌试管苗，于超净工作台上用手术剪刀剪除叶片后，将试管苗切成带单节茎段，长约为1～1.5cm，节上部分长约为节下部分长的2倍，取茎段形态学下端分别插入固体保存培养基和对照继代培养基中，密封无菌培养，观察统计存活率；所述固体保存培养基以1/2MS为基本培养基，添加激动素2.0mg/L、萘乙酸0.2mg/L、25mg/L甘露醇、60mg/L蔗糖、7.5mg/L琼脂、0.1％活性炭，pH＝5.8；常规继代培养基以MS为基本培养基，添加激动素2.0mg/L、萘乙酸0.2mg/L、30mg/L蔗糖、7.5mg/L琼脂、0.1％活性炭，pH＝5.8；培养条件均为光照强度2000LuX，光照时间10h/d，温度为25±2℃。
4)继代恢复培养：取上述已在固体保存培养基中保存培养16个月的紫参薯试管苗，切取试管苗带单节茎段，长约为1～1.5cm，接种于恢复培养基，所述的恢复培养基以MS为基本培养基，添加激动素1.0mg/L、萘乙酸0.2mg/L、30mg/L蔗糖、7.5mg/L琼脂、0.1％活性炭，pH＝5.8；培养条件为光照强度2000LuX，光照时间10h/d，温度为25±2℃。
紫参薯试管苗在本发明固体保存培养基中常温培养，植株生长非常缓慢，根系变粗变短，节间明显缩短，叶片小、多且密，分蘖多，保存后期部分叶片变黄，培养16个月后，株高保持在2.4～3.2cm，基部出现个别黄叶，存活率仍达85％；保存时间是常规继代培养的8倍以上。而在常规继代培养基培养下，紫参薯试管苗叶片大、少，分枝少，株高达 7cm以上，2个月左右出现大量黄叶，甚至有枯苗。取在本发明固体保存培养基上保存16 个月后的试管苗茎段继代恢复培养2个月后，形成的试管苗植株生长正常，与常规组培苗无显著差异。
本实施例的结果见图1至图4.
实施例2
1、外植体的获得与消毒处理
取健康、无病害的紫参薯块茎中部切块盆栽沙培获得紫参薯幼苗，切取幼苗带节嫩茎于烧杯中，流水冲洗1h后，用洗衣粉浓溶液20min，自来水荡洗干净后，转置超净工作台上用体积浓度为70％酒精浸泡45s，转入2％次氯酸钠溶液中浸泡10min，然后无菌水漂洗4次，每次漂洗时间为2min；无菌水洗净后获得消毒的紫参薯嫩茎外植体；
2、无菌苗的获得：
将步骤1已消毒的嫩茎放于超净工作台上，切成带单节茎段，长约2cm左右，同时切除叶柄、枝茎等多余部分，接种于以MS培养基为基本培养基，附加激动素1.5mg/L、萘乙酸0.25mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7.5g/L的固体诱导培养基上；培养基用1mol/L HCl 或1mol/LNaOH，调整pH值到5.8，并加入0.1％活性炭，搅拌均匀后，分装于200ml组培瓶，每升分装40瓶，在121℃下灭菌25min后，拿出冷切后即可用；将消毒处理好的外植体接种于上述诱导培养基中，密封无菌培养，培养条件为光照强度2000LuX，光照时间9h/d，温度为25±2℃，培养3周后为获得无菌试管苗。
3、试管苗的继代培养：
取步骤2获得的无菌试管苗，于超净工作台上用手术剪刀剪除叶片后，将试管苗切成带单节茎段，长约为1～1.5cm，节上部分长约为节下部分长的2倍，取茎段形态学下端分别插入固体保存培养基和对照继代培养基中，密封无菌培养，观察统计存活率；所述固体保存培养基以1/3MS为基本培养基，添加激动素2.0mg/L、萘乙酸0.2mg/L、30mg/L甘露醇、60mg/L蔗糖、8mg/L琼脂、0.1％活性炭，pH＝5.8；常规继代培养基以MS为基本培养基，添加激动素2.0mg/L、萘乙酸0.2mg/L、30mg/L蔗糖、8mg/L琼脂、0.1％活性炭，pH＝5.8；培养条件均为光照强度2000LuX，光照时间9h/d，温度为25±2℃。
4)继代恢复培养：取上述已在固体保存培养基中保存培养16个月的紫参薯试管苗，切取试管苗带单节茎段，长约为1～1.5cm，接种于恢复培养基以MS为基本培养基，添加激动素1.0mg/L、萘乙酸0.2mg/L、30mg/L蔗糖、8mg/L琼脂、0.1％活性炭，pH＝5.8；培养条件为光照强度2000LuX，光照时间9h/d，温度为25±2℃。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，因此依本发明权利要求所作的同等变化，仍属于本发明所涵盖的范围。
Claims (4)
1.一种紫参薯种质离体保存和恢复的方法，包括如下步骤：
1)外植体的获得与消毒处理
取健康、无病害的紫参薯块茎中部切块盆栽沙培获得紫参薯幼苗，切取幼苗带节嫩茎于烧杯中，流水冲洗1～2h后，用洗衣粉浓溶液浸泡15～30min，自来水荡洗干净后，转置超净工作台上用体积浓度为70％酒精浸泡30～60s，转入2％次氯酸钠溶液中浸泡10～15min，然后无菌水漂洗3-5次，每次漂洗时间为1～3min；无菌水洗净后获得消毒的紫参薯嫩茎外植体；
2)无菌苗的获得：将步骤1)已消毒的嫩茎放于超净工作台上，切成带单节茎段，长1.5-2.5cm，同时切除包括叶柄、枝茎在内的多余部分，接种于以MS培养基为基本培养基，附加激动素1.0～2.0mg/L、萘乙酸0.2～0.5mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7～8g/L的固体诱导培养基上；培养基用1mol/L HCl或1mol/L NaOH，调整pH值到5.7-5.9，并加入0.05-0.15％活性炭，搅拌均匀后，分装于组培瓶，在120-125℃下灭菌20-30min后，拿出冷切后即可用；将消毒处理好的外植体接种于上述诱导培养基培养，培养条件为光照强度1900-2100LuX，光照时间8～12h/d，温度为25±2℃，培养3～4周后获得无菌试管苗；
3)试管苗的继代培养：取步骤2)获得的无菌试管苗，于超净工作台上用手术剪刀剪除叶片后，将试管苗切成带单节茎段，长为1～1.5cm，节上部分长为节下部分长的1.5-2.5倍，取茎段形态学下端插入固体保存培养基中；所述固体保存培养基以1/3～1/2MS为基本培养基，添加激动素1.9-2.1mg/L、萘乙酸0.19-0.21mg/L、20～30mg/L甘露醇、50-70mg/L蔗糖、7～8mg/L琼脂、0.05-0.15％活性炭，pH＝5.7-5.9；培养条件均为光照强度1900-2100LuX，光照时间8～12h/d，温度为25±2℃；
4)继代恢复培养：取步骤3)已在固体保存培养基中保存培养的紫参薯试管苗，切取试管苗带单节茎段，长为0.4-0.6cm，接种于恢复培养基，所述的恢复培养基以MS为基本培养基，添加激动素0.9-1.1mg/L、萘乙酸0.19-0.21mg/L、25-35mg/L蔗糖、7～8mg/L琼脂、0.05-0.15％活性炭，pH＝5.7-5.9；培养条件为光照强度2000LuX，光照时间8～12h/d，温度为25±2℃。
2.如权利要求1所述的一种紫参薯种质离体保存和恢复的方法，其特征在于，步骤2)中，分装于200ml组培瓶时，每升分装40瓶。
3.如权利要求1所述的一种紫参薯种质离体保存和恢复的方法，其特征在于，步骤2)为：
无菌苗的获得：将步骤1)已消毒的嫩茎放于超净工作台上，切成带单节茎段，长1.5-2.5cm，同时切除包括叶柄、枝茎在内的多余部分，接种于以MS培养基为基本培养基，附加激动素1.0～2.0mg/L、萘乙酸0.2～0.5mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7～8g/L的固体诱导培养基上；培养基用1mol/L HCl或1mol/L NaOH，调整pH值到5.8，并加入0.1％活性炭，搅拌均匀后，分装于200ml组培瓶，每升分装40瓶，在121℃下灭菌25min后，拿出冷切后即可用；将消毒处理好的外植体接种于上述诱导培养基培养，培养条件为光照强度2000LuX，光照时间8～12h/d，温度为25±2℃，培养3～4周后获得无菌试管苗。
4.如权利要求1所述的一种紫参薯种质离体保存和恢复的方法，其特征在于，步骤3)方法如下：
试管苗的继代培养：取步骤2)获得的无菌试管苗，于超净工作台上用手术剪刀剪除叶片后，将试管苗切成带单节茎段，长为1～1.5cm，节上部分长为节下部分长的1.5-2.5倍，取茎段形态学下端分别插入固体保存培养基和对照继代培养基中；所述固体保存培养基以1/3～1/2MS为基本培养基，添加激动素2.0mg/L、萘乙酸0.2mg/L、25mg/L甘露醇、60mg/L蔗糖、7～8mg/L琼脂、0.1％活性炭，pH＝5.8；培养条件均为光照强度2000LuX，光照时间8～12h/d，温度为25±2℃。
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