CN105918132B - 一种海州常山快速繁育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海州常山快速繁育方法，包括：1）从健康茁壮的海州常山1年生扦插苗上选取健康、无病虫害的叶片，进行消毒处理；2）无菌条件下，将处理后的材料接种于诱导培养基上，温度25℃，全黑暗条件下，培养至出愈；3）将诱导出的愈伤组织接种于增殖培养基中，温度25℃，光照强度1800‑2000 lx，光照时间12 h/d，25d继代增殖一次；4）将增殖的愈伤组织接种于分化培养基中，温度25℃，光照强度1800‑2000 lx，光照时间12 h/d，培养至分化出芽苗。本发明以叶片为外植体进行愈伤组织的诱导、增殖及分化培养，先经过30d的诱导培养，愈伤组织的出愈率较高，达到66.67%；然后经过25d的继代增殖培养，愈伤组织的平均大小增大了3倍；后续分化培养也成功分化出芽苗。
Description
技术领域
本发明属于植物组培技术领域，具体涉及一种海州常山快速繁育方法。
背景技术
海州常山（Clerodendrum trichotomum Thunb），是马鞭草科（Verbenaceae）大青属（Clerodendrum）的落叶灌木或小乔木，广泛分布于我国华东、华北、中南、西南各省和台湾等，国外日本、朝鲜及菲律宾北部也有分布。海州常山耐盐碱、耐水湿、抗有害气体，对不良环境有很强的耐受和抵抗能力；枝叶可以杀灭红蜘蛛、棉蚜虫等害虫；种子的含油量也很高；形态上白花、红萼、蓝果，花果期长，是一种抗逆性强，药用价值、经济价值和观赏价值高的树种。
海州常山常生长于山坡、野地等地方，现今栽培应用的还很少。前人研究成果，主要集中在海州常山的抗逆性生理研究方面，对海州常山的引种繁育研究极少。以往海州常山的繁殖多以扦插为主，海州常山组培快繁研究的起步比较晚，培养的途径比较单一，尚缺乏系统性的研究。对海州常山进行组培研究，能为海州常山后续的细胞或分子水平的研究提供基本的实验材料，也能为耐盐机理、花色形成等方面的控制研究奠定基础。目前关于海州常山组织培养方面的研究只停留于外植体直接形成完整植株，未见外植体经历脱分化、再分化间接形成完整植株的报道。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种海州常山快速繁育方法，能短时间内获得大量海州常山小苗。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种海州常山快速繁育方法，包括以下步骤：
1）从健康茁壮的海州常山1年生扦插苗上选取健康、无病虫害的叶片，进行消毒处理；
2）无菌条件下，将处理后的材料接种于诱导培养基上，温度25℃，全黑暗条件下，培养至出愈，诱导的培养基为：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH5.8；
3）将诱导出的愈伤组织接种于增殖培养基中，温度25℃，光照强度1800-2000 lx，光照时间12 h/d，25d继代增殖一次，增殖的培养基为：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH5.8；
4）将增殖的愈伤组织接种于分化培养基中，温度25℃，光照强度1800-2000 lx，光照时间12 h/d，培养至分化出芽苗，分化的培养基为：MS+6-BA0.50mg/L+NAA0.01mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.0g/L，pH5.8。
步骤1）中，消毒处理为：先用自来水冲洗30min，轻刷去上面的杂质，然后在无菌操作台上将嫩叶剪成0.5cm×0.5cm大小的方块，并将外植体方块放入75%酒精中消毒15s，无菌水冲洗3-4次，再用0.1%的HgCl2溶液消毒进行5min，再用无菌水冲洗5-6次。
步骤2）中，30d后诱导出愈伤组织。
步骤4）中，25d后，分化出芽苗。
有益效果：与现有技术相比，本发明的海州常山快速繁育方法，以叶片为外植体进行愈伤组织的诱导、增殖及分化培养，采用诱导的培养基MS+6-BA0.50mg/L+NAA0.10mg/L经过30d的培养，叶片的出愈率较高，达到66.67%，整个叶片变成愈伤组织团状愈伤，淡黄绿色，状态较好；采用增殖的培养基MS+6-BA0.50mg/L+NAA0.05mg/L经过25d的培养，增殖明显，愈伤组织的平均大小增大了3倍，达到21.76mm；采用分化的培养基MS+6-BA0.50mg/L+NAA0.01mg/L经过培养成功分化出了芽苗。可为后期的丛生芽诱导和基因改良工作提供大量的实验材料，具有很好的实用性。
附图说明
图1是海州常山叶片愈伤组织分化示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
本实施例的海州常山，以幼嫩叶片为外植体的愈伤组织诱导、增殖及分化，是先从健康茁壮的海州常山1年生扦插苗上选取健康、无病虫害的叶片，进行消毒处理，然后将其在无菌操作台上接种于事先配好的诱导培养基上，1个月后将已诱导出的愈伤组织接种于增殖培养基中进行增殖。
1）新鲜外植体的选取与消毒灭菌
从健康茁壮的海州常山1年生扦插苗上选取健康、无病虫害的叶片，先用自来水冲洗30min，轻刷去上面的杂质，然后在无菌操作台上将嫩叶剪成0.5cm×0.5cm大小的方块，并将外植体放入75%酒精中消毒15s，无菌水冲洗3-4次，再用0.1%的HgCl2溶液消毒进行5min，再用无菌水冲洗5-6次。
2）无菌培养基的制备
诱导的培养基：MS+6-BA0.50mg/L+NAA0.10mg/L，pH调至5.8，蔗糖30g/L，琼脂6.0g/L。增殖的培养基：MS+6-BA0.50mg/L+NAA0.05mg/L，pH调至5.8，蔗糖30g/L，琼脂6.0g/L。
培养基分装后尽快将培养瓶口密封，并及时放入高压灭菌锅内进行消毒灭菌。灭菌条件为121℃、0.1MPa下灭菌20 min，灭好的培养基从高压锅中取出后，放入干净的准备室中让其自然冷却凝固。
3）接种
将灭菌后的叶片在无菌条件下剪掉两端成0.5cm×0.5cm大小的方块，接种于诱导培养基上，每瓶接种3个材料。
4）培养
将接种后的培养瓶放入培养室进行愈伤组织的诱导，条件为：温度25℃，全黑暗处理，30 d 后统计出愈率分别为66.67%（MS+6-BA 0.50mg/L+NAA 0.10mg/L）。其中，该诱导率为成功诱导出愈伤的叶片与叶片总接种数的比值。
30d后发现，如图1所示，整个叶片变成愈伤组织团状愈伤，淡黄绿色，状态较好。
一个月后将分化良好的愈伤组织转于增殖培养基中，条件为：温度25℃，光照时间为12h/d，光照强度为2500lx，30d后统计愈伤平均大小，发现愈伤平均大小增大了3倍，达到21.76mm。其中，愈伤大小统计以测定愈伤直径为准。
25d后将增殖的愈伤组织接种于分化培养基中，温度25℃，光照强度1800-2000lx，光照时间12h/d，30d统计分化率为13.33%（MS+6-BA0.50mg/L+NAA0.01mg/L）。其中，分化率的计算公式为：
分化率（%）=产生芽点、分化出芽苗的愈伤组织数量/接种的愈伤组织总数×100%
对比实施例1
方法同实施例1，其中，诱导的培养基分别为：MS+6-BA0.50mg/L+NAA0.50mg/L、MS+6-BA1.00mg/L+NAA0.10mg/L、MS+6-BA2.00mg/L+NAA0.10mg/L、MS+6-BA4.00mg/L+NAA0.10mg/L，30d后统计诱导率仅为37.78%、8.89%、37.78%、4.44%，同发明中的诱导率达66.67%差距较大。
对比实施例2
方法同实施例1，其中，增殖的培养基分别为：MS+6-BA0.50mg/L+NAA0.10mg/L、MS+6-BA0.50mg/L+NAA0.20mg/L、MS+6-BA0.00mg/L+NAA0.00mg/L，实验步骤同本发明，25d后统计愈伤平均大小分别为仅为10.86mm、14.33mm、7.80mm，同发明中的愈伤平均大小达到21.76mm差距较大。
对比实施例3
方法同实施例1，其中，分化的培养基分别为：MS+6-BA0.50mg/L+NAA0.05mg/L、MS+6-BA0.50mg/L+NAA0.10mg/L、MS+6-BA1.00mg/L+NAA0.01mg/L、MS+6-BA1.00mg/L+NAA0.05mg/L、MS+6-BA1.00mg/L+NAA0.10mg/L，30d后统计分化率仅为0.00%、4.44%、8.89%、0.00%、6.67%，同发明中的分化率达13.33%有一定差距。
因此，本发明的结果为：以幼嫩叶片为外植体接种于诱导培养基：MS+6-BA0.50mg/L+NAA0.10mg/L中，30d后统计诱导率达66.67%；将已形成的愈伤组织接于增殖培养基：MS+6-BA0.50mg/L+NAA0.05mg/L中，25d后愈伤平均大小达到21.76mm；将以增殖的愈伤接种于分化培养基：MS+6-BA0.50mg/L+NAA0.01mg/L中，经过培养成功分化出了芽苗，分化率达13.33%。
上实施例中，均以MS为基本培养基，其配方参照分子生物学实验手册。
Claims (4)
1.一种海州常山快速繁育方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)从健康茁壮的海州常山1年生扦插苗上选取健康、无病虫害的叶片，进行消毒处理；
2)无菌条件下，将处理后的材料接种于诱导培养基上，温度25℃，全黑暗条件下，培养至出愈，诱导培养基为：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH5.8；
3)将诱导出的愈伤组织接种于增殖培养基中，温度25℃，光照强度1800-2000lx，光照时间12h/d，25d继代增殖一次，增殖培养基为：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH5.8；
4)将增殖的愈伤组织接种于分化培养基中，温度25℃，光照强度1800-2000lx，光照时间12h/d，培养至分化出芽苗，分化培养基为：MS+6-BA0.50mg/L+NAA0.01mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.0g/L，pH5.8。
2.根据权利要求1所述的海州常山快速繁育方法，其特征在于：步骤1)中，消毒处理为：先用自来水冲洗30min，轻刷去上面的杂质，然后在无菌操作台上将嫩叶剪成0.5cm×0.5cm大小的方块，并将外植体方块放入75％酒精中消毒15s，无菌水冲洗3-4次，再用0.1％的HgCl2溶液消毒5min，再用无菌水冲洗5-6次。
3.根据权利要求1所述的海州常山快速繁育方法，其特征在于：步骤2)中，30d后诱导出愈伤组织。
4.根据权利要求1所述的海州常山快速繁育方法，其特征在于：步骤4)中，25天后，分化出芽苗。
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Inventor after: Yang Xiulian Inventor after: Hu Die Inventor after: Wang Lianggui Inventor after: Song Jiani Inventor after: Shi Tingting Inventor after: Zhang Yingting Inventor after: He Ling Inventor before: Yang Xiulian Inventor before: Wang Lianggui Inventor before: Song Jiani Inventor before: Shi Tingting Inventor before: Zhang Yingting Inventor before: He Ling |
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| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20160907 Assignee: Jiangsu Geguan Agroforestry Technology Group Co.,Ltd. Assignor: Nanjing Forestry University Contract record no.: 2018320000362 Denomination of invention: Rapid breeding method of clerodendrum trichotomum thunb Granted publication date: 20171208 License type: Common License Record date: 20181129 |
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| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20160907 Assignee: Nanjing Xinlinghai Industry & Trade Industrial Co.,Ltd. Assignor: Nanjing Forestry University Contract record no.: 2018320000364 Denomination of invention: Rapid breeding method of clerodendrum trichotomum thunb Granted publication date: 20171208 License type: Common License Record date: 20181130 |
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| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20160907 Assignee: Huangdun Nursery Farm, Ganyu District, Lianyungang City Assignor: Nanjing Forestry University Contract record no.: 2018320000376 Denomination of invention: Rapid breeding method of clerodendrum trichotomum thunb Granted publication date: 20171208 License type: Common License Record date: 20181212 |
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| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20171208 Termination date: 20210526 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |