CN102726288A - 大花型兰花的培育与快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是大花型兰花的培育与快速繁殖方法。将碧玉兰、独占春、文山红柱兰及大花蕙兰等兰株在资源圃内进行杂交育种和果实培育，待培育至兰花果实到九成熟，果皮略显黄色时摘取进行杂交育种，经外植体处理、种子无菌萌发培养，种子萌发长出幼根，转接到改良培养基中培养，4～6个月后逐渐成为具有根系并可炼苗和移栽的试管苗；经增殖、分化诱导与生根培养，根长达1cm左右时可出瓶在温室炼苗，1-2个月后在大棚利用设施栽培。本发明的方法不但培育出了新品种，还能进行快速繁殖，以满足“花香色艳”的产业化需求。
Description
技术领域
本发明涉及植物培植技术领域，具体地说是大花型兰花新品种的育种与快速繁殖方法。
背景技术
大花型兰花是指兰属（Cmbidium）中大花亚属植物，主要特点是花型较大。兰花花期差异，必须控制花期或保存花粉才能按时授粉。兰花杂交种子很小，内含一些发育不完全的胚，无胚乳，自然状态下很难萌发。虽有人作过兰属植物的育种和种子的萌发研究，但大花型兰花杂交育种和快速繁殖未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种为兰花育种和产业化生产奠定重要技术基础的大花型兰花的育种与快速繁殖方法。
本发明对四种大花型兰花种子进行了无菌萌发研究，成功地培育出大量试管苗。
碧玉兰（Cmbidium lowianum）、独占春（C. eburneum）、文山红柱兰（C. wenshanense）及大花蕙兰（C.hyridus）是兰科兰属中大花亚属不同种植物，以这四种兰花为亲本培育杂交种兰花，具体的育种与繁殖方法为：
1、材料来源：兰株采自云南文山、保山、普洱等不同地区，大花蕙兰购置于昆明斗南花卉市场。将采集的野生兰株在温室内栽培驯化，选取花期相近的类型进行杂交育种和果实培育（现有技术），待培育至兰花果实到九成熟，果皮略显黄色时摘取。
2、培养方法：
（1）杂交育种：
① 选取自然花期接近一致的大花型兰花，待父母本花序1/2花蕾开放时陆续进行授粉育种操作；
② 外植体处理：90%成熟度果实经75%酒精消毒40秒后，转入0.1%氯化汞表面消毒8～12分钟，用无菌水冲洗3～4次，在无菌室取出种子，用纱布包好种子后，以少量无菌水润洗5次，然后用0.1mol/L KOH溶液浸泡8～12分钟，再用无菌水冲洗3次，在饱和漂白粉上清液中消毒10～20分钟，再用无菌水冲洗5次后接种到固体培养基中。
（2）种子无菌萌发培养：筛选出改良MS（即1/2MS）为较适宜的基本培养基，加生长调节剂的配方为：改良MS+6-BA0.5～3.0mg.L-1+NAA1.0～1.5mg.L-1 ，用暗箱培养，温度24±2℃，光照1800～2500勒克斯（lx），每天光照12小时，培养基 pH5.8； 琼脂7g/L，3个月后发芽；种子萌发后先长出芽，随后长出幼根，转接到改良MS+6-BA0.3mg.L-1+NAA0.5mg.L-1培养基中培养,4～6个月后逐渐成为具有根系并可炼苗和移栽的试管苗；
（3）增殖、分化诱导与生根培养
① 原球茎增殖培养：种子萌发后，多形成原球茎，可进行增殖培养，培养基及配方是：改良MS + 6-BA1.0-3.0 mg.L-1 + NAA 0.3-0.8 mg.L-1，培养30～45天；
② 原球茎分化培养：原球茎进行分化培养后能形成试管苗，其培养基及配方为：改良MS + 6-BA2.0-3.5 mg.L-1 + NAA0.3-0.8 mg.L-1 + 香蕉泥80g/L，培养35～55天；
③ 试管苗生根培养：生根培养配方为：改良MS + 6-BA0.3- 0.8mg.L-1 + NAA0.5-2.5 mg.L-1，通过26～36天诱导出的根长达1cm左右时可出瓶在温室炼苗，1-2个月后在大棚利用设施栽培；
增殖、分化诱导与生根培养条件：增殖、分化诱导与生根培养过程中，均采用光照培养，温度24±2℃，光照1800～2500勒克斯（lx），每天光照12小时，培养基 pH5.8；
一些种子萌发后经一定时间会直接形成苗，并长出幼根，转接到改良MS+6-BA0.2～0.5mg.L-1+NAA0.3～0.8mg.L-1+香蕉泥80gL-1培养基中培养,4～6个月后逐渐成为具有根系并可炼苗和移栽的试管苗。
本发明的方法具有以下特点：
1、引种驯化：必须引种驯化野生兰花和建立种质资源圃，用能调控环境的温室培育父母本植株以便进行杂交育种。
2、花期调控：用设施按兰花生理生态要求条件下的环境调控使父母本花期一致，或在低温下保存花粉。
3、根据花器官特点正确进行杂交技术操作。
4、不同培养基对杂交种子萌发的影响：将种子分别接种在多种改良MS 培养基上，从播种到发芽形成圆球茎需3～6个月，改良MS+BA0.5～3.0mg.L-1+NAA0.8～2.5mg.L-1更有利于杂交种子萌发。
5、不同激素对圆球茎生长的影响：由于兰花种子非常细小，播种时有些种子聚集在一起，致使长出的圆球茎较拥挤,因此，将圆球茎从原来母瓶中取出，转接到11个不同激素浓度的培养基中作对比试验，且培养基中加入了80gL-1香蕉泥。经过25天培养观察时，培养基中均观察到圆球茎上已全长出新绿叶，一般为2～3片，有些球状茎已长出根，植株3～5cm。研究表明，改良MS+KT0.5-2.5mg.L-1+NAA0.5-1.5mg.L-1培养圆球茎生长的效果最佳。
本发明从实验中找到了适宜大花型杂交兰花的育种和快速增殖方法，为这类兰花的杂交育种培育了创新材料和奠定了技术基础。
经过多年努力，突破了种种技术难关，已培育出BHL-1(碧蕙兰)、BCL-1（碧春兰）、WHL-1（文虎兰）和WBL-1（文碧兰）四个杂交种（或新种质），可以进行试管繁殖。
本发明与现有技术比较具有的优点：
兰花的杂交育种已有一些报道，但采用碧玉兰（Cmbidium lowianum ）、独占春（C. eburneum）、文山红柱兰（C. wenshanense）及大花蕙兰（C.hyridus）四种兰花作亲本进行杂交育种，突破一系列技术难关培育新品种还未见报道。此种方法不但培育出了新品种，还能进行快速繁殖，以满足“花香色艳”的产业化需求。
具体实施方式
实施例1：BCL-1（碧春兰）的育种与繁殖
1、材料来源：两种亲本兰株碧玉兰（Cmbidium lowianum）及独占春（C. eburneum）采自云南山区，碧玉兰与独占春互为父母本。
2、培养方法
(1)杂交育种
① 建立兰花资源圃，资源圃内的环境能人工调控，创造最适合兰花生长发育的最佳环境。
② 这几种兰花的自然花期接近一致，待父母本花序1/2花蕾开放时进行育种操作。
③ 育种操作：清洁手和镊子，用手轻轻摘除父母本药帽（花药顶端帽状物），用镊子摘下父本花粉块，送入母本合蕊柱的腔（柱头）内即可；
④ 加强温、光和肥水管理，注意防治病虫危害，直到兰花果实发育到九成熟，1/3果皮显黄色时摘取。
⑤ 外植体处理：90%成熟度果实经75%酒精消毒40秒后，转入0.1%氯化汞表面消毒8～12分钟，用无菌水冲洗3～4次，在无菌室取出种子，用纱布包好种子后，以少量无菌水润洗5次，然后用0.1mol/L KOH（氢氧化钾）溶液浸泡8～12分钟，再用无菌水冲洗3次，在饱和漂白粉上清液中消毒10～20分钟，再用无菌水冲洗5次后接种到固体培养基中。
（2）种子无菌萌发
① 种子萌发培养：筛选出改良MS（即1/2MS）为较适宜的基本培养基，加生长调节剂的配方为：改良MS+6-BA1.0mg.L-1+NAA1.0mg.L-1 ，用暗箱培养，温度24±2℃，光照1800～2500勒克斯（lx），每天光照12小时，培养基 pH5.8； 琼脂7g/L，3个月后发芽。
②种子萌发后先长出芽，随后长出幼根，转接到改良MS+6-BA0.3mg.L-1+NAA0.5mg.L-1培养基中培养,4～6个月后逐渐成为具有根系并可炼苗和移栽的试管苗。
（3）增殖、分化诱导与生根培养
① 原球茎增殖培养基：改良MS + 6-BA1.0mg.L-1 + NAA 0.3mg.L-1，培养30天。
② 原球茎分化为试管苗培养基：改良MS + 6-BA2.0mg.L-1 + NAA0.3mg.L-1 + 香蕉泥80g/L，培养36天。
③ 生根培养基：改良MS + 6-BA0.3mg.L-1 + NAA0.5mg.L-1，培养28天。
增殖、分化诱导与生根培养条件：增殖、分化诱导与生根培养过程中，均采用光照培养，温度24±2℃，光照1800～2500勒克斯（lx），每天光照12小时，培养基 pH5.8；
实施例2：BHL-1(碧蕙兰)的育种与繁殖
母本：碧玉兰（C.lowianum）； 父本：大花蕙兰（C.hyridus）
(1) 杂交育种与实施例1相同。
（2）种子无菌萌发
① 种子萌发培养基：筛选出改良MS（即1/2MS）为较适宜的基本培养基，加生长调节剂的配方为：改良MS+6-BA2.0mg.L-1+NAA0.5mg.L-1。培养条件：与实施例1相同。
②种子萌发后先长出芽，随后长出幼根，转接到改良MS+6-BA0.3mg.L-1+NAA0.5mg.L-1培养基中培养,4～6个月后逐渐成为具有根系并可炼苗和移栽的试管苗。
（3）增殖、分化诱导与生根培养
① 原球茎增殖培养基：改良MS + 6-BA2.0mg.L-1 + NAA 0.5mg.L-1，培养38天。
② 原球茎分化为试管苗培养基：改良MS + 6-BA 3.5mg.L-1 + NAA0.5 mg.L-1 + 香蕉泥80g/L，培养48天。
③ 生根培养基：改良MS + 6-BA0.5mg.L-1 + NAA1.5mg.L-1，培养32天。
增殖、分化诱导与生根培养条件与实施例1相同。
实施例3： WHL-1（文虎兰）的育种与繁殖
母本: 文山红柱兰（C.wenshanense）；父本：虎雪兰（C.tracyanum var huanghua×C.mastersii），杂交育种和种子无菌萌发与实施例1或实施例2相同。
增殖、分化诱导与生根培养：
① 原球茎增殖培养基：改良MS + 6-BA3.0mg.L-1 + NAA 0.8mg.L-1，培养42天。
② 原球茎分化为试管苗培养基：改良MS + 6-BA2.5mg.L-1 + NAA 0.8mg.L-1 + 香蕉泥80g/L，培养53天。
③ 生根培养基：改良MS + 6-BA0.8mg.L-1 + NAA 2.5mg.L-1，培养36天。
增殖、分化诱导与生根培养条件与实施例1相同。
实施例4：WBL-1（文碧兰）的育种与繁殖
母本: 文山红柱兰（C.wenshanense），父本：碧玉兰（C. lowianum ），杂交育种、种子无菌萌、增殖、分化诱导与生根培养与实施例1或实施例2或实施例3相同。
Claims (1)
1.大花型兰花的培育与快速繁殖方法，其特征在于按以下步骤进行：
（1）材料：将采得的碧玉兰、独占春、文山红柱兰及大花蕙兰等兰株在资源圃内进行杂交育种和果实培育，待培育至兰花果实到九成熟，果皮略显黄色时摘取；
（2）培养方法
① 选取自然花期接近一致的大花型兰花，待父母本花序1/2花蕾开放时陆续进行授粉育种操作；
② 外植体处理：90%成熟度果实经75%酒精消毒40秒后，转入0.1%氯化汞表面消毒8～12分钟，用无菌水冲洗3～4次，在无菌室取出种子，用纱布包好种子后，以少量无菌水润洗5次，然后用0.1mol/L KOH溶液浸泡8～12分钟，再用无菌水冲洗3次，在饱和漂白粉上清液中消毒10～20分钟，再用无菌水冲洗5次后接种到固体培养基中；
③种子无菌萌发培养：筛选出改良MS（即1/2MS）为较适宜的基本培养基，加生长调节剂的配方为：改良MS+6-BA0.5～3.0mg.L-1+NAA1.0～1.5mg.L-1 ，用暗箱培养，温度24±2℃，光照1800～2500勒克斯（lx），每天光照12小时，培养基 pH5.8； 琼脂7g/L，3个月后发芽；种子萌发后先长出芽，随后长出幼根，转接到改良MS+6-BA0.3mg.L-1+NAA0.5mg.L-1培养基中培养,4～6个月后逐渐成为具有根系并可炼苗和移栽的试管苗；
（3）增殖、分化诱导与生根培养
① 原球茎增殖培养：种子萌发后，多形成原球茎，可进行增殖培养，培养基及配方是：改良MS + 6-BA1.0-3.0 mg.L-1 + NAA 0.3-0.8 mg.L-1，培养30～45天；
② 原球茎分化培养：原球茎进行分化培养后能形成试管苗，其培养基及配方为：改良MS + 6-BA2.0-3.5 mg.L-1 + NAA0.3-0.8 mg.L-1 + 香蕉泥80g/L，培养35～55天；
③ 试管苗生根培养：生根培养配方为：改良MS + 6-BA0.3- 0.8mg.L-1 + NAA0.5-2.5 mg.L-1，通过26～36天诱导出的根长达1cm左右时可出瓶在温室炼苗，1-2个月后在大棚利用设施栽培；
增殖、分化诱导与生根培养条件：增殖、分化诱导与生根培养过程中，均采用光照培养，温度24±2℃，光照1800～2500勒克斯（lx），每天光照12小时，培养基 pH5.8。
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