CN101983554A - 一种墨兰种苗繁殖方法 - Google Patents

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一种墨兰种苗繁殖方法，属于一种兰花育苗繁殖技术，尤其是一种组织培养与菌根真菌共生培养育苗的繁殖技术。本发明的一种墨兰种苗繁殖方法，其种苗获得主要包括种子萌发、原球茎继代增殖和生根培养过程，其特征在于该繁殖方法在种苗获得后还进行生根苗的炼苗及与菌根真菌的菌根化过程。本发明采用墨兰种子无菌萌发与菌根真菌共生的菌根化培育技术，既可繁殖优良品种，从种子实生苗中选择优良兰株，又能快速提高墨兰繁育速度，克服纯组培苗生长缓慢，周期长，甚至不开花的缺点，对墨兰的大面积产业化扩繁具有重要的利用价值。

Description

一种墨兰种苗繁殖方法
技术领域
本发明属于一种兰花育苗繁殖技术，尤其是一种组织培养与菌根真菌共生培养育苗的繁殖技术。
背景技术
兰花是指整个兰科植物(Orchidaceae)的总称。在我国，传统的“兰花”概念仅指产于我国的兰科、兰属(Cymbidium)植物，称国兰，地生，故又称地生兰。兰科植物是一类观赏价值和经济价值极高的珍贵植物。其中，云南兰科植物就有100属，530多种，为全国之冠。
但是到目前为止，我国兰花开发与利用仍处于初级阶段，未能解决大量繁殖的问题，因此供需矛盾突出。一方面是由于经济利益的驱动，农民上山大量采挖野生兰花，野生兰花资源受到严重破坏，尤其是较名贵的墨兰(Cymbidium sinense)、春兰(Cymbidiumgoeringii)、寒兰(Cymbidium kanran)、春剑(Cymbidium longibracteatun)和连瓣兰(Cymbidiumlianpan)破坏最为严重。其次是森林面积大幅度减少，兰花生存环境的改变，不仅对野生兰花种群延续形成威胁，也使得许多种类兰花在一些地区消失。近年来，我国加强了野生植物资源的保护工作，我国第一部专门保护野生植物的行政法规《中华人民共和国野生植物保护条例》自1997年1月1日实施，根据该条例的规定，拟定并经审议通过了《国家重点保护野生植物名录》，兰科所有种均列在名录中。但是仅采用法律形式保护兰花资源还是远远不够的，在加强管理的同时，也应重视发展兰花的繁殖技术，才能根本解决保护兰花物种的目的。
兰花的繁殖技术目前主要有两种，分株和组织培养。传统的分株繁殖速度慢，繁殖率低，周期长，且易伤母株，种子在自然条件下发芽率极低，很难满足规模化生产的需要。而组织培养，移栽无菌苗成活率低，生长发育缓慢，开花迟，甚至不开花，原因主要是缺少与之共生的菌根真菌。真菌为兰花提供生长繁殖所必需的营养物质。兰科植物与菌根真菌形成菌根是自然界的一种普遍现象，所以菌根真菌为兰科植物提供营养进行生长发育是解决人工栽培兰科植物的关键，也是我国兰花资源与利用保护所面临的主要问题。
发明内容
本发明所要解决的就是仅靠分株和组织培养繁殖墨兰不能够满足我国兰花植物资源保护的问题。本发明从野生墨兰根中分离内生真菌，使其与墨兰组培苗共生培养，筛选出能与墨兰组培苗有效共生并能明显促进其生长发育的有效菌根真菌，对墨兰组培苗进行菌根化培育，从根本上克服了试管苗繁殖，缺乏菌根真菌，移栽无菌苗成活率低，生长缓慢，开花迟缓，花小甚至不开花的缺点。
本发明的一种墨兰种苗繁殖方法，其种苗获得主要包括种子萌发、原球茎继代增殖和生根培养过程，其特征在于该繁殖方法在种苗获得后还进行生根苗的炼苗及与菌根真菌的菌根化过程，具体为：
炼苗：将生根苗在室内自然光照条件下开瓶盖过渡1～1.5周后取出，洗净沾附在小苗根部的培养基备用；
苗木菌根化：将取出的小苗用含有菌根真菌的基质包裹种植于穴盘中，在适度温度下，置于阴凉通风处栽培，期间向叶部喷洒水，促进新根生长，3周后移入温室中进行正常水、肥、药管理，9.5月后即可得菌根化种苗；所述的基质是按重量份分别将1/4份泥炭、1/4份珍珠岩、1/4份干腐质土和1/4份红土中加入拌有菌液(Rhizoctonia sp.MLX102)的栎树叶三级菌种少许而得。
上述的种子萌发过程主要包括以下步骤：
a)外植体的选择：选择墨兰未裂开的蒴果为外植体；
b)种子处理：将墨兰蒴果无菌处理后取出粉沫状种子无菌处理；
c)种子萌发：将经处理的墨兰种子均匀播种在种子萌发培养基上培养生长为原球茎；所使用的培养基配方为：1/2MS+NAA0.5～1.0mg/L+6-BA0.5～1.0mg/L+100ml/L椰乳+甘露醇1g/L+活性碳0.5g/L+蔗糖25g/L+琼脂3g/L，培养基PH值为5.0～6.0。
上述的原球茎继代增殖过程是将初代培养的原球茎和芽分别在培养基上继代增殖培养50～60天，长成新芽或原球茎，以后不断切割原球茎继代，即可几何级数增长；所使用的培养基配方为：1/2MS+KT0.5mg/L+甘露醇1g/L+活性碳0.5g/L+蔗糖25g/L+琼脂3g/L，培养基PH值为5.0～6.0。
上述的生根培养过程是将较大的根系不发达的苗转入生根培养基上培养，使生根率达95％以上，植株生长旺盛，7周后形成5～7cm的小苗；所使用的培养基配方为：1/2MS+NAA0.5mg/L+活性碳0.5g/L+蔗糖25g/L+琼脂3g/L，培养基PH值为5.0～6.0。
本发明通过调整激素浓度、配比和根菌真菌的共生培养，能有效利用兰科植物菌根共生促进生长的特点，缩短兰科植物组培苗的繁殖周期，成活率达到了95％以上。本发明采用墨兰种子无菌萌发与菌根真菌共生的菌根化培育技术，既可繁殖优良品种，从种子实生苗中选择优良兰株，又能快速提高墨兰繁育速度，克服纯组培苗生长缓慢，周期长，甚至不开花的缺点，对墨兰的大面积产业化扩繁具有重要的利用价值。
具体实施方式
实施例1：选用2003年在云南省西双版纳野生的优良单株上采得的墨兰种子，于2004年6月份在西南林学院的温室大棚内进行炼苗，该繁殖方法墨兰种苗成活率达到了95％以上，具体的种苗繁殖过程如下：
(1)种子萌发：将野外成熟180天的蒴果采回，在4度冰箱种冷藏2周，用流水冲洗20分钟取墨兰未裂开的蒴果为外植体。在70～75％的酒精中表面消毒30～50秒，无菌水漂洗一次，又用2％的次氯酸钠消毒20分钟，用无菌水冲洗4～5次，再以0.1％的升汞溶液消毒10～15分钟，最后用无菌水冲洗5次。将洗净的成熟蒴果置于灭菌滤纸上吸干水分，把消毒的蒴果置于已灭菌的培养皿中，用无菌手术刀纵向切开墨兰蒴果；再用镊子取出墨兰粉沫状种子放入预先准备好的无菌小滤纸袋内，浸入0.15～0.2mol/L的NaOH溶液中处理8～10分钟取出，在无菌水中冲洗4～5次，每次换水前用灭过菌的干滤纸挤压滤纸袋吸干水分；然后把经处理的墨兰种子均匀地播种在种子萌发培养基上，暗培养2周后转入每天光照12～14小时，光照强度1000～1500lux，温度25℃。培养160～180天即可生长为原球茎。其培养基的配方为1/2MS+NAA0.5～1.0mg/L+6-BA0.5～1.0mg/L+100ml/L椰乳+甘露醇1g/L+活性碳0.5g/L+蔗糖25g/L+琼脂3g/L，培养基PH值为5.0～6.0。
(2)原球茎继代增殖：将初代培养的原球茎和芽分别在培养基上继代增殖培养，原球茎增殖速度快，增殖效果好，50～60天长成新芽或原球茎，以后不断切割原球茎继代，即可几何级数增长。其培养基的配方为1/2MS+KT0.5mg/L+甘露醇1g/L+活性碳0.5g/L+蔗糖25g/L+琼脂3g/L，培养基PH值为5.0～6.0。
(3)生根培养：将较大的根系不发达的苗转入生根培养基上培养，植株生长旺盛，7周后形成5～7cm的小苗，根系发达。其培养基的配方为1/2MS+NAA0.5mg/L+活性碳0.5g/L+蔗糖25g/L+琼脂3g/L，培养基PH值为5.0～6.0。
(4)炼苗：将7～8厘米高的生根苗在室内自然光照条件下开瓶盖过渡1～1.5周后，取出洗净沾附在小苗根部的培养基备用。
(5)苗木菌根化：将取出的苗用含有菌根真菌的基质包裹种植于穴盘中，管护中保持适度温度，置于阴凉通风处栽培，期间只需叶部喷洒水，有利于新根生长，3周后移入温室中，进行正常水、肥、药管理，成活率可达95％以上，9.5月后即可得菌根化种苗。其基质是按重量份分别将1/4份泥炭、1/4份珍珠岩、1/4份干腐质土和1/4份红土中加入拌有菌液(Rhizoctonia sp.MLX102)的栎树叶三级菌种少许而得。
序列表
MLX102分子序列：
ATGTAAAGCGTCACTAGAAATAAGTGTCACAAAGGATATCTTGGCTCTCGCGTAGATGAAGAAAGCAGAGAAATATG
ATAAATAATGTGAAATGCAGAAATCAGTGAATCTTAGAATCTTTGAACGCGCCCTGCGCTCTCTGGTATTCCCTGGA
GCACGCGCGTGTGAGAGTCACGAAATTTTCAAAGTAAATATTTTGTTTAATCAAAAGGGTTTGCGTTGGACATGGAG
GTGTTTGCAGATTTCACGTGTGCTCTTCTTAAAAGCGCTAGAGGGATATCAGTATATGCTTTGTGCCACTCGGCGTG
ATAAGTGTCACACGCGGAGGACACAGTTTAAAAGGGGCCAGGAAATACAGATGAACCGCTTCTAATAGTCTATTAAG
TTAGACAATTAATTTTAAGATCTATCTCAATCAGGTAGGACT

Claims (4)

1.一种墨兰种苗繁殖方法，其种苗获得主要包括种子萌发、原球茎继代增殖和生根培养过程，其特征在于该繁殖方法在种苗获得后还进行生根苗的炼苗及与菌根真菌的菌根化过程，具体为：
炼苗：将生根苗在室内自然光照条件下开瓶盖过渡1～1.5周后取出，洗净沾附在小苗根部的培养基备用；
苗木菌根化：将取出的小苗用含有菌根真菌的基质包裹种植于穴盘中，在适度温度下，置于阴凉通风处栽培，期间向叶部喷洒水，促进新根生长，3周后移入温室中进行正常水、肥、药管理，9.5月后即可得菌根化种苗；所述的基质是按重量份分别将1/4份泥炭、1/4份珍珠岩、1/4份干腐质土和1/4份红土中加入拌有菌液(Rhizoctonia sp.MLX102)的栎树叶三级菌种少许而得。
2.如权利要求1所述的一种墨兰种苗繁殖方法，其特征在于所述的种子萌发过程主要包括以下步骤：
a)外植体的选择：选择墨兰未裂开的蒴果为外植体；
b)种子处理：将墨兰蒴果无菌处理后取出粉沫状种子无菌处理；
c)种子萌发：将经处理的墨兰种子均匀播种在种子萌发培养基上培养生长为原球茎；所使用的培养基配方为：1/2MS+NAA0.5～1.0mg/L+6-BA0.5～1.0mg/L+100ml/L椰乳+甘露醇1g/L+活性碳0.5g/L+蔗糖25g/L+琼脂3g/L，培养基PH值为5.0～6.0。
3.如权利要求1所述的一利墨兰种苗繁殖方法，其特征在于所述的原球茎继代增殖过程是将初代培养的原球茎和芽分别在培养基上继代增殖培养50～60天，长成新芽或原球茎，以后不断切割原球茎继代，即可几何级数增长；所使用的培养基配方为：1/2MS+KT0.5mg/L+甘露醇1g/L+活性碳0.5g/L+蔗糖25g/L+琼脂3g/L，培养基PH值为5.0～6.0。
4.如权利要求1所述的一种墨兰种苗繁殖方法，其特征在于所述的生根培养过程是将较大的根系不发达的苗转入生根培养基上培养，使生根率达95％以上，植株生长旺盛，7周后形成5～7cm的小苗；所使用的培养基配方为：1/2MS+NAA0.5mg/L+活性碳0.5g/L+蔗糖25g/L+琼脂3g/L，培养基PH值为5.0～6.0。
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