CN109105263A - 一种国兰根状茎组织培养快速繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种国兰根状茎组织培养快速繁殖方法，包括外植体的消毒和茎尖的剥离、接种培养、根状茎的获取和增殖培养、根状茎分化出芽培养、壮苗培养等步骤，在接种培养、根状茎的获取和增殖培养、根状茎分化出芽培养、壮苗培养时采用相同的培养基去进行培养，能同时满足各个时期的营养和激素需求。该发明，采用无性繁殖的方式，极大程度的提高了根状茎的出芽率，分化出的芽100％会长根；且出苗率高达95％，可以较快的得到更多的国兰植株，满足国兰大规模商业生产需求。

Description

一种国兰根状茎组织培养快速繁殖方法

技术领域

本发明涉及植物生物领域，通过组织培养的无性繁殖获得植株，特别涉及 一种国兰根状茎组织培养快速繁殖方法。

背景技术

中国兰一般指植物中的若干种地生兰，主要有春兰、蕙兰、建兰、墨兰、 寒兰、及春剑等。中国兰又称东方兰、东洋兰，主要分布在中国、日本、朝鲜 等地。兰花栽培历史已有千年之久，被誉为“花中君子”“天下第一香”。是我 国的传统十大名花之一，其叶态绰约多姿，色泽终年常青，花朵幽香高洁，并 且具有深厚的文化底蕴，是野生植物中经济价值和观赏价值较高的植物种类， 兰花正是因为具备形、神、色、香、韵，从古至今得到人们的喜爱和推崇。

但是中国兰的种子在自然条件下繁殖困难，且实生苗难以保持其父本的优 良性状特征。而传统栽培靠分株繁殖，繁殖周期长，且繁殖率低，难以满足规 模化生产的需要。而现有的组织培养方法，不仅根状茎的出芽率极低，同时无 法保证芽最后能够100％生根。针对这些问题，本发明提供一种国兰根状茎组织 培养快速繁殖方法，提高国兰根状茎的出芽率、确保芽能100％生根，同时还能 提高国兰的出苗率，能获得大量的国兰，满足大规模商业化生产的需求。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种国兰根状茎组织培养快 速繁殖方法，提高根状茎出芽率、出苗率。

本发明所采用的技术方案为：

一种国兰根状茎组织培养快速繁殖方法，在整个国兰根状茎组织培养中， 均采用由美国花宝1号+萘乙酸0.1-5mg/L+6-苄氨基腺嘌呤1-5mg/L+香蕉汁500-1500mg/L+马铃薯汁500-1500mg/L+蛋白胨500-1500mg/L+活性炭0.5-2 mg/L组成的母瓶培养基，该母瓶培养基可以满足国兰各个生长时期的营养和激 素需求；并包括外植体的消毒和茎尖的剥离、接种培养、根状茎的获取和增殖 培养、根状茎分化出芽培养、壮苗培养等步骤：

在外植体的选择消毒和茎尖的剥离时，取国兰叶片未张开的芽为外植体， 用流水冲洗春兰的芽，除去附着在芽上的尘土；用酒精、漂白水进行消毒处理， 多次用无菌水冲洗，建立外植体的无菌体系，最后用无菌解剖刀，剥出茎尖， 剥茎实验结果显示，成功率高达80％以上，而多次消毒处理可确保得到的茎尖 的没有被污染，提高后期培养的存活率。

在茎尖进接种培养时：将茎尖接种到母瓶培养基中培养数月，提高茎尖的 生命力。

而在根状茎的获取和增殖培养时，将接种培养数月后的茎尖接种到新的母 瓶培养基中培养，培养数月后，获得根状茎，继续培养，获得根状茎会增殖， 可获得一定量的根状茎，实验统计结果显示根状茎的增殖系数大于3。

接下来将根状茎进行分化出芽培养，将根状茎接种到新的母瓶培养基中培 养，培养数月后，观察发现，可以获得一定成熟的根状茎，根状茎能分化出芽， 芽在生长时会长根，继续培养，至小芽长为3cm左右小苗。

再将小苗进行壮苗培养，将小苗接种至新的母瓶培养基中培养，培养一段 时间后，苗已经成熟，能够适应正常的外界环境，可以出苗移植培养，实验发 现出苗率高达95％。

作为优选，在外植体的选择消毒时，取国兰叶片未开口的芽为外植体，用 流水冲洗国兰的小芽后，再用70-75％的酒精浸泡30-45秒，对小芽进行充分的 消毒处理，接着用无菌水冲洗4-5次，除去残留在小芽上的酒精；再加一滴洗洁 精为展着剂且稀释10倍的漂白水处理10-15分钟，对小芽进行彻底消毒，再紧 接着用无菌水冲洗4-5次，最后放在无菌纸上吸干水分，用无菌解剖刀，切茎段， 剥茎尖，实验结果显示成功率达到80％。

作为优选，在接种培养时，将茎尖接种到母瓶培养基中培养6个月，前30 天茎尖在完全黑暗的环境中培养，防止开始培养时茎尖在强光作用下褐变死亡， 之后，在光照强度1000lux条件下，每天光照12小时，温度为25±1℃的环境中 继续培养，增强茎尖对培养基的适应力，提高后期培养的存活率。

作为优选，在根状茎的获取和增殖培养时，将接种培养后的茎尖接种至新 的母瓶培养基中培养，每天光照12小时，光照强度1000lux，温度25±1℃，可 获得根状茎，获得根状茎会增殖，共培养6个月左右的时间后，可以获得一定 量的根状茎，实验显示根状茎的增殖系数大于3，可以获得足够后期继续培养所 需的根状茎。

作为优选，在根状茎的分化出芽培养时，将根状茎接种至新的母瓶培养基 后，每瓶接种15条根状茎，在光照强度1000lux条件下，每天光照12小时，温 度为25±1℃，培养90天左右的时间，有一定成熟的根状茎会分化出芽，同时长 根，继续培养至160-180天左右的时间，实验结果发现每瓶母瓶培养基可出8-12 株苗，根状茎的出芽率可达53.3％-80％，而以往常规的培养基，根状茎的出芽 率极低，只有13.3％-20％，因此采用这种母瓶培养基去培养，很大程度的提高 了根状茎的出芽率，满足后期大规模的获得国兰完整植株的需求。

作为优选，在壮苗培养时，将小苗切出来只带0.5厘米长的根状茎，进行壮 苗培养，接种至壮苗培养基中，每天光照12小时，光照强度2000lux，温度25±1℃， 培养90-120天左右的时间，可以获得具有较强的生命力，能适应外界环境的苗， 可进行出苗处理，实验结果显示出苗率高达95％以上，出苗后，将苗进行炼苗 处理，再洗苗，将苗放入稀释了800倍大生浸泡，提高苗的抗菌，抗病能力， 最后用小号松树皮种植国兰，得到完整的国兰植株，且种植成活率高达95％以 上，能够获得大量的满足商业需求的国兰植株。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明采用无性组织培养的技术极大程度的提高了国兰的增殖系数，改 善传统的分株繁殖，一年仅能繁殖3个芽，难以满足规模化生产的需求这一缺 陷，而采用本发明的方法，繁殖量呈指数倍增加，能满足国兰商业化生产需求。

(2)本发明在外植体的消毒过程中，采用酒精、漂白水进行多次消毒，并采 用无菌水进行多次冲洗，可以确保剥出的茎尖是未被污染的，使得茎尖具有较 高的存活率。

(3)本发明在茎尖的接种培养、根状茎的获取和增殖培养、根状茎分化出芽 培养及壮苗培养这四个阶段均采用同一种培养基去培养，简化了组织培养的生 产程序，降低了生产成本。

(4)采用由美国花宝1号+萘乙酸0.1-5mg/L+6-苄氨基腺嘌呤1-5mg/L+香蕉 汁500-1500mg/L+马铃薯汁500-1500mg/L+蛋白胨500-1500mg/L+活性炭 0.5-2mg/L组成的母瓶培养基进行根状茎分化出芽培养，极大程度的提高了根状 茎的出芽率；且分化出的芽100％会长根，而避免实施以往组织培养中生根培养 这一步骤，而通常的生根培养这一步骤是无法确保芽100％生根的。

(5)采用同种母瓶培养基进行壮苗培养，可以获得高达95％以上的出苗率， 且苗移植栽培的存活率高达95％以上，能够获得大量的完整的国兰植株，满足 大规模商业生产的需求，改善传统方法培养周期长且难以大量获得国兰植株的 缺陷。

(6)本发明用根状茎直接分化的苗进行壮苗培养，不仅苗壮、根多且易存活， 能实现国兰大面积的种植，获得大量的国兰完整植株。

(6)采用本发明公布的方法，成功获得了大量完整的蕙兰五福圣蝶、蕙兰仙 绿梅、建兰富山奇蝶、墨兰东方红神荷、春兰天彭牡丹的植株。

具体实施方式

为使本发明解决的上述的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结 合具体实施例进行详细描述。

本发明涉及一种国兰根状茎组织培养快速繁殖方法，在整个国兰根状茎组 织培养中，均采用由美国花宝1号+萘乙酸0.1-5mg/L+6-苄氨基腺嘌呤1-5mg/L+ 香蕉汁500-1500mg/L+马铃薯汁500-1500mg/L+蛋白胨500-1500mg/L+活性炭 0.5-2mg/L组成的母瓶培养基，该母瓶培养基可以满足国兰各个生长时期的营养 和激素需求；并包括外植体的消毒和茎尖的剥离、接种培养、根状茎的获取和 增殖培养、根状茎分化出芽培养、壮苗培养等步骤：

在外植体的选择消毒和茎尖的剥离时，取国兰叶片未开口的芽为外植体， 用流水冲洗国兰的小芽后，再用70-75％的酒精浸泡30-45秒，对小芽进行充分 的消毒处理，接着用无菌水冲洗4-5次，除去残留在小芽上的酒精；再加一滴洗 洁精为展着剂且稀释10倍的漂白水处理10-15分钟，对小芽进行彻底消毒，再 紧接着用无菌水冲洗4-5次，最后放在无菌纸上吸干水分，用无菌解剖刀，切茎 段，剥茎尖，实验结果显示成功率达到80％，而多次消毒处理可确保得到的茎 尖的没有被污染，提高后期培养的存活率。

在茎尖进接种培养时：将茎尖接种到母瓶培养基中培养6个月左右的时间， 前30天茎尖在完全黑暗的环境中培养，防止开始培养时茎尖在强光作用下褐变 死亡，之后，在光照强度1000lux条件下，每天光照12小时，温度为25±1℃ 的环境中继续培养，增强茎尖对培养基的适应力，提高后期培养的存活率。

而根状茎的获取和增殖培养时，将接种培养数月后的茎尖接种到新的母瓶 培养基中培养，每天光照12小时，光照强度1000lux，温度25±1℃，实验发现 可获得根状茎，且获得根状茎会增殖，共培养6个月左右的时间后，可以获得 一定量的根状茎，实验结果显示根状茎的增殖系数大于3，可以获得足够后期继 续培养所需的根状茎。

接下来在根状茎分化出芽培养时，将根状茎接种到新的母瓶培养基中培养， 每瓶接种15条根状茎，在光照强度为1000lux条件下，每天光照12小时，温 度为25±1℃，培养90天左右的时间，实验发现有一定成熟的根状茎会分化出芽， 同时长根，继续培养至160-180天左右的时间，小芽长为3cm左右小苗；每瓶 母瓶培养基可出8-12株苗，根状茎的出芽率可达53.3％-80％，而以往常规的培 养基，根状茎的出芽率极低，只有13.3％-20％，因此采用这种母瓶培养基去培 养，很大程度的提高了根状茎的出芽率，满足后期大规模的获得国兰完整植株 的需求。

再将小苗进行壮苗培养，将小苗切出来只带0.5厘米长的根状茎，进行壮苗 培养，再将其接种至新的母瓶培养基中，每天光照12小时，光照强度2000lux， 温度25±1℃，培养90-120天左右的时间，实验发现可以获得具有生命力，能适 应外界环境的苗，可进行出苗处理，出苗率高达95％以上，出苗后，将苗进行 炼苗处理，再洗苗，将苗放入稀释了800倍大生浸泡，提高苗的抗菌，抗病能 力，最后用小号松树皮种植国兰，得到完整的国兰植株，且种植成活率高达95％ 以上，能够获得大量的满足商业需求的国兰植株。

采用本发明所公布的一种国兰根状茎组织培养快速繁殖方法，成功建立了 蕙兰五福圣蝶、蕙兰仙绿梅、建兰富山奇蝶、墨兰东方红神荷、春兰天彭牡丹 的外植体无菌体系，得到了完整的蕙兰五福圣蝶、蕙兰仙绿梅、建兰富山奇蝶、 墨兰东方红神荷、春兰天彭牡丹的植株。培养各种国兰的母瓶培养基的具体成 分含量如下：

培养蕙兰五福圣蝶的培养基的具体由美国花宝1号+萘乙酸0.1-5mg/L mg/L+6-苄氨基腺嘌呤1-5mg/L+香蕉汁700mg/L+马铃薯汁600mg/L+蛋白胨 900mg/L+活性炭1mg/L组成。

培养蕙兰仙绿梅的培养基具体由由美国花宝1号+萘乙酸0.1-5mg/L+6-苄氨 基腺嘌呤1-5mg/L+香蕉汁600mg/L+马铃薯汁500mg/L+蛋白胨1000mg/L+活 性炭1.5mg/L组成

培养建兰富山奇蝶的培养基具体由由美国花宝1号+萘乙酸0.1-5mg/L+6- 苄氨基腺嘌呤1-5mg/L+香蕉汁600mg/L+马铃薯汁500mg/L+蛋白胨1000mg/L +活性炭0.8mg/L组成

培养墨兰东方红神荷的培养基具体由美国花宝1号+萘乙酸0.1-5mg/L+6- 苄氨基腺嘌呤1-5mg/L+香蕉汁800mg/L+马铃薯汁700mg/L+蛋白胨1100mg/L +活性炭1mg/L组成。

培养春兰天彭牡丹的培养基具体由美国花宝1号+萘乙酸0.1-5mg/L+6-苄氨 基腺嘌呤1-5mg/L+香蕉汁700mg/L+马铃薯汁1000mg/L+蛋白胨900mg/L+活 性炭1mg/L组成。

采用相应的母瓶培养基，通过本发明所公布的方法步骤，从表1可看出蕙 兰五福圣蝶、蕙兰仙绿梅、建兰富山奇蝶、墨兰东方红神荷、春兰天彭牡丹采 用本发明所公布的方法都有较高的根状茎的增殖率、根状茎出芽率；出的芽长 成小苗100％都会生根，且通过本发明公布的方式获得的苗在种植的过程中都具 备非常高的存活率。

表1不同品种国兰根状茎的出苗情况

注：每个品种调查30瓶，每瓶接种15条根状茎

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于 此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到 变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应 以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (6)

1.一种国兰根状茎组织培养快速繁殖方法，其特征在于：在整个组织培养中，均采用由美国花宝1号+萘乙酸0.1-5mg/L+6-苄氨基腺嘌呤1-5mg/L+香蕉汁500-1500mg/L+马铃薯汁500-1500mg/L+蛋白胨500-1500mg/L+活性炭0.5-2mg/L组成的母瓶培养基，并包括如下步骤：

(1)外植体的选择消毒和茎尖的剥离:取国兰叶片未张开的芽为外植体，用流水冲洗春兰的芽，用酒精、漂白水进行消毒处理，多次用无菌水冲洗，最后用无菌解剖刀，剥出茎尖；

(2)接种培养：将茎尖接种到母瓶培养基中培养数月；

(3)根状茎的获取和增殖培养：将接种培养数月后的茎尖接种到新的母瓶培养基中培养，培养数月后，获得由茎尖诱导的根状茎及增殖的根状茎，且根状茎的增殖系数大于3；

(4)根状茎分化出芽培养：将根状茎接种到新的母瓶培养基中培养，培养数月后，生长至一定成熟的根状茎分化出芽，分化出的芽在培养时会长根，继续培养至长到3cm左右的小苗；

(5)壮苗培养：将3cm左右的小苗接种到新的母瓶培养基中培养数月。

2.根据权利要求1所述的一种国兰根状茎组织培养快速繁殖方法，其特征在于：取国兰叶片未开口的芽为外植体，用流水冲洗国兰的小芽，再用70-75％的酒精浸泡30-45秒，无菌水冲洗多次；用稀释10倍并滴加了一滴洗洁精的漂白水处理10-15分钟，无菌水冲洗多次，放在无菌纸上吸干水分，用无菌解剖刀，切茎段，剥出茎尖，成功率达到80％。

3.根据权利要求1所述的一种国兰根状茎组织培养快速繁殖方法，其特征在于：将茎尖接种到母瓶培养基中培养6个月，前30天在完全黑暗的环境中培养，之后每天光照12小时，光照强度1000lux，温度25±1℃的环境下继续培养。

4.根据权利要求1所述的一种国兰根状茎组织培养快速繁殖方法，其特征在于：在根状茎的获取和增殖培养时，将接种培养后的茎尖转接到新的母瓶培养基中培养6个月左右，每天光照12小时，光照强度1000lux，温度25±1℃，获得一定量的根状茎。

5.根据权利要求1所述的一种国兰根状茎组织培养快速繁殖方法，其特征在于：在根状茎分化出芽培养时，培养90天左右的时间，根状茎分化出芽并长根，出芽率为53.3％-80％，培养至160-180天左右，小苗长到3cm左右。

6.根据权利要求1所述的一种国兰根状茎组织培养快速繁殖方法，其特征在于：将小苗切出只带0.5厘米长的根状茎，进行壮苗培养，培养90-120天后，出苗，且出苗率为95％。