CN111869660B - 一种国兰根状茎包埋及低温保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物培养技术领域，具体设计一种国兰根状茎包埋保存的方法，该方法包括以下步骤：将国兰组培根状茎切成0.2~0.4 cm的段，与3.5%（w/v）海藻酸钠包埋液混合后滴入75.0 mmol·L‑1氯化钙包埋液中，反应20 min制备包埋珠，其合格率平均为97.60%，萌发率平均为92.00%。将吸干水分的包埋珠放入冷冻管，后放入4°C冰箱黑暗保存，180 d后存活率为68.00%，再生率为64.00%。本发明为国兰种植资源离体保存提供了一种新的方法，该方法材料利用率高、操作简便、保存时间较长、保存后萌发率高、再生率高。

Description

一种国兰根状茎包埋及低温保存方法
技术领域
本发明涉及植物培养领域，具体地涉及一种国兰根状茎包埋及低温保存方法。
背景技术
国兰为兰科（Orchidaceae）兰属（Cymbidium）地生兰中的一部分类群，是我国的国粹，也是东亚（日本、韩国等）地区的传统名花，主要有春兰（C. goeringii）、寒兰（C. kanran）、建兰（C. ensifolium）、蕙兰（C. faberi）和墨兰（C. sinense）。国兰株型修长健美，叶姿优雅俊秀，花色艳丽多变，香味清醇久远，具有非常高的文化价值、观赏价值和经济价值。
种质资源是植物种及其所有品种的全部基因遗产，如何收集、保存、评价和利用种质资源库中的遗传资源是植物利用的永恒主题，但国兰资源数量庞大，种类繁多，在种质的保存和利用的实际操作过程中，出现许多困难和不利。首先，国兰资源保存方式大多选用实地保存，但此法占用耕地面积大，造成土地的浪费，并且对栽培环境和管理要求高，极易受人为管理因素的干扰而造成资源的消亡。其次，与其它兰花不同，国兰的原球茎很小，并且在很短的时间内发育成特定的器官，称为根状茎，并且在此阶段保留数年，这就使得国兰的离体保存不能参考应用现今大多数兰利用原球茎保存的方法。最后，现今的几种常用保存方法，如缓慢生长的保护方法，既费时又费空间，而超低温保存开发难度大，操作复杂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种国兰根状茎包埋及保存的方法，以解决现有技术中存在的上述问题。
本发明提供的技术方案如下：
1）国兰根状茎选取切段：取组织培养产生的无菌、健壮的根状茎，在超净工作台中，无菌培养皿上用解剖刀切成0.2~0.4 cm的段；
2）国兰根状茎包埋：取步骤1）切段的国兰根状茎与海藻酸钠包埋液混合，用镊子夹取覆盖有海藻酸钠包埋液的根状茎以水滴状滴入包埋液中；置于室温下反应20 min后用镊子将包埋珠取出并用无菌蒸馏水洗涤3次，每次5 min，清洗完后将包埋珠放到无菌滤纸上进行吸水干燥；
3）根状茎包埋珠的保存：取步骤2）所得干燥根状茎包埋珠，用镊子夹取，每5个一组放入1.8 mL冷冻管中，盖好盖子后放入冻存盒内继而放在4°C冰箱内黑暗保存；
4）保存后的萌发和再生：取步骤3）保存若干时间的装有根状茎包埋珠的冷冻管从冰箱内取出，用酒精消毒后在超净工作台内打开，用镊子夹取包埋珠转入萌发培养基中，1个月后，可将萌发出包埋珠的根状茎切下转入再生培养基中。
本发明的显著优点：
一、本发明方法以国兰根状茎为外植体，为组织培养材料，增殖快、数量多、污染低。
二、相对于实地保存，包埋保存占用空间小，管理要求低，可节省成本；相对于缓慢生长保存，包埋保存占用空间少，保存时间长，无需配制的大量培养基，从而使成本降低；相对于超低温保存，包埋保存开发简便，程序简化，无需液氮，从而降低成本，提高安全性。
三、与现有利用特定装置进行包埋的方法，本发明利用特定浓度的海藻酸钠包埋液和钙离子包埋液，反应特定的时间，即可用组培常用的镊子完成包埋过程，操作简化，成本低而合格率（包埋珠的外形和完整程度）高，且包埋后萌发率高。
四、国兰根状茎包埋珠在4°C冰箱内保存，无需添置其它设备。材料保存180 d后萌发率在60.00%以上，并且这些存活的根状茎均能再生成完整正常的植株。
附图说明
图1 国兰根状茎；
图2 利用特定浓度的海藻酸钠包埋液和钙离子包埋液制成的合格国兰根状茎包埋珠；
图3 利用其它浓度的海藻酸钠包埋液和钙离子包埋液制成的不合格国兰根状茎包埋珠；
图4 国兰根状茎包埋珠放置在1.8 mL冷冻管内；
图5 国兰根状茎包埋珠保存180 d后萌发；
图6 国兰根状茎包埋珠保存180 d后再生及再生植株。
具体实施方式
在下述实施例中所述的海藻酸钠包埋液、钙离子包埋液、蒸馏水均经过121°C高压灭菌30 min，灭菌前将pH调至5.8。所用工具如培养皿、滤纸、容器、冷冻管均经过121°C高压灭菌30 min。
实施例1
国兰根状茎选取切段：取组织培养产生的无菌、健壮的根状茎，在超净工作台中，无菌培养皿上用解剖刀切成0.3cm的段备用；
用镊子夹取切段的国兰根状茎放入海藻酸钠包埋液中与之混合，混合均匀后，用镊子夹取覆盖有海藻酸钠包埋液的根状茎单个在距钙离子包埋液液面8 cm左右时以水滴状滴入包埋液中。置于室温下反应20 min后用镊子将包埋珠取出并用无菌蒸馏水洗涤3次，每次5 min，清洗完后将包埋珠放到无菌滤纸上进行吸水干燥备用。所述海藻酸钠包埋液配方为：MS（不含CaCl2·2H2O）+3.5%（w/v）海藻酸钠+4.0 mg·L-1 NAA+30.0 g·L-1蔗糖；所述钙离子包埋液配方为：75.0 mmol·L-1CaCl2·2H2O。
所得干燥根状茎包埋珠，用镊子夹取，每5个一组放入1.8 mL冷冻管中，盖好盖子用后放入冻存盒继而放入4°C冰箱内黑暗保存。
将保存180 d后将装有根状茎包埋珠的冷冻管从冰箱内取出，用酒精消毒后在超净工作台内打开，用镊子夹取包埋珠转入萌发培养基中，1个月后，可将萌发出包埋珠的根状茎切下转入再生培养基中。所述萌发培养基为MS+4.0 mg·L-1 NAA+30.0 g·L-1蔗糖+1.0 g·L-1活性炭+7.5 g·L-1琼脂，所述再生培养基为MS+3.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1NAA+30.0 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1琼脂。
实施例2-实施例9
实施例2-实施例9中，海藻酸钠包埋液中海藻酸钠浓度为3.0、3.5、4.0 %（w / v），CaCl2·2H2O溶液浓度为50.0、75.0、100.0 mmol·L-1，2因素做3×3完全随机试验设计，具体组合见表1。其它步骤与实施例1相同。
合格率=合格的包埋珠数/总的50粒包埋珠×100%
合格与否主要取决于根状茎是否被覆盖，包埋珠是否坚固，透明，等径。统计时，在超净工作台中随机取制成的包埋珠50粒统计，该试验重复5次。
萌发率=萌发的（合格）包埋珠数/接种的（合格）包埋珠数×100%
萌发指包埋珠内根状茎伸出包埋珠约1.0 cm。统计时取合格的包埋珠50粒接入萌发培养基内，该试验重复5次。
实施例10-13
对于包埋后保存，设置以下试验：例10：未包埋的根状茎放入冷冻管，室温25°C条件下黑暗保存；例11：包埋的根状茎放入冷冻管，室温25°C条件下黑暗保存；例12：未包埋的根状茎放入冷冻管4°C（放入4°C冰箱内）下黑暗保存；例1：包埋的根状茎放入冷冻管4°C下黑暗保存。在180 d时每实施例取出冷冻管2管转入上述萌发培养基中进行恢复生长并统计萌发率，该试验重复5次。1个月后，将萌发出包埋珠的根状茎切下转入上述再生培养基中，统计再生率。
表1 实施例1与实施例2-9包埋珠合格率和萌发率对比
Figure DEST_PATH_IMAGE002
注：含有相同小写字母代表差异不显著
以合格率优先，综合萌发率来看，以3.5%的海藻酸钠和75.0 mmol∙L-1氯化钙的组合春兰根状茎包埋珠合格率和萌发率最高，分别为97.60%和92.00%。
表2 实施例1与实施例10-12保存180 d后萌发率和再生率对比
Figure DEST_PATH_IMAGE004
注：含有相同小写字母代表差异不显著
实施例10未包埋根状茎随着保存时间的延长，一些根状茎逐渐死亡，导致萌发率和再生率逐渐降低，到180 d时已无存活。实施例11包埋的根状茎在25°C保存，180 d后仍有存活，最终萌发率为56.00%，再生率稍有下降为44.00%。实施例12根状茎直接暴露于4°C，根状茎在低温下比在室温下可以保存稍长的时间，但180 d后仍全部死亡。与实施例10相近，实施例1包埋根状茎在4°C下保存，180 d后仍有大量存活，并在此温度下保存的包埋根状茎180 d后萌发率和再生率最高，分别为68.00%和64.00%。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明，因此无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

Claims (3)

1.一种国兰根状茎包埋及低温保存方法，其特征在于：以国兰组织培养产生的根状茎为材料，利用海藻酸钠和氯化钙的离子反应配置包埋液进行包埋，而后放入无菌冷冻管中并放入4～25°C黑暗保存，包括以下步骤：
（1）材料选取：采用无污染、生长健壮的国兰组培根状茎；
（2）材料处理：将选用的国兰根状茎在超净工作台中，无菌培养皿上用解剖刀切段，每段长0.2～0.4cm；
（3）配制包埋液：海藻酸钠包埋液配方为：MS+3.5%w/v海藻酸钠+4.0 mg·L-1 NAA+30.0g·L-1蔗糖；钙离子包埋液配方为：75.0 mmol·L-1CaCl2·2H2O，包埋液配方均用无菌蒸馏水配制；
（4）国兰根状茎包埋：在超净工作台中将用镊子将切段的国兰根状茎放入海藻酸钠包埋液并搅拌均匀，而后用镊子夹取覆盖有海藻酸钠包埋液的根状茎以水滴状滴入钙离子包埋液中，置于室温下反应20 min后用镊子将包埋珠取出并用无菌蒸馏水洗涤3次，每次5min，清洗完后将包埋珠放到无菌滤纸上进行吸水干燥；
（5）国兰包埋根状茎低温保存：将干燥好的包埋珠每5个一组放入1.8 mL冷冻管中，盖好盖子后放入冻存盒内并在4～25°C冰箱内黑暗保存；
（6）保存后的萌发与再生：将保存若干时间的装有根状茎包埋珠的冷冻管从冰箱内取出，用酒精消毒后在超净工作台内打开，用镊子夹取包埋珠转入萌发培养基中，1个月后，可将萌发出包埋珠的根状茎切下转入再生培养基中，萌发培养基为MS+4.0 mg·L-1 NAA+30.0g·L-1蔗糖+1.0 g·L-1活性炭+7.5g·L-1琼脂，再生培养基为MS+3.0 mg·L-1 6-BA+1.0mg·L-1 NAA+30.0 g·L-1蔗糖+7.5g·L-1琼脂。
2.根据权利要求1的一种国兰根状茎包埋及低温保存方法，其特征在于，步骤（2）国兰根状茎切段长度为0.3cm。
3.根据权利要求1的一种国兰根状茎包埋及低温保存方法，其特征在于，步骤（5）放入1.8 mL冷冻管中，盖好盖子后放入4°C冰箱内黑暗保存。
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