CN109302985A - 子莲的体外幼胚诱导和植株再生的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种子莲的体外幼胚诱导和植株再生的方法，该方法首先将幼胚接种于莲胚培养基上暗培养3～4周，然后将诱导出的新生莲胚组织转接到莲胚培养基上进行继代培养，在温度为24～26℃条件下进行暗培养，再将继代良好的莲胚组织移至莲胚培养基上进行光照培养最后将生长状态良好且转绿的莲胚组织移至新的成苗培养基上培养，形成莲试管苗；本发明能够克服莲远缘杂交后代结实率低的问题，提高莲远缘杂交后代的存活率，在莲遗传改良和品种选育上有一定的应用价值。

Description

子莲的体外幼胚诱导和植株再生的方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养领域，具体涉及一种子莲的体外幼胚诱导和植株再生的方法。
背景技术
莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)属睡莲科(Nymphaeaceae)莲属(Nelumbo Adans)植物，是一种多年生水生蔬菜类作物。莲属植物包括中国莲(N.nucifera Gaertn.)和美洲黄莲(N.lutea Pers.)两个种。中国是莲的起源中心之一，莲在我国有着悠久的栽培和驯化历史，中国古籍《诗经》中就有“山有扶苏，隰有荷华”、“彼泽之陂，有蒲与荷”的诗句。莲的栽培面积广泛，资源类型丰富，我国黄河以南及长江流域等地最适合莲的生长(孔庆东，中国水生蔬菜品种资源，湖北科学技术出版社，2004:3)。
随着人类的长期驯化，莲逐渐分化为子莲、藕莲和花莲三个类型。藕莲和子莲可供人类食用，花莲可供观赏，另外莲的全株都可入药，有极高的药用价值，《本草纲目》记载“藕可交心肾，厚肠胃，固精气，强筋骨，补虚损，利耳目，除寒湿，止脾泄”(孔庆东，中国水生蔬菜品种资源，湖北科学技术出版社，2004:3)。近20年来，国内外在莲的园艺分类、生理生化、生长发育、组织培养及遗传育种等方面做了相关研究(王芸等，分子标记技术在莲遗传多样性分析中的应用，长江蔬菜，2009(16):8-10)，特别是国内人员在莲的组织培养上已做了许多工作，彭静等利用藕莲茎尖进行了莲的组织培养和快速繁殖研究，成功诱导分化丛芽及莲试管苗(彭静等，莲藕的组织培养与快速繁殖，植物生理学通讯，2001，37(1):38)，柯卫东等利用藕莲的茎尖成功诱导出试管藕(柯卫东等，试管藕诱导技术研究，武汉植物学研究，2001，19(2):173-175)，周以飞等利用子莲品种的幼嫩胚芽成功诱导出丛芽(周以飞等，不同生境型子莲组培苗的快繁研究，植物生理学通讯，2005，41(2):184)，何子灿和刘士佳利用花莲幼胚诱导出愈伤组织(何子灿和刘士佳，莲胚愈伤组织诱导及植株再生的研究，水生生物学报，1987，11(3):278-280)。虽然莲的组织培养技术已经较为成熟，但仍存在以下缺点：
(1)采用的接种外植体多为莲的茎尖，由于莲根状茎生长与泥土里，从根状茎上取下的茎尖常带有病菌，若消毒过程不彻底容易发生污染；
(2)莲根状茎挖取费时费力，一支莲根状茎上的茎尖个数有限，导致莲茎尖组培和快繁的启动效率较低，并且莲的茎尖快繁系数很低；
(3)利用莲幼胚作为外植体进行组培快繁，现阶段仅停留在诱导出丛芽与生根，极少数能够成苗，推广应用受到限制。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种子莲的体外幼胚诱导和植株再生的方法，该方法实现了从莲幼胚到莲植株的培养全过程，成苗率达到50％以上。
为实现上述目的，本发明所设计一种子莲的体外幼胚诱导和植株再生的方法，包括以下步骤：
1)接种幼胚：以鄂子莲1号正常开花授粉后3～5天的籽粒为材料，经清洗消毒处理后，剥去外层表皮，切取幼胚(3～5天胚龄)接种于莲胚培养基上，在温度为24～26℃下进行暗培养3～4周，诱导得到新生莲胚组织；其中，莲胚培养基为MS基础培养基+4.0～6.0mg/LNAA+0.4～0.6mg/L ZT+30.0g/L蔗糖+6.5g/L琼脂，pH值为5.8～6.0；
2)继代培养：将诱导出的新生莲胚组织转接到莲胚培养基上进行继代培养，在温度为24～26℃条件下进行暗培养3～4周，使莲胚组织继续生长；
3)光照培养：将继代良好的莲胚组织移至莲胚培养基上进行光照培养3～4周，光照度2000～2500lx，每天光照12h，直至莲胚组织转绿并出芽；
4)诱导成苗：将生长状态良好且转绿的莲胚组织移至新的成苗培养基上培养1～2次，每次3～4周，光照度2000～2500lx，每天光照12h，直至形成莲试管苗，其中，成苗培养基为MS基础培养基+1.0～2.0mg/L 6-BA+0.4～0.6mg/L ZT+30.0g/L蔗糖+6.5g/L琼脂+0.5g/L活性炭，pH值为5.8～6.0。
进一步地，所述步骤1)中，子莲的品种为鄂子莲1号。
再进一步地，所述步骤1)～3)中，莲胚培养基为MS基础培养基+5.0mg/L NAA+0.5mg/L ZT+30.0g/L蔗糖+6.5g/L琼脂，pH为5.8。
再进一步地，所述步骤4)中，成苗培养基为MS基础培养基+1.5mg/L 6-BA+0.5mg/LZT+30.0g/L蔗糖+6.5g/L琼脂+0.5g/L活性炭，pH为5.8。
通过子莲幼胚的诱导培养及植株再生的过程，本发明具有以下优点：
1)子莲的体外幼胚在诱导、继代和光照培养过程中，选用统一的莲胚培养基，节约了实验成本，使实验步骤更加简便易行，并提高了子莲的体外幼胚的诱导率，达到50％以上，且优选到70％以上。
2)本发明所用的培养基能够使成苗率达到30％以上，优选到50％以上，这是现阶段其他莲幼胚培养研究所未曾达到的。
3)本发明能够克服莲远缘杂交后代结实率低的问题，提高莲远缘杂交后代的存活率，在莲遗传改良和品种选育上有一定的应用价值。
4)以莲幼胚为外植体进行组织培养，外植体不易带病菌，降低了组培过程中的污染。鄂子莲1号着粒较密，心皮数可达40个左右，结实率可达77％，利用子莲幼胚为培养材料解决了莲根状茎挖取困难以及茎尖个数有限等问题。
附图说明
图1为诱导培养基中诱导出的浅黄色致密新生莲胚组织图；
图2为诱导培养基上培养4周的莲胚组织图；
图3为继代培养的成熟莲胚图；
图4为光照培养的莲胚，部分已出芽并长出叶片图；
图5为诱导培养中的莲试管苗图；
图6为长成的莲试管苗图，图中可见新生的莲顶芽、叶柄及须根。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
子莲的体外幼胚诱导和植株再生的方法，包括以下步骤：
1)接种幼胚：以子莲正常开花授粉后3～5天的籽粒为材料，经清洗消毒处理后，剥去外层表皮，切取幼胚(3～5天胚龄)接种于莲胚培养基上，在温度为24～26℃下进行暗培养3～4周，诱导得到新生莲胚组织；其中，莲胚培养基为MS基础培养基+4.0～6.0mg/L NAA+0.4～0.6mg/L ZT+30.0g/L蔗糖+6.5g/L琼脂，pH值为5.8～6.0；
2)继代培养：将诱导出的新生莲胚组织转接到莲胚培养基上进行继代培养，在温度为24～26℃条件下进行暗培养3～4周，使莲胚组织继续生长；
3)光照培养：将继代良好的莲胚组织移至莲胚培养基上进行光照培养3～4周，光照度2000～2500lx，每天光照12h，直至莲胚组织转绿并出芽；
4)诱导成苗：将生长状态良好且转绿的莲胚组织移至新的成苗培养基上培养1～2次，每次3～4周，光照度2000～2500lx，每天光照12h，直至形成莲试管苗，其中，成苗培养基为MS基础培养基+1.0～2.0mg/L 6-BA+0.4～0.6mg/L ZT+30.0g/L蔗糖+6.5g/L琼脂+0.5g/L活性炭，pH值为5.8～6.0。
根据上述步骤选用NAA和ZT的不同用量，对子莲幼胚诱导培养基配方的优化，优化实验对比如下：
筛选NAA和ZT的配比浓度，确定4.0～6.0mg/L NAA和0.4～0.6mg/L ZT为莲胚培养再生的优选配比浓度，通过进一步的优化对比实验表明成苗率能达到50％以上，5.0mg/LNAA和0.5mg/L ZT为最优配比浓度。
实施例1
鄂子莲1号的体外幼胚诱导和植株再生的方法，包括以下步骤：
1)外植体的取材与消毒：取鄂子莲1号正常开花授粉后3～5天的籽粒，用无菌水清洗3次，用70％酒精浸泡30s，再用0.1％升汞溶液浸泡3～5min消毒，然后无菌水清洗3次，每次3～5min，将籽粒移至无菌滤纸上吸干表面水分，剥去外层表皮，切取里面的幼胚作为外植体备用；
2)接种幼胚：切取幼胚(3～5天胚龄)接种于莲胚培养基上，培养基的pH值为5.8，在温度为24～26℃下进行暗培养4周(图1)，诱导得到新生莲胚组织(图2)；其中，莲胚培养基为MS基础培养基+4.0～6.0mg/L NAA+0.4～0.6mg/L ZT+30.0g/L蔗糖+6.5g/L琼脂，pH值为5.8；
3)继代培养：将诱导出的新生莲胚组织转接到莲胚培养基上进行继代培养，在温度为24～26℃条件下进行暗培养4周(图3)，使莲胚组织继续生长；
4)光照培养：将继代良好的莲胚组织移至莲胚培养基上进行光照培养4周，光照度2000～2500lx，每天光照12h，直至莲胚组织转绿并出芽(图4)；
5)诱导成苗：将生长状态良好且转绿的莲胚组织移至新的成苗培养基上继代培养1～2次(每次4周)，培养基的pH值为5.8～6.0，光照度2000～2500lx，每天光照12h，直至形成莲试管苗(图5～6)，其中，成苗培养基为MS基础培养基+1.0～2.0mg/L 6-BA+0.4～0.6mg/L ZT+30.0g/L蔗糖+6.5g/L琼脂+0.5g/L活性炭，pH值为5.8。
上述方法幼胚的诱导率71％，成苗率为53％。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (4)

1.一种子莲的体外幼胚诱导和植株再生的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)接种幼胚：以子莲正常开花授粉后3～5天的籽粒为材料，经清洗消毒处理后，剥去外层表皮，切取幼胚接种于莲胚培养基上，在温度为24～26℃下进行暗培养3～4周，诱导得到新生莲胚组织；其中，莲胚培养基为MS基础培养基+4.0～6.0mg/L NAA+0.4～0.6mg/L ZT+30.0g/L蔗糖+6.5g/L琼脂，pH值为5.8～6.0；
2)继代培养：将诱导出的新生莲胚组织转接到莲胚培养基上进行继代培养，在温度为24～26℃条件下进行暗培养3～4周，使莲胚组织继续生长；
3)光照培养：将继代良好的莲胚组织移至莲胚培养基上进行光照培养3～4周，光照度2000～2500lx，每天光照12h，直至莲胚组织转绿并出芽；
4)诱导成苗：将生长状态良好且转绿的莲胚组织移至新的成苗培养基上培养1～2次，每次3～4周，光照度2000～2500lx，每天光照12h，直至形成莲试管苗，其中，成苗培养基为MS基础培养基+1.0～2.0mg/L 6-BA+0.4～0.6mg/L ZT+30.0g/L蔗糖+6.5g/L琼脂+0.5g/L活性炭，pH值为5.8～6.0。
2.根据权利要求1所述子莲的体外幼胚诱导和植株再生的方法，其特征在于：所述步骤1)中，子莲的品种为鄂子莲1号。
3.根据权利要求1所述子莲的体外幼胚诱导和植株再生的方法，其特征在于：所述步骤1)～3)中，莲胚培养基为MS基础培养基+5.0mg/L NAA+0.5mg/L ZT+30.0g/L蔗糖+6.5g/L琼脂，pH为5.8。
4.根据权利要求1所述子莲的体外幼胚诱导和植株再生的方法，其特征在于：所述步骤4)中，成苗培养基为MS基础培养基+1.5mg/L6-BA+0.5mg/L ZT+30.0g/L蔗糖+6.5g/L琼脂+0.5g/L活性炭，pH为5.8。
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