CN105684901B - 一种荒漠区药用植物黑果枸杞的快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种荒漠区药用植物黑果枸杞的快速繁殖方法，包括以下步骤：一、无菌苗的培养(MS培养基)，二、愈伤组织诱导(MS+0.3mg/L 6‑苄氨基腺嘌呤+1.0mg/L 2,4‑二氯苯氧乙酸)，三、丛生芽增殖培养(MS+3.0mg/L 6‑苄氨基腺嘌呤+0.3mg/L激动素+0.5mg/L萘乙酸)，四、生根培养(1/2MS+0.5mg/L萘乙酸+0.5mg/L MgSO4)，各步骤的培养条件一样，均为：温度24±2℃、光照强度1500‑2000lx、光照时间14h/d。本发明的有益之处在于：通过采用组织培养的方法，在人工控制的条件下，实现了黑果枸杞种苗的快速繁殖(从愈伤组织诱导到幼苗生根仅需55d)，较以往的有性繁殖相比，不仅能避免植物在生长过程中出现性状分离，而且还具有繁殖速度快、成本低、成活率高、成苗速度快等优势。
Description
技术领域
本发明涉及一种药用植物的繁殖方法，具体涉及一种荒漠区药用植物黑果枸杞的快速繁殖方法，属于植物繁殖技术领域。
背景技术
黑果枸杞(Lycium ruthencium)在甘肃主要分布于河西走廊及黑河流域，属于典型的荒漠植物。它对环境条件适应能力极强，抗旱、耐寒、耐贫瘠、耐盐碱。近年来，因其果实可入药具有增强免疫力、延缓衰老、预防癌症、改善睡眠等功效而被广泛推广种植，但普遍存在成活率低、繁殖速度慢等问题。
目前，国内外对黑果枸杞的研究主要集中在色素提取、药理研究、耐盐生理机制及育苗技术等方面，而关于组织培养系统的研究未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种荒漠区药用植物黑果枸杞的快速繁殖方法，该快速繁殖方法从植物组织培养学的角度出发，筛选培养基配方、优化培养条件，通过对黑果枸杞进行愈伤组织诱导、增殖培养及生根培养，可以实现黑果枸杞的快速繁殖。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种荒漠区药用植物黑果枸杞的快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
一、无菌苗的培养：
将种子洗净并置于超净工作台内，先用70％乙醇浸泡，无菌水冲洗，再用0.1％HgCl2溶液浸泡，无菌水冲洗，最后用已灭菌的滤纸吸掉种子表面的水渍后接种于MS培养基上，在温度24±2℃、光照强度1500-2000lx、光照时间14h/d的环境下培养；
二、愈伤组织诱导：
待种子发芽后，取生长10d无菌苗的叶片并切成0.3cm×0.3cm的小片，或者取生长10d无菌苗的茎段/下胚并切成0.5-0.7cm的小段，然后接种在诱导培养基中进行培养，诱导培养基配方：MS+0.3mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+1.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，培养条件：温度24±2℃、光照强度1500-2000lx、光照时间14h/d；
三、丛生芽增殖培养：
待愈伤组织生长15d后，将愈伤组织转接至增殖培养基中继续进行培养，增殖培养基的配方：MS+3.0mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+0.3mg/L激动素+0.5mg/L萘乙酸，培养条件：温度24±2℃、光照强度1500-2000lx、光照时间14h/d；
四、生根培养：
剪切增殖培养带有叶尖的不定芽，将剪切下来的不定芽转接入生根培养基中进行生根培养，生根培养基的配方：1/2MS+0.5mg/L萘乙酸+0.5mg/L MgSO4，培养条件：温度24±2℃、光照强度1500-2000lx、光照时间14h/d。
前述的快速繁殖方法，其特征在于，在步骤一中，种子在70％乙醇中浸泡的时间为4min，在0.1％HgCl2溶液中浸泡的时间为10min。
前述的快速繁殖方法，其特征在于，在步骤二中，外植体材料选用的是生长10d无菌苗的叶片。
本发明的有益之处在于：本发明通过采用组织培养的方法，在人工控制的条件下，实现了黑果枸杞种苗的快速繁殖，较以往的有性繁殖相比，本发明的繁殖方法不仅能避免植物在生长过程中出现性状分离，而且还具有繁殖速度快、成本低、成活率高、成苗速度快等优势，解决了有性繁殖中出现的种种问题，获得了大量试管苗，为该物种在荒漠地区大量推广普及种植提供了技术支持，同时也为其引种驯化、种质资源保护及西北地区盐碱地改良等提供了科学依据。
附图说明
图1是生长10d的无菌苗；
图2是第6组诱导培养基中叶片诱导的愈伤组织；
图3是第3组诱导培养基中叶片诱导的愈伤组织；
图4是第10组诱导培养基中叶片诱导的愈伤组织；
图5是第8组增殖培养基中的不定芽；
图6是第9组增殖培养基中的不定芽；
图7是第1组生根培养基中根的生长状况；
图8是第4组生根培养基中根的生长状况；
图9是第7组生根培养基中根的生长状况；
图10是第2组生根培养基中根的生长状况；
图11是第6组生根培养基中根的生长状况；
图12是第1组生根培养基中生根苗的生长状况；
图13是第4组生根培养基中生根苗的生长状况；
图14是第7组生根培养基中生根苗的生长状况；
图15是第2组生根培养基中生根苗的生长状况；
图16是第6组生根培养基中生根苗的生长状况。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一、无菌苗的培养
挑选籽粒饱满、大小一致的种子，将种子用自来水冲洗干净，然后置于超净工作台内。
先用70％乙醇浸泡4min，无菌水冲洗2-3次，再用0.1％HgCl2溶液浸泡10min，无菌水冲洗4-5次，最后用已灭菌的滤纸吸掉种子表面的水渍后接种于MS培养基(蔗糖30g/l、琼脂粉4.5g/l，PH为5.8)上。
培养条件：温度24±2℃、光照强度1500-2000lx、光照时间14h/d。
培养3d后，种子发芽，且发芽速度一致，发芽率为96％，生长10d的无菌苗见图1。
由图1我们可知：该步骤培养得到的无菌苗长势良好，为进一步实验做好了前期准备。
二、愈伤组织诱导
待种子发芽后，取生长10d无菌苗的叶片作为诱导愈伤组织的材料。与此同时，我们也取了生长10d无菌苗的茎段和下胚轴进行比较。
将黑果枸杞无菌苗的叶片切成0.3cm×0.3cm的小片，将茎段和下胚轴切成长约0.5-0.7cm的小段，然后接种在不同配方的诱导培养基中进行培养。
诱导培养基的配方如下：
每个培养皿接10个外植体材料，每种激素处理20个重复。
培养条件：温度24±2℃、光照强度1500-2000lx、光照时间14h/d。
培养7d后，各组诱导培养基中都形成了愈伤组织。其中，第6组诱导培养基中叶片诱导的愈伤组织见图2，第3组诱导培养基中叶片诱导的愈伤组织见图3，第10组诱导培养基中叶片诱导的愈伤组织见图4。
由图2、图3和图4我们可知：该步骤诱导得到的愈伤组织质地松软，色泽黄绿、鲜亮。
因此，我们将诱导愈伤组织的最佳培养基配方确定为：MS+0.3mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+1.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(第6组)。
在此种配方下，叶片、茎段及下胚轴诱导率分别为95.1％、60.5％、73.2％。因此，叶片是最优选的外植体材料。
三、丛生芽增殖培养
待愈伤组织生长15d后，将长势良好的愈伤组织转接至不同配方的增殖培养基中继续进行培养。
增殖培养基的配方如下：
每种培养基10个重复，每个培养瓶接3个愈伤组织。
培养条件：温度24±2℃、光照强度1500-2000lx、光照时间14h/d。
培养7d后，第6组增殖培养基中的不定芽见图12。
培养20d后，各组增殖培养基中都长出了不定芽。其中，第8组增殖培养基中的不定芽见图5，第9组增殖培养基中的不定芽见图6。
由图5和图6我们可知：该步骤培养得到的不定芽增值率最高，丛生芽数量多，且茎干健壮，颜色嫩绿，有利于进行生根培养。
因此，我们将最佳增殖培养基配方确定为：MS+3.0mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+0.3mg/L激动素+0.5mg/L萘乙酸(第8组)。
在此种配方下，丛生芽增殖率为90.2％，生长20d的苗高为4.5cm，且丛生芽数量多，茎干健壮，叶色绿，生长旺盛。
四、生根培养
剪切增殖培养带有叶尖的不定芽，将剪切下来的不定芽转接入不同配方的生根培养基中进行生根培养。
生根培养基的配方如下：
每种培养基10个重复，每个培养瓶接3个丛生芽。
培养3d后，各组生根培养基中都长出了根。其中，第1组生根培养基中根的生长状况见图7、生根苗的生长状况见图12，第4组生根培养基中根的生长状况见图8、生根苗的生长状况见图13，第7组生根培养基中根的生长状况见图9、生根苗的生长状况见图14，第2组生根培养基中根的生长状况见图10、生根苗的生长状况见图15，第6组生根培养基中根的生长状况见图11、生根苗的生长状况见图16。
由图7、图8、图9、图10和图11我们可知：该步骤培养得到的组培苗根系生根时间早，根系生长良好，毛根数量多，主根明显且健壮。
由图12、图13、图14、图15和图16我们可知：该步骤培养得到的生根苗生长速度快，茎干粗壮，侧芽数量多且植株颜色鲜绿。
因此，我们将最佳生根培养基配方确定为：1/2MS+0.5mg/L萘乙酸+0.5mg/L MgSO4(第6组)。
在此种配方下，丛生芽4d时开始生根，生根率可达98.2％。
阐明组培扩繁作用机理如下：不同的外植体诱导愈伤组织所需的激素种类及浓度不同，且同一外植体在不同的激素及浓度条件下愈伤组织诱导率也不同。三种供试外植体中，子叶的愈伤组织诱导率最高，其次为胚轴，茎段诱导率最低，说明黑果枸杞不同器官诱导率的大小可能与其形态特征有关，由于在长期适应干旱、盐碱自然环境的过程中，黑果枸杞的叶片木质化程度较低，而根部和茎部的木质化程度较高、分生能力弱，而生长调节物质需要通过维管系统运输，致使维管系统越丰富的地方，生长调节物质浓度越高，也就越容易形成愈伤组织，这可能是子叶愈伤诱导率显著高于其他外植体的主要原因；丛生芽增殖过程中激素是重要的影响因子，细胞分裂素和生长素的比例决定着芽和根的分化情况，当细胞分裂素浓度小于生长素时，有利于促进跟的分化，反之有利于芽的分化。试验发现细胞分裂素在黑果枸杞不定芽诱导过程中起决定作用，但在此基础上附加少量的生长素对芽的分化有促进作用；生根培养中对于根芽同时生长的大多数植物进行生根培养时，不需要6-BA,否则将会抑制生根或完全不生根，另外，MS培养基中大量元素减半，可以提高大多数植物的生根率，本试验在以1/2MS为基本培养基，附加0.5NAA,将MgSO4减半时，最有利于黑果枸杞幼苗生根培养，且幼苗在第4d时开始出现不定根，最早15d便可形成完整的根系，且根长势良好，主侧根发达，毛根较多。
由此可见，本发明通过采用组织培养的方法，在人工控制的条件，实现了黑果枸杞种苗的快速繁殖(从愈伤组织诱导到幼苗生根，整个培养过程仅需55d，大大提高了黑果枸杞成苗的速度)，较以往的有性繁殖相比，本发明的繁殖方法不仅能避免植物在生长过程中出现性状分离，而且还具有繁殖速度快、成本低、成活率高、成苗速度快等优势，解决了有性繁殖中出现的种种问题，获得了大量试管苗，对黑果枸杞的商业化生产带来很大帮助。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (3)
1.一种荒漠区药用植物黑果枸杞的快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
一、无菌苗的培养：
将种子洗净并置于超净工作台内，先用70％乙醇浸泡，无菌水冲洗，再用0.1％HgC12溶液浸泡，无菌水冲洗，最后用已灭菌的滤纸吸掉种子表面的水渍后接种于MS培养基上，在温度24±2℃、光照强度1500-2000lx、光照时间14h/d的环境下培养；
二、愈伤组织诱导：
待种子发芽后，取生长10d无菌苗的叶片并切成0.3cm×0.3cm的小片，或者取生长10d无菌苗的茎段或下胚轴并切成0.5-0.7cm的小段，然后接种在诱导培养基中进行培养，诱导培养基配方：MS+0.3mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+1.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，培养条件：温度24±2℃、光照强度1500-2000lx、光照时间14h/d；
三、丛生芽增殖培养：
待愈伤组织生长15d后，将愈伤组织转接至增殖培养基中继续进行培养，增殖培养基的配方：MS+3.0mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+0.3mg/L激动素+0.5mg/L萘乙酸，培养条件：温度24±2℃、光照强度1500-2000lx、光照时间14h/d；
四、生根培养：
剪切增殖培养带有叶尖的不定芽，将剪切下来的不定芽转接入生根培养基中进行生根培养，生根培养基的配方：1/2MS+0.5mg/L萘乙酸+0.5mg/L MgSO4，培养条件：温度24±2℃、光照强度1500-2000lx、光照时间14h/d。
2.根据权利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于，在步骤一中，种子在70％乙醇中浸泡的时间为4min，在0.1％HgC12溶液中浸泡的时间为10min。
3.根据权利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于，在步骤二中，外植体材料选用的是生长10d无菌苗的叶片。
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