CN106561448A - 利用组织培养诱导黑果枸杞四倍体的方法 - Google Patents

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裴毅
聂江力
杨雪君
毛金枫
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Abstract

本发明公开了一种利用组织培养诱导黑果枸杞四倍体的方法，步骤如下：⑴获得无菌苗，取叶片；⑵以黑果枸杞的叶片作为四倍体诱导的外植体，放于黑果枸杞四倍体愈伤诱导培养基上进行愈伤诱导，黑果枸杞四倍体愈伤诱导的培养基为0.125mg.L‑16‑BA+0.025mg.L‑12,4‑D+2％DMSO+0.01mg·L‑1秋水仙素。本发明通过将二甲基亚砜和秋水仙素结合，成功诱导出黑果枸杞的四倍体愈伤，为黑果枸杞四倍体植株的诱导奠定基础。

Description

利用组织培养诱导黑果枸杞四倍体的方法
技术领域
本发明属于组培技术领域，涉及一种利用组织培养诱导黑果枸杞四倍的方法。
背景技术
黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)是茄科(Solanaceae)枸杞属(Lycium L.)多年生落叶小灌木灌木。常以灌丛的形式分布于海拔400-3000m的盐碱荒地、沙地，是一种耐盐、耐旱的植物。我国的陕西北部、宁夏、甘肃、青海、新疆和西藏均有黑果枸杞自然分布，中亚的高加索和欧洲有少量分布。高20～150cm，多分枝，枝条坚硬，弯曲；叶2～6片簇生于短枝上，肉质，条形或条状披针形，长约5mm；花1～2朵生于棘刺基部两侧的短枝上；花梗细，花萼狭钟状；浆果球形，成熟后紫黑色，直径4～9mm；人们自古就将黑果枸杞视为药食两用的佳品加以利用，藏药经典《晶珠本草》称黑果枸杞为“旁玛”，并对黑果枸杞进行药用描述，文中对黑果枸杞描述道：用于黑果枸杞不仅对治疗心热病、心脏病、月经不调、停经等病症，药效显著，而且还有降压作用。
经过近年来对黑果枸杞的成分研究发现，黑果枸杞中含有蛋白质、多糖、黄酮、原花青素类等，多种对人体有益的成分，陈晓琴[5]研究发现黑果枸杞果实多糖有预防糖尿病的作用，且研究进一步表明：黑果枸杞果实多糖对糖尿病患者的多饮多食、体质量下降等症状也有一定的缓解作用。现代研究发现：黑果枸杞黄酮具有降血脂和抗氧化活性的作用。另还含有一定量的人体必需脂肪酸和8种人体必需的氨基酸。黑果枸杞的原花青素含量是枸杞、黑加仑的10倍左右，是一种优质的提取原花青素的植物资源，有很好的开发利用价值。
但目前可利用的黑果枸杞资源主要来源于野外，及少量的人工栽植，市场缺口较大，果实品质难以保证。多数情况下，多倍体一般都会比正常倍性植株表现出有较强的抗病性和抗逆性的特点，而且营养物质更加丰富，储运性更好等特点。目前未见有关黑果枸杞四倍体育种的相关报道。
发明内容
本发明提供一种利用组织培养诱导黑果枸杞四倍的方法，通过对黑果枸杞进行四倍体育种，不仅可以快速得到黑果枸杞种苗，满足市场需求，实现黑果枸杞产业化，同时能提高果产量，保证果实质量，具有重大意义。
本发明实现目的的技术方案如下：
一种利用组织培养诱导黑果枸杞四倍体的方法，步骤如下：
⑴获得无菌苗，取叶片；
⑵以黑果枸杞的叶片作为四倍体诱导的外植体，放于黑果枸杞四倍体愈伤诱导培养基上进行愈伤诱导，黑果枸杞四倍体愈伤诱导的培养基为0.125mg.L-16-BA+0.025mg.L- 12,4-D+2％DMSO+0.01mg·L-1秋水仙素。
而且，愈伤诱导培养条件为温度25℃，光周期14h/10h(昼/夜)，光照强度为1800lx—2000lx。
而且，将叶片接入培养基约5-10天，黑果枸杞愈伤开始出现，愈伤呈浅绿色或浅黄色，经30天左右的培养后对愈伤进行倍性鉴定及数据统计。
而且，所述步骤⑴获得无菌苗的步骤如下：
挑选大小一致颗粒饱满的黑果枸杞种子，选取1200粒种子，分别载入40个组培瓶中，以30粒为一组，在75％的酒精中消毒处理3分钟后，用无菌水清洗3遍，然后用浓度为5％的次氯酸钠处理10min，经过无菌水清洗3遍后，将种子在无菌滤纸吸干水后播种于MS培养基上，温度25℃，光周期14h/10h(昼/夜)，光照强度为1800lx—2000lx。
本申请的优点和积极效果如下：
本发明通过将二甲基亚砜和秋水仙素结合，成功诱导出黑果枸杞的四倍体愈伤，为黑果枸杞四倍体植株的诱导奠定基础。将诱变后的植株放于普通丛芽诱导培养基上后将会获得黑果枸杞四倍体植株。
本发明曾进行大量前期研究，均未获得黑果枸杞的四倍体，后来经过研究黑果枸杞属干旱、半干旱地区生长的具有较强抗旱和耐盐碱能力的植物，表皮外有一层致密的角质层，一般化学试剂难以透过其表皮，而达到植物组织内部，后来在处理液中尝试加入二甲基亚砜(DMSO)，并调节生长素和分裂素的比例，从而克服现有技术的不足之处。
附图说明
图1为黑果枸杞四倍体愈伤染色体(秋水仙浓度0.01)；
图2为黑果枸杞四倍体愈伤染色体(秋水仙浓度0.01)。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
一种利用组织培养诱导黑果枸杞四倍体的方法，步骤如下：
下述方法的试验材料为黑果枸杞无菌苗，通过对采购于青海西宁的黑果枸杞种子进行组织培养后得到，现保存于天津农学院园艺园林学院植物教研室。
⑴无菌苗的获得
挑选大小一致颗粒饱满的黑果枸杞种子，选取1200粒种子，分别载入40个组培瓶中，以30粒为一组，在75％的酒精中消毒处理3分钟后，用无菌水清洗3遍，然后用浓度为5％的次氯酸钠处理10min，经过无菌水清洗3遍后，将种子在无菌滤纸吸干水后播种于MS培养基上，温度25℃，光周期14h/10h(昼/夜)，光照强度为1800lx—2000lx。
经消毒处理后的黑果枸杞种子栽入培养基，约90天后，黑果枸杞叶片长到约1cm左右，可用作愈伤材料。通过播种直接获得的无菌苗发芽率为34.9％。
⑵不同浓度秋水仙素对黑果枸杞四倍体的诱导
将生长健壮的黑果枸杞无菌苗挑出，以黑果枸杞的叶片作为四倍体诱导的外植体，放于添加了不同浓度秋水仙素的愈伤诱导培养基上，愈伤诱导培养基为0.125mg.L-16-BA+0.025mg.L-12,4-D；在愈伤诱导培养基中加入2wt％的二甲基亚砜，秋水仙素的浓度分别为0.02mg·L-1、0.01mg·L-1、0.005mg·L-1、0.0025mg·L-1，培养条件为温度25℃，光周期14h/10h(昼/夜)，光照强度为1800lx—2000lx。
将叶片接入培养基约7天左右，黑果枸杞愈伤开始出现，愈伤呈浅绿色或浅黄色，经30天左右的培养后对愈伤进行倍性鉴定及数据统计。进行染色体观察并拍照(见图1、图2)。
表1不同浓度秋水仙素对黑果枸四倍体杞愈伤组织的诱导
由表1可知，在秋水仙素和二甲基亚砜的同时作用下，用黑果枸杞叶片可以诱导出愈。当秋水仙素浓度为0.0025mg·L-1时，黑果枸杞愈伤率最高为88％。随着秋水仙素浓度的增加，出愈率呈现出明显的下降趋势，当浓度为0.02mg·L-1时，出愈率最低为47％。可以看出，秋水仙素对黑果枸杞叶片愈伤有毒害作用。当秋水仙素为0.01mg·L-1时黑果枸杞的诱导率最高，为37％。当秋水仙素浓度为0.0025mg·L-1时诱导率最低，为5％，由此可见，秋水仙素过高或过低都难以产生黑果枸杞四倍体愈伤。
通过实验证明：黑果枸杞四倍体愈伤诱导的最佳培养基为0.125mg.L-16-BA+0.025mg.L-12,4-D+2％DMSO+0.01mg·L-1秋水仙素。
二甲基亚砜是一种含硫有机化合物，被誉为“万能溶解剂”，对细胞具有较强的穿透性。秋水仙素有剧毒，但在组织培养四倍体中能显著提升诱变率，是四倍体诱导中常常会用到的诱变剂，有不少研究通过利用秋水仙素诱导成功诱导出四倍体，但秋水仙素的毒性明显抑制不定芽分化，导致外植体死亡。
本发明通过将二甲基亚砜和秋水仙素结合，成功诱导出黑果枸杞的四倍体愈伤，为黑果枸杞四倍体植株的诱导奠定基础。将诱变后的植株放于普通丛芽诱导培养基上后将会获得黑果枸杞四倍体植株。
本发明涉及的具体数据的计算方法如下：
1、出愈率＝愈伤形成数/接种外植体总数×100％；
2、诱导率＝四倍体愈伤组织数/接种外植体总数×100％；
3、黑果枸杞四倍体愈伤的检测方法
挑出产生四倍体愈伤的愈伤块，对愈伤块进行染色体观察
前处理：将愈伤块放于饱和对二氯苯溶液中，温度在25℃左右，浸泡3h-4h；
固定：用冰乙酸：甲醇＝1:3进行固定，固定时间约2h-3h；
酸解：用1mol/L的盐酸在45℃烘箱中酸解约45min，将酸解后的愈伤块用蒸馏水清洗3遍。
染色：将愈伤块放于装有卡宝-品红染色液的小试管中染色，时间大约30min；
压片：将染色的愈伤块轻轻取出，放于载玻片上，截取愈伤部分，用卡宝品红直接压片。
总黄酮的检测
黑果枸杞四倍体愈伤中总黄酮含量明显高于未加倍的黑果枸杞愈伤，根据检测，二倍体的黑果枸杞中总黄酮含量为2.730％，而本发明的中四倍体总黄酮含量为3.115％。

Claims (4)

1.一种利用组织培养诱导黑果枸杞四倍体的方法，其特征在于：步骤如下：
⑴获得无菌苗，取叶片；
⑵以黑果枸杞的叶片作为四倍体诱导的外植体，放于黑果枸杞四倍体愈伤诱导培养基上进行愈伤诱导，黑果枸杞四倍体愈伤诱导的培养基为0.125mg.L-16-BA+0.025mg.L-12,4-D+2％DMSO+0.01mg·L-1秋水仙素。
2.根据权利要求1所述的利用组织培养诱导黑果枸杞四倍体的方法，其特征在于：愈伤诱导培养条件为温度25℃，光周期14h/10h(昼/夜)，光照强度为1800lx-2000lx。
3.根据权利要求1所述的利用组织培养诱导黑果枸杞四倍体的方法，其特征在于：将叶片接入培养基约5-10天，黑果枸杞愈伤开始出现，愈伤呈浅绿色或浅黄色，经30天左右的培养后对愈伤进行倍性鉴定及数据统计。
4.根据权利要求1所述的利用组织培养诱导黑果枸杞四倍体的方法，其特征在于：所述步骤⑴获得无菌苗的步骤如下：
挑选大小一致颗粒饱满的黑果枸杞种子，选取1200粒种子，分别载入40个组培瓶中，以30粒为一组，在75％的酒精中消毒处理3分钟后，用无菌水清洗3遍，然后用浓度为5％的次氯酸钠处理10min，经过无菌水清洗3遍后，将种子在无菌滤纸吸干水后播种于MS培养基上，温度25℃，光周期14h/10h(昼/夜)，光照强度为1800lx—2000lx。
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