CN110199875B - 一种喜树子叶愈伤组织的诱导方法及其培养基 - Google Patents
一种喜树子叶愈伤组织的诱导方法及其培养基 Download PDFInfo
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Abstract
本发明一种喜树子叶愈伤组织的诱导方法及其培养基，培养基组成为基础培养基WPM+0.1‑2mg TDZ+0‑2mg/L NAA+0‑1mg/L 6‑BA+0‑1mg/LZT。喜树子叶愈伤组织的诱导方法，采用以下步骤：1)植物材料的获得；2)外植体的消毒方法；3)愈伤组织诱导：以喜树无菌15‑20d幼苗的子叶作为外植体，以权利要求1‑4的诱导培养基进行愈伤组织诱导。本发明以喜树种子萌发20‑30天的无菌子叶为外植体，以WPM培养基为基本培养基，将不同浓度的TDZ添加到培养基中，获得喜树愈伤组织诱导最佳配方，该研究结果将为喜树的高效培育提供重要技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种喜树子叶愈伤组织的诱导方法及其培养基。
背景技术
喜树(Camptotheca acuminata)是一种多年生的珙桐科(Nyssaceae)落叶乔木，被列为首批受国家保护的野生植物之一，其根皮，果实和叶子可以用作药物，民间将叶子用于治疗伤口和一些皮肤炎症。其次生代谢产物喜树碱(Camptothecin,CPT)是一种天然且重要的抗癌药物，可用于临床治疗早期白血病和一些较为严重的癌症，如肝癌和胃癌等。因此许多科学家对喜树和喜树碱展开了一系列的研究。
因其极大的药用价值，喜树目前已在多个国家和地区进行引种和栽培。在喜树的正常生长发育过程中，喜树碱主要集中在种子和子叶中，其产生量难以满足日益增长的药用需求，因此利用组培技术建立愈伤体系从而产生大量的次生代谢物质喜树碱已成为研究热点。然而在植物组织中喜树碱的含量相对较低。建立高效的喜树组织培养快速繁殖系统能够有效地解决喜树碱的自然资源短缺问题。然而现有的培养系统存在一些问题，例如愈伤组织的分化率较低等。因此，我们对现有的喜树培育系统的存在的一些问题进行了一系列研究。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明设计的要点在于提供一种喜树子叶愈伤组织的诱导方法及其培养基。
本发明通过以下技术方案加以实现：
所述的一种喜树子叶愈伤组织的诱导培养基，其特征在于含有0.1-2mg/L TDZ。
所述的一种喜树子叶愈伤组织的诱导培养基，其特征在于，组成为：基础培养基WPM+0.1-2mg TDZ+0-2mg/L NAA+0-1mg/L 6-BA+0-1mg/L ZT。
所述的一种喜树子叶愈伤组织的诱导培养基，其特征在于，组成为：基础培养基WPM+0.5-1mg/L TDZ+0-2mg/L NAA+0-1mg/L 6-BA+0-1mg/L ZT。
所述的一种喜树子叶愈伤组织的诱导培养基，其特征在于，组成为：基础培养基WPM+1TDZ+2/L NAA+0.1mg/L 6-BA。
所述的一种喜树子叶愈伤组织的诱导方法，其特征在于采用以下步骤：
1)植物材料的获得：选择生长状况良好的植株作为采种母株，采来的种子除去树叶、石块杂物后置于阴凉通风处储存备用，播种前用清水漂洗干净种子，然后用30-35℃温水浸泡48h,使种子充分吸水膨胀后即可点播于事先处理好的培养土中，在一定的条件下进行培养；
2)外植体的消毒方法：采集步骤1)中生长15-20d的喜树子叶在流水中冲洗2h，在超净工作台上，用75％酒精消毒30s后置于0.1％升汞溶液中消毒7min，并用无菌水冲洗4-5次；
3)愈伤组织诱导：以喜树无菌15-20d幼苗的子叶作为外植体，以以权利要求1-4的诱导培养基进行愈伤组织诱导。
所述的一种喜树子叶愈伤组织的诱导方法，其特征在于步骤1)中事先处理好的培养土包括土壤消毒和培养土配制，所述土壤消毒是指播种前先用0.5％的高锰酸钾溶液均匀喷布土壤表面，每平方米用药液0.5kg，使药液充分渗入土壤，培养土的配制是指，土壤消毒后置于通风处放置2-3d即可用于配制培养土。按照消毒后的土壤与珍珠岩1:1的比例配制培养土，混合均匀后备用。
所述的一种喜树子叶愈伤组织的诱导方法，其特征在于步骤1)中在一定的条件下进行培养是指，整平培养土，使表土粒细松散，种子点播后立即用喷雾器喷水，保存土壤湿度,并插上标签挂牌，置于温度为25±2℃、光照强度为2 000-2500lx、相对湿度为40％-60％的人工气候室中进行培养，光照与黑暗时间各12h，并定期浇水保持土壤湿润。
本发明建立一种喜树子叶愈伤组织的诱导方法及其培养基，该培养基及诱导方法的确定能有效抑制愈伤组织发红的现象，提高愈伤组织的诱导率，可达97.22％，该研究将为喜树的高效培育提供重要的技术支撑。
附图说明
图1为不同激素配方诱导的接种10天后的喜树愈伤组织；
图2为不同激素配方诱导的接种10天后的喜树愈伤组织；
图3为不同浓度激素配比对喜树愈伤组织出愈率的影响；
图4为不同激素浓度配方诱导的喜树愈伤组织。
具体实施方式
以下结合说明书附图对本发明做进一步详细说明，并给出具体实施方式。
实施例1
1.植物材料的获得
1.1土壤消毒：播种前先用0.5％的高锰酸钾溶液均匀喷布土壤表面，每平方米用药液0.5kg，使药液充分渗入土壤，有效杀灭土壤中存在的杂菌，从而有效防治病害。
1.2培养土的培植：土壤消毒后置于通风处放置2-3d即可用于配制培养土。按照处理后的土壤与珍珠岩1:1的比例配制培养土，混合均匀后备用。
1.3播种与幼苗管理：喜树种子采集于浙江省杭州市临安区新溪村。选择生长状况良好的植株作为采种母株，于2018年11月中下旬进行采种，除去树叶、石块等杂物后置于阴凉通风处贮存。播种前先用清水漂洗干净种子，然后用30-35℃温水浸泡48h,使种子充分吸水膨胀后即可播种。整平土壤，使表土粒细松散。用处理好的种子进行点播，播后立即用喷雾器喷水，保存土壤湿度,并插上标签挂牌，置于温度为(25±2)℃、光照强度为2 000-2500lx、相对湿度为40％-60％的人工气候室中进行培养，光照与黑暗时间各12h，并定期浇水保持土壤湿润。
2.外植体的消毒方法：将生长15-20d的喜树子叶在流水中冲洗2h。在超净工作台上，用75％酒精消毒30s后置于0.1％升汞溶液中消毒7min，并用无菌水冲洗4-5次。
3.喜树促愈伤培养基的筛选：以喜树无菌15-20d幼苗的子叶作为外植体，以WPM为基本培养基，以TDZ、NAA、6-BA、ZT四种激素设计正交试验，设计不同激素浓度组合培养喜树外植体(见表1)，研究培养基对愈伤组织诱导的影响，30d后统计愈伤组织的诱导情况，并记录诱导率，褐化率，污染情况等。每个配方三个重复，每个重复接种4瓶。(特别注意观察愈伤组织的颜色，偏红，黄，绿，黄绿色的为好，红色的不好)。
表1不同激素配比对喜树愈伤组织诱导的影响
数据分析：数据运用Excel进行处理。运用SPSS 20对所得数据进行差异分析。运用LSD Duncan显著性差异检测对数据进行处理。
实施例2：不同浓度激素配比对喜树愈伤组织出愈时间的影响。
由表2可知，在只添加0.1mg/L TDZ的培养基上，出愈时间较长，随着NAA、6-BA、TDZ和ZT四种激素浓度的增加与浓度组合的变化，出愈时间逐渐减少(A2-A12)，但随着浓度的进一步增加，出愈时间逐渐增加(A13-A16)，只有四种激素浓度组合适宜，才能够最大程度的缩短出愈时间。诱导喜树子叶愈伤组织出愈时间最短配方为A12，此时出愈时间为5-18d；其次为A11与A10，出愈时间均为6-18d；A7、A8与A9的出愈时间为7-20d；A6、A13、A14与A15的出愈时间为8-20d；A5与A16的出愈时间为9-20d；A4的出愈时间为9-25d；A3的出愈时间为10-25d；A2的出愈时间为10-30d；A1的出愈时间最长，为15-30d。
表2不同浓度激素配比对喜树愈伤组织出愈时间的影响
由表3及图1可知，喜树子叶接种10天后，部分叶片已开始长出愈伤。此时出愈率最高的配方为A12，为52.78％，已诱导出多个愈伤组织且长势最好(图1-L)；其次为A11，出愈率为48.48％，愈伤组织翠绿，长势较好(图1-K)；再次为A10其出愈率为39.39％，愈伤组织长势较好(图1-J)；A9，此时其出愈率次于A10，为27.27％，愈伤组织长势一般，叶片均已明显突起(图1-I)；A13此时出愈率次于A9，为26.67％，愈伤组织长势一般，大部分叶片已明显突起(图1-M)；A8此时出愈率次于A13，为24.24％，愈伤组织长势一般，大部分叶片已明显突起(图1-H)；A14与A7此时出愈率次于A8，均为23.33％，愈伤组织长势一般，叶片大都明显突起(图1-G、图1-N)；A6此时出愈率次于A14与A7，为20.00％，愈伤组织长势一般，部分叶片明显突起(图1-F)；A15此时出愈率次于A6，为16.67％，愈伤组织长势一般，部分叶片枯死，部分叶片明显突起(图1-O)；A5，此时出愈率次于A15，为15.15％，愈伤组织长势一般，部分叶片突起(图1-E)；A4，此时出愈率次于A5，为13.33％，愈伤组织长势一般，部分叶片突起(图1-D)；A16，此时出愈率次于A4，为12.12％，愈伤组织长势一般，部分叶片突起(图1-P)；A3此时出愈率次于A16，为11.11％，愈伤组织长势一般，部分叶片突起(图1-C)；A2此时出愈率次于A3，为6.06％，愈伤组织长势一般，部分叶片突起(图1-B)；只添加了0.1mg/L TDZ的培养基上，即A1，没有诱导出愈伤(图1-A)，此时出愈率为0.00％。
表3接种10天后喜树愈伤组织的出愈状况
图1中，A.A1诱导的接种10天后的喜树愈伤组织；B.A2诱导的接种10天后的喜树愈伤组织；C.A3诱导的接种10天后的喜树愈伤组织；D.A4诱导的接种10天后的喜树愈伤组织；E.A5诱导的接种10天后的喜树愈伤组织；F.A6诱导的接种10天后的喜树愈伤组织；G.A7诱导的接种10天后的喜树愈伤组织；H.A8诱导的接种10天后的喜树愈伤组织；I.A9诱导的接种10天后的喜树愈伤组织；J.A10诱导的接种10天后的喜树愈伤组织；K.A11诱导的接种10天后的喜树愈伤组织；L.A12诱导的接种10天后的喜树愈伤组织；M.A13诱导的接种10天后的喜树愈伤组织；N.A14诱导的接种10天后的喜树愈伤组织；O.A15诱导的接种10天后的喜树愈伤组织；P.A16诱导的接种10天后的喜树愈伤组织。
由表4及图2可知，愈伤组织接种20天后，喜树愈伤组织均未出现较为明显的发红现象，且大都生长状况较好，此时愈伤组织诱导率最高的配方为A12，为97.22％，愈伤组织长势最好(图2-L)；其次为A11，此时出愈率为87.88％，此时出愈率略低于A12，愈伤组织长势较好(图2-K)；A10，此时出愈率仅次于A11，为84.85％，愈伤组织长势较好(图2-J)；A13，此时出愈率次于A10，为80.00％，愈伤组织长势一般(图2-M)；A9，此时出愈率次于A13，为79.79％，愈伤组织长势一般(图2-I)；A8，此时出愈率次于A9，为69.70％，愈伤组织长势一般(图2-H)；A7，此时出愈率次于A8，为60.00％，愈伤组织长势一般(图2-G)；A6，此时出愈率次于A7，为43.33％，愈伤组织长势一般(图2-F)；A14，此时出愈率与A6相同，为43.33％，愈伤组织长势一般，有轻微发红现象(图2-N)；A15，此时出愈率次于A6与A14，为40.00％，愈伤组织长势一般，有部分叶片枯死(图2-O)；A5，此时出愈率次于A15，为36.36％，愈伤组织长势一般(图2-E)；A16，此时出愈率次于A5，为30.30％，愈伤组织长势一般(图2-P)；A4，此时出愈率次于A16与A14，为30.00％，愈伤组织长势一般(图2-D)；A3，此时出愈率次于A4，为25.00％，愈伤组织长势一般(图2-C)；A2，此时出愈率次于A3，为15.15％，愈伤组织长势较差，部分愈伤组织枯死(图2-B)；此时出愈率最低是A1，为6.06％，愈伤组织生长状况最差(图2-A)。
表4接种20天后喜树愈伤组织的出愈状况
图2中，A.A1诱导的接种20天后的喜树愈伤组织；B.A2诱导的接种20天后的喜树愈伤组织；C.A3诱导的接种20天后的喜树愈伤组织；D.A4诱导的接种20天后的喜树愈伤组织；E.A5诱导的接种20天后的喜树愈伤组织；F.A6诱导的接种20天后的喜树愈伤组织；G.A7诱导的接种20天后的喜树愈伤组织；H.A8诱导的接种20天后的喜树愈伤组织；I.A9诱导的接种20天后的喜树愈伤组织；J.A20诱导的接种20天后的喜树愈伤组织；K.A11诱导的接种20天后的喜树愈伤组织；L.A12诱导的接种20天后的喜树愈伤组织；M.A13诱导的接种20天后的喜树愈伤组织；N.A14诱导的接种20天后的喜树愈伤组织；O.A15诱导的接种20天后的喜树愈伤组织；P.A16诱导的接种20天后的喜树愈伤组织。
实施例3：不同浓度激素配比对喜树愈伤组织出愈率的影响
由图3可知，在不添加6-BA与NAA的培养基上，出愈率较低,随着培养时间的增加，外植体逐渐枯死(A1)。随着NAA与6-BA浓度的增加，出愈率逐渐升高(A2-A12)。但只有四种激素浓度组合适宜，才能有效诱导愈伤组织达到较高的出愈率，且愈伤组织质量较高。由图1可看出，愈伤组织诱导的最佳配方为A12，即WPM+TDZ 1mg/L+NAA 2mg/L+6-BA 0.1mg/L，此时愈伤组织诱导率较高，可达到97.22％；其次为A11，即WPM+TDZ 1mg/L+NAA 1mg/L+ZT0.1mg/L，出愈率为87.88％，其出愈率略低于A12；A10，即WPM+TDZ 1mg/L+NAA 0.5mg/L+6-BA 1mg/L+ZT 0.1mg/L，其出愈率仅次于A11，为84.85％；A13，即WPM+TDZ 2mg/L+6-BA 1mg/L+ZT 0.1mg/L，其出愈率次于A10，为80.00％；A9，即WPM+TDZ 1mg/L+6-BA 0.5mg/L+ZT1mg/L，其出愈率次于A13，为79.79％；A8，即WPM+TDZ 0.5mg/L+NAA 2mg/L+6-BA 0.5mg/L+ZT 0.1mg/L，其出愈率次于A9，为69.70％；A7，即WPM+TDZ 0.5mg/L+NAA 1mg/L+6-BA 1mg/L，其出愈率次于A8，为60.00％；A6，即WPM+TDZ 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+ZT 1mg/L，其出愈率次于A7，为43.33％；A14，即WPM+TDZ 2mg/L+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L，其出愈率与A6相同，为43.33％；A15，即WPM+TDZ 2mg/L+NAA 1mg/L+6-BA 0.1mg/L+ZT 1mg/L，其出愈率次于A6与A14，为40.00％；A5，即WPM+TDZ 0.5mg/L+6-BA 0.1mg/L+ZT 0.5mg/L，其出愈率次于A15，为36.36％；A16，即WPM+TDZ 2mg/L+NAA 2mg/L+ZT 0.5mg/L，其出愈率次于A5，为30.30％；A4，即WPM+TDZ 0.1mg/L+NAA 2mg/L+6-BA 1mg/L+ZT 1mg/L，其出愈率次于A16与A14，为30.00％；A3，即WPM+TDZ 0.1mg/L+NAA 1mg/L+6-BA 0.5mg/L+ZT 0.5mg/L，其出愈率次于A4，为25.00％；A2，即WPM+TDZ 0.1mg/L+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.1mg/L+ZT 0.1mg/L，其出愈率次于A3，为15.15％；出愈率最低是A1，即WPM+TDZ 0.1mg/L，为6.06％。
实施例4：不同浓度激素配比对喜树愈伤组织外观及生长势的影响
由表5可知，在各项激素含量均较低的培养基上，喜树愈伤组织多呈浅黄绿色，且质地松散，生长势较差。随着各项激素浓度的增加，愈伤组织质地逐渐变得紧密且生长势逐渐提高。但激素浓度过高会抑制喜树愈伤组织的生长，且质地由较为致密的状态逐渐变得稀疏。由图4-A至图4-P可知，随着TDZ浓度的增加，愈伤组织局部发红的现象逐渐缓解，且愈伤组织呈现为绿色。但若TDZ浓度过高(如图4-M)，愈伤组织则表现出较为严重的发红现象。A12号配方诱导的喜树愈伤组织生长状态最好，其色泽鲜绿，质地紧密(图4-L)。
表5不同浓度激素配比对喜树愈伤组织外观及生长势的影响
注：生长势+++生长迅速；++生长较快；+一般；-差
其中，图4，,A.A1诱导的喜树愈伤组织；B.A2诱导的喜树愈伤组织；C.A3诱导的喜树愈伤组织；D.A4诱导的喜树愈伤组织；E.A5诱导的喜树愈伤组织；F.A6诱导的喜树愈伤组织；G.A7诱导的喜树愈伤组织；H.A8诱导的喜树愈伤组织；I.A9诱导的喜树愈伤组织；J.A10诱导的喜树愈伤组织；K.A11诱导的喜树愈伤组织；L.A12诱导的喜树愈伤组织；M.A13诱导的喜树愈伤组织；N.A14诱导的喜树愈伤组织；O.A15诱导的喜树愈伤组织；P.A16诱导的喜树愈伤组织。
实施例5:不同浓度的TDZ对喜树愈伤组织诱导的作用
由表6可知，随着TDZ浓度的增加，愈伤组织逐渐变绿，且出愈率逐渐升高，但TDZ浓度过高则会对愈伤组织的诱导起到抑制作用。此外，随着TDZ浓度的增加，能够有效抑制愈伤组织发红的现象，但TDZ浓度过高愈伤组织亦会发红。TDZ浓度为1mg/L时对愈伤组织的诱导效果最好，出愈率超过80％。
表6不同浓度的TDZ对喜树愈伤组织诱导的作用
不同激素的配比对喜树愈伤组织的诱导有较大影响。愈伤组织形态以绿色致密为最好，此形态的愈伤组织生长速度最快且最有利于后续不定芽的分化。愈伤组织局部呈现红色则说明后续分化能力较低。白色疏松的愈伤组织质量较差，生长速度缓慢，后续无法诱导芽苗分化，质量最差的愈伤组织为高含水量疏松的愈伤组织。
在喜树子叶愈伤组织的诱导培养中，经常使用的生长素类物质有，2-4D、NAA以及细胞分裂素类物质6-BA等。本次研究初步探索了TDZ与其他激素的组合对喜树子叶培养过程中愈伤组织的诱导的影响。结果发现，在喜树子叶的愈伤组织诱导阶段加入TDZ后，愈伤组织诱导受到促进，愈伤组织颜色变绿、质地变硬、愈伤增殖速度较快。1mg/L的TDZ能够较好的喜树愈伤组织的生长，但2mg/L的TDZ则会抑制愈伤组织的生长，这表明过高浓度的TDZ不利于喜树愈伤组织的生长。在多种植物培养体系中添加TDZ都表现出能促进诱导愈伤组织形成，而且大大高于其他植物生长调节物质的细胞增殖速率。
综上所述，在喜树愈伤组织诱导的过程中加入一定浓度的TDZ能够提高其出愈率，且诱导出的愈伤质量高，但TDZ的浓度过高则会使出愈率相对降低。
Claims (3)
1.一种喜树子叶愈伤组织的诱导培养基，其特征在于，组成为：基础培养基WPM+1mg/LTDZ+2 mg /L NAA +0.1mg/L 6-BA 。
2.一种喜树子叶愈伤组织的诱导方法，其特征在于采用以下步骤：
1）植物材料的获得：选择生长状况良好的植株作为采种母株，采来的种子除去树叶、石块杂物后置于阴凉通风处储存备用，播种前用清水漂洗干净种子，然后用30-35℃温水浸泡48h，使种子充分吸水膨胀后即可点播于事先处理好的培养土中培养，具体为整平培养土，使表土粒细松散，种子点播后立即用喷雾器喷水，保存土壤湿度，并插上标签挂牌，置于温度为25±2℃、光照强度为2000-2500lx、相对湿度为40%-60%的人工气候室中进行培养，光照与黑暗时间各12h，并定期浇水保持土壤湿润；
2）外植体的消毒方法：采集步骤1）中生长15-20d的喜树子叶在流水中冲洗2h，在超净工作台上，用75%酒精消毒30s后置于0.1%升汞溶液中消毒7min，并用无菌水冲洗4-5次；
3）愈伤组织诱导：以喜树无菌15-20d幼苗的子叶作为外植体，以权利要求1中所述的的诱导培养基进行愈伤组织诱导。
3.如权利要求2所述的一种喜树子叶愈伤组织的诱导方法，其特征在于步骤1）中事先处理好的培养土包括土壤消毒和培养土配制，所述土壤消毒是指播种前先用0.5%的高锰酸钾溶液均匀喷布土壤表面，每平方米用药液0.5kg，使药液充分渗入土壤，培养土配制是指，土壤消毒后置于通风处放置2-3d即可用于配制培养土，按照消毒后的土壤与珍珠岩1:1的比例配制培养土，混合均匀后备用。
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| JPS6296088A (ja) * | 1985-10-22 | 1987-05-02 | Kanebo Ltd | 抗腫瘍性物質の製法 |
| CN1644682A (zh) * | 2004-12-13 | 2005-07-27 | 东北林业大学 | 一种高效诱导喜树离体叶片不定芽再生的培养基 |
| CN103493735A (zh) * | 2013-09-30 | 2014-01-08 | 浙江农林大学 | 一种喜树愈伤组织培养和增殖的光调控方法 |
-
2019
- 2019-05-28 CN CN201910453748.XA patent/CN110199875B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6296088A (ja) * | 1985-10-22 | 1987-05-02 | Kanebo Ltd | 抗腫瘍性物質の製法 |
| CN1644682A (zh) * | 2004-12-13 | 2005-07-27 | 东北林业大学 | 一种高效诱导喜树离体叶片不定芽再生的培养基 |
| CN103493735A (zh) * | 2013-09-30 | 2014-01-08 | 浙江农林大学 | 一种喜树愈伤组织培养和增殖的光调控方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| TDZ对喜树愈伤组织生长及色素积累的影响;康大力等;《生物技术》;20120215;第22卷(第1期);第83页摘要 * |
| The effect of growth regulators and sucrose on anthocyanin production in Camptotheca acuminata cell cultures;Gabriella Pasqua等;《Plant Physiology and Biochemistry》;20050331;第43卷(第3期);全文 * |
| 喜树高效再生体系的建立与农杆菌介导的遗传转化研究;杨国峥;《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）》;20071115(第05期);第21页第1.1节、第1.2.1.2节、第1.2.1.3节，第24页第2.1.3节，第25页表3 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110199875A (zh) | 2019-09-06 |
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