CN104938336B - 一种促进土沉香离体芽生芽的快速增殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促进土沉香离体芽生芽的快速增殖方法。本发明选取健壮的土沉香母树的种子作为外植体；在无菌条件下，对种子进行处理，接种在初代培养基上诱导无菌苗；进而将获得的无菌苗剪切为不小于两个节的茎段，接种于促芽生芽培养基上进行继代培养；其中促芽生芽培养基是在改良MS培养基的基础上添加BA和GA3制备得到。本发明首次加入赤霉素GA3配合BA对土沉香进行继代增殖培养，解决了由于玻璃化、愈伤组织化、黄化而导致的增殖率极低、不能持续继代增殖的问题；利用本发明的培养基可以促进土沉香苗反复继代至少5次，从而获得数量可观的无菌土沉香苗；为进一步生根和移栽打下良好的基础。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养领域，具体涉及一种促进土沉香离体芽生芽快速增殖的方法。
背景技术
土沉香(Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg)，又称白木香，是瑞香科(Thymelaeaceae)沉香属(Aquilaria Lam)多年生热带和亚热带常绿乔木。主要分布于我国广东、广西、福建、海南、台湾等地。土沉香是我国特有而珍贵的药用植物和香料植物，还是很好的园林绿化树种。不过目前，由于沉香树生存环境的破坏、虫害及人为掠夺式砍伐等原因，使野生土沉香资源遭到严重的破坏，现仅有零星散生的残存植株。1987年沉香树被列为国家珍稀濒危三级保护植物，1999年被国务院批准为国家二级重点保护野生植物。目前野生土沉香结实率低，不易获得大量优质种子且种子易丧失活力，通过常规的种子繁殖不能满足生产的实际需求，所以离体培养快速繁殖可有效解决这一问题。
目前采用芽生芽途径进行快速繁殖存在的主要问题是：外植体的诱导(以茎段或种子为外植体)较为容易，但继代十分困难，常常出现严重的黄化、玻璃化和愈伤组织化，不能实现有效的增殖。
已有的研究表明(徐强兴,吴妃华,周立赖.土沉香的组培快繁技术研究[J].广东农业科学,2006,(8):44-46.)：离体培养条件下，土沉香芽生芽途径的继代增殖中对激素浓度十分敏感。在仅采用BA和NAA配比的情况下，BA和NAA的适用浓度分别为0.1～0.2mg/L和0～0.01mg/L，增殖率低，且出现普遍的愈伤组织化、玻璃化；或可以继代1～2次(林超.白木香组织培养及多倍体诱导研究[D].广州中医药大学,2013.)，但黄化现象严重，无法实现持续的增殖。
这也是现在市场上供应的苗木多由种子繁殖和扦插繁殖而来的原因。突破土沉香的离体继代技术，可在短期内为市场提供大量优质的苗木，并为离体条件下多倍体诱导、辐射育种等在内的各项育种工作提供技术基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进土沉香离体芽生芽的培养基；
本发明的另一目的在于提供一种促进土沉香离体芽生芽的快速增殖方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种促进土沉香离体芽生芽的培养基，由以下三部分组成：
1)初代培养基：在改良MS培养基的基础上添加25～35g/L蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂；
2)促芽生芽培养基1：在改良MS培养基的基础上添加0.4～0.6mg/L的BA、0.8～1.2mg/L的GA3、25～35g/L蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂；
3)促芽生芽培养基2：在改良MS培养基的基础上添加0.5～1.0mg/L的BA、1.0～2.0mg/L的GA3、25～35g/L蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂；
其中改良MS培养基为大量元素减半的MS培养基。
进一步的，促芽生芽培养基1为在改良MS培养基的基础上添加0.5mg/L的BA、1.0mg/L的GA3、30g/L蔗糖以及7g/L琼脂。
进一步的，促芽生芽培养基2为在改良MS培养基的基础上添加1.0mg/L的BA、2.0mg/L的GA3、30g/L蔗糖以及7g/L琼脂。
一种促进土沉香离体芽生芽的快速增殖方法，包括以下步骤：
1)选取健壮的土沉香母树，采摘成熟果实并选取饱满、粒大、无损伤的种子作为外植体；
2)在无菌条件下，对尚未裂开的果实进行表面消毒后，剥开果实、取出种子，去除种皮，置于容器内，通过消毒综合处理后，接种在初代培养基上诱导无菌苗；
3)将步骤2)中获得的无菌苗剪切为带不小于两个节的茎段，接种于促芽生芽培养基1上进行初次继代培养；
4)将步骤3)中获得的无菌苗剪切为带不小于两个节的茎段，接种于促芽生芽培养基2上，可反复继代数次；
其中初代培养基、促芽生芽培养基1和促芽生芽培养基2如上所述。
作为上述快速增殖方法的进一步改进，步骤2)消毒综合处理过程包括加入70～75％v/v的酒精浸泡25～40s，无菌水清洗干净，再用质量百分比浓度为0.08～0.12％的升汞溶液浸泡8～10min，无菌水清洗6～8次，无菌滤纸吸干表面水分。
作为上述快速增殖方法的进一步改进，步骤2)～4)中的培养条件均为：24～26℃、光照10～14h/d、光照强度2500～3500lx。
本发明的有益效果是：
1.本发明首次加入赤霉素GA3配合BA进行继代增殖，解决了由于玻璃化、愈伤组织化、黄化而导致的增殖率极低、不能持续继代增殖的问题；利用本发明的培养基可以促进土沉香苗反复继代至少5次，从而获得数量可观的无菌土沉香苗；为进一步生根和移栽打下良好的基础。
2.促芽生芽培养基1中的BA和GA3的浓度低于促芽生芽培养基2，有助于茎段的适应性生长。反复继代时，当促芽生芽培养基2中含有1.0mg/L的BA、2.0mg/L的GA3时，对于茎段诱导芽生芽的效果最好，培养60天后，无菌苗从2个节的茎段长成带8～10个节的植株，增殖倍数为4～5倍，植株高度约为8～10cm，增殖苗叶色深绿、生长健壮、叶柄处带有芽点，符合生根和成苗要求。
3.本发明的种子来源于成熟但未开裂的果实，污染少，无菌处理十分容易，污染率接近为零。
4.本发明种子来源于新鲜种子，种子活力高，将种胚接种在初代培养基上诱导种子发芽，萌发率几乎为100％；经过初次继代培养以及反复继代培养，每次继代可获得高达4～5倍增殖倍数的健壮无菌苗，符合进一步的继代繁殖或生根移栽的需要。
附图说明
图1为土沉香离体萌发的效果图；
图2为离体继代5次后土沉香的效果图；
图3为包含8～10个茎段的土沉香效果图。
具体实施方式
英文缩略词如下：BA是6-苄基氨基嘌呤、IBA为吲哚丁酸，GA3为赤霉素。
培养基的配制：
本发明中的改良MS培养基为大量元素含量减半的MS培养基。
改良MS培养基的组成成分如表1所示：
配制1L改良MS培养基：准确称取表1中所述的各种化合物，加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，用NaOH调pH至6.0，最后定容到1L。
初代培养基的配制：在改良MS培养基的基础上添加25～35g/L蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂。
促芽生芽培养基1：在改良MS培养基的基础上添加0.4～0.6mg/L的BA、0.8～1.2mg/L的GA3、25～35g/L蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂；
促芽生芽培养基2：在改良MS培养基的基础上添加0.5～1.0mg/L的BA、1.0～2.0mg/L的GA3、25～35g/L蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂；
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。如无特殊说明，以下实施例中无菌苗的诱导以及继代培养条件均为24～26℃、光照12h/d、光照强度2500～3500lx。
实施例1
2014年7月从广东省深圳市羊台山公园采集外植体30个，经芽生芽途径离体培养快速增殖，至2015年6月一共继代5次。具体步骤如下：
(1)果实的采摘和种子的准备：2014年7月10日，在广东省深圳市羊台山公园选取健壮的土沉香母树，采摘成熟但未开裂的果实，当天拿回实验室，保存在4℃冰箱。一般来说，土沉香种子不易保存，易丧失活力，所以一般控制在一周以内完成采集后的处理工作。当然采集后尽快处理为佳。
(2)外植体无菌处理及无菌苗的诱导：2014年7月11日，在超净工作台上，用75％酒精擦拭果实进行表面消毒，再剥开果实，取出种子。接下来选取成熟、饱满、无损伤的种子，用镊子和刀片剥去种皮。将种胚置于三角瓶内，加入75％的酒精浸泡30s，无菌水清洗1次，再用质量百分比浓度为0.1％的升汞溶液浸泡8分钟，无菌水清洗6～8次，吸干水分后接种在初代培养基(在改良MS培养基的基础上添加30g/L蔗糖以及7g/L琼脂)上诱导种子发芽。萌发率接近100％。培养10天，胚根伸长约1cm(见图1)，培养20天，长成有2片小叶的苗，培养60天后，无菌苗长成带4～5个节的植株，植株高度约为4～5cm。
(3)第一次继代培养：将无菌苗剪切为带2个节的茎段，高度约为2cm，接种于促芽生芽培养基1(在改良MS培养基的基础上添加0.5mg/L的BA、1.0mg/L的GA3、30g/L蔗糖以及7g/L琼脂)上，一共培养了30个茎段。培养60天后，成活率100％，获得30株土沉香无菌苗，每株苗含有8～9个节，增殖倍数为4～4.5倍。
(4)反复继代：将第一次继代获得的无菌苗剪切为带2个节的茎段，接种于促芽生芽培养基上2(在改良MS培养基的基础上添加0.5～1.0mg/L的BA、1.0～2.0mg/L的GA3、25～35g/L蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂)，这里保持蔗糖和琼脂的量不变，通过调整BA和GA3的浓度比例来观察其对土沉香芽生芽途径继代增殖的影响。
结果如表2所示：
由表2可知：其他条件不变，当促芽生芽培养基2中含有1.0mg/L的BA、2.0mg/L的GA3时，对于茎段诱导芽生芽的效果最好，培养60天后，获得30株土沉香无菌苗，每株苗含平均含有9个节，增殖倍数为4.5倍。此时的无菌苗幼苗浓绿色、健壮、叶片大、而且节间长，高为8～10cm；无任何黄化、玻璃化和愈伤组织化的现象出现。
从2014年7月到现在，以60天为一个周期，在该培养基上反复继代4次，加上初次继代培养，总共进行了5次继代培养，因为时间的关系，所以暂时没进行更多次的继代培养；但是就目前5次继代培养后的情况(见图2)来看，进行更多次的继代培养也是非常可行的。
通过5次继代培养，获得数量可观的无菌土沉香苗，为进一步生根和移栽打下良好的基础。
实施例2
2014年7月20日从博罗林业科学研究所采集土沉香外植体30个，经芽生芽途径离体培养快速增殖。具体步骤如下：
(1)果实的采摘和种子的准备：2014年7月20日，在广东省博罗林业科学研究所选取健壮的土沉香母树，采摘成熟但未开裂的果实，当天拿回实验室，保存在4℃冰箱。
(2)外植体无菌处理及无菌苗的诱导：2014年7月21日，在超净工作台上，用75％v/v的酒精擦拭果实进行表面消毒，再剥开果实，取出种子。接下来选取成熟、饱满、无损伤的种子，用镊子和刀片剥去种皮。将种胚置于三角瓶内，加入75％的酒精浸泡25s，无菌水清洗1次，再用质量百分比浓度为0.1％的升汞溶液浸泡9分钟，无菌水清洗6～8次，吸干水分后接种在初代培养基上诱导种子发芽。培养60天后，无菌苗长成带4～5个节的植株。
(3)第一次继代培养：将无菌苗剪切为带2个节的茎段，接种于促芽生芽培养基上培养1(在改良MS培养基的基础上添加0.6mg/L的BA、1.2mg/L的GA3、30g/L蔗糖以及7g/L琼脂)，一共培养了30个茎段。培养60天后，成活率100％，获得30株土沉香无菌苗，每株苗含有8～9个节，增殖倍数为4～4.5倍。
(4)反复继代：将第一次继代获得的无菌苗剪切为带2个节的茎段，分别接种于促芽生芽培养基2(在改良MS培养基的基础上添加1.0mg/L的BA、2.0mg/L的GA3、30g/L蔗糖以及7g/L琼脂)上，植株在60天后增殖倍数为4～5倍，此时的无菌苗幼苗浓绿色、健壮、叶片大、节间长，高为8～10cm，包含8～10个茎段，见图3。
在该培养基上反复继代4次，得到的无菌苗生长正常，幼苗浓绿色、健壮、叶片大、节间长；无任何黄化、玻璃化和愈伤组织化的现象出现。
对比实验：
促芽生芽培养基中不同浓度BA和GA3对土沉香芽生芽途径继代增殖的影响
选取实施例1中初代培养基上培养的土沉香无菌苗，通过调整BA和GA3的浓度(促芽生芽培养基其他成分不变)，来观察BA和GA3浓度对于对土沉香芽生芽途径继代增殖的影响。
实验设计及结果如下，见表3：
由表3可知：本发明以BA0.1mg/L为对照，在加大BA浓度的同时增加GA3的使用并增大其浓度，以消除单独使用较高BA浓度而带来的严重愈伤组织化和玻璃化，取得成功。同时，本发明还发现单独添加BA或者GA3，不能有效促进土沉香茎段的芽生芽，必须将BA和GA3在一定浓度范围内配合使用，既保证茎段的增殖和伸长并在节的部位形成明显的腋芽以利于下一阶段的增殖，又能避免愈伤组织化、玻璃化和黄化。
Claims (6)
1.一种促进土沉香离体芽生芽的培养基，由以下三部分组成：
1)初代培养基：在改良MS培养基的基础上添加25～35g/L蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂；
2)促芽生芽培养基1：在改良MS培养基的基础上添加0.5～0.6mg/L的BA、1.0～1.2mg/L的GA3、25～35g/L蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂；
3)促芽生芽培养基2：在改良MS培养基的基础上添加0.5～1.0mg/L的BA、1.0～2.0mg/L的GA3、25～35g/L蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂；
所述改良MS培养基为大量元素减半的MS培养基。
2.根据权利要求1述的培养基，其特征在于：促芽生芽培养基1为在改良MS培养基的基础上添加0.5mg/L的BA、1.0 mg/L的GA3、30g/L蔗糖以及7g/L琼脂。
3.根据权利要求1述的培养基，其特征在于：促芽生芽培养基2为在改良MS培养基的基础上添加1.0mg/L的BA、2.0 mg/L的GA3、30g/L蔗糖以及7g/L琼脂。
4.一种促进土沉香离体芽生芽的快速增殖方法，包括以下步骤：
1)选取健壮的土沉香母树，采摘成熟果实并选取饱满、粒大、无损伤的种子作为外植体；
2)在无菌条件下，对尚未裂开的果实进行表面消毒后，剥开果实、取出种子，去除种皮，置于容器内，通过消毒综合处理后，接种在初代培养基上诱导无菌苗；
3)将步骤2）中获得的无菌苗剪切为带不少于两个节的茎段，接种于促芽生芽培养基1上进行初次继代培养；
4)将步骤3）中获得的无菌苗剪切为带不少于两个节的茎段，接种于促芽生芽培养基2上，反复继代数次；
其中初代培养基、促芽生芽培养基1和促芽生芽培养基2如权利要求1～3任一项所述。
5.根据权利要求4所述的快速增殖方法，其特征在于：步骤2）消毒综合处理过程包括加入70～75％v/v的酒精浸泡25～40s，无菌水清洗干净，再用质量百分比浓度为0.08～0.12％的升汞溶液浸泡8～10min，无菌水清洗6～8次，无菌滤纸吸干表面水分。
6.根据权利要求4所述的快速增殖方法，其特征在于：步骤2）～4）中的培养条件均为：24～26℃、光照10～14h/d、光照强度2500～3500lx。
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