CN109392711A - 一种香芋种苗的快速繁育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种香芋种苗的快速繁育方法，包括外植体选取与消毒、改良MS培养基制备、不定芽诱导、继代增殖、无菌生根、组培苗炼苗与假植、组培苗移栽与子芋培养的步骤。本发明将多种不同配方的培养基应用在香芋组培苗生产上，根据生产需求调整培养基配方，能有效提高繁殖系数，结合田间扩繁种技术能降低生产成本，生产周期短，香芋种植效益大大提高；能够有效缓解香芋严重供应不足的问题，也为种植者提供良好的经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种组织培养技术，尤其涉及一种香芋种苗的快速繁育方法。
背景技术
香芋属豆科土栾儿属中的栽培种，多年生草本植物，既是蔬菜，又是粮食。其营养丰富，含有大量的淀粉、蛋白质、矿物质及维生素等多种成分，由于芋头的淀粉颗粒小，其消化率可达98.8％，可制成芋粉及芋泥馅以延长保鲜期。其中广东乐昌张溪香芋较为有名，个头大、体形长、皮薄、纤维少，香味浓、口感好，深受市场的认可，往往供不应求。并在2008年10月31日，原国家质检总局批准对“张溪香芋”实施地理标志产品保护。
香芋为无性繁殖，主要依靠子芋，繁殖系数较低同时成本较高。近年来香芋受到软腐病和疫病的危害严重，子芋往往带有病菌，导致生产上病害日益严重。目前虽有一些芋头品种已经成功建立了组织培养技术体系，但是还没有香芋相关的报道，也没有进行香芋工厂化生产。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于为了培育健康的香芋种苗，提供一种快速，低成本的香芋种苗繁育方法。本发明将多种不同配方的培养基应用在香芋组培苗生产上，能有效提高繁殖系数，结合田间扩繁种技术能降低生产成本，生产周期短，香芋种植效益大大提高；能够有效缓解香芋严重供应不足的问题，也为种植者提供良好的经济效益。
本发明的目的采用如下技术方案实现：一种香芋种苗的快速繁育方法，包括如下步骤：
外植体选取与消毒：选取生长健康的香芋幼嫩的球茎或顶芽作为外植体，并进行消毒处理；
改良MS培养基制备：在MS培养基中添加抗坏血酸，核黄素和柠檬酸钠，其他组分均无变化，得到改良MS培养基；
不定芽诱导：将消毒的外植体切割成(0.3-0.4)×(0.3-0.5)cm的单芽，然后接种于不定芽诱导培养基中，进行诱导培养18-22天，得到香芋不定芽；
继代增殖：将得到的香芋不定芽切割，接入继代增殖培养基中，进行继代增殖培养20-25天，得到香芋丛芽；
无菌生根：将获得的香芋丛芽进行切繁，并保持每株均有一个不定芽，接入无菌生根培养基中，进行生根培养15-25天，得到香芋幼苗；
组培苗炼苗与假植：香芋幼苗生长至根长0.3cm、苗高5cm后，将培养瓶瓶盖打开，室内炼苗培养5-7天，然后洗净根部培养基，移入64孔的穴盘或移入直径为3cm，高度为8cm的营养杯中，基质为泥炭土与园土的混合物；
组培苗移栽与子芋培养：香芋幼苗假植到苗高10cm以上后，进行大田种植，在12月-第二年3月份时开始收获子芋，存放在冷凉通风处。
进一步地，在外植体选取与消毒的步骤中，外植体用中性洗涤剂洗涤球茎，以去除表面的污垢，然后去除多余的叶片，干净纸巾吸干表面水分；在超净工作台上，将单芽切下，先用65-70％酒精浸泡10-30s，再用无菌水冲洗3-5次，每次3-5min；立即转入0.1-0.3％的升汞溶液中消毒8-12min，最后用无菌水洗涤3-5次，每次3-5min，得到消毒外植体。
进一步地，在改良MS培养基制备的步骤中，所述抗坏血酸在改良MS培养基中的浓度3-8mg/L；所述核黄素在改良MS培养基中的浓度为0.2-1mg/L；所述柠檬酸在改良MS培养基中的浓度为0.2-1mg/L。
进一步地，在不定芽诱导的步骤中，所述不定芽诱导培养基的配方为在所述改良MS培养基上添加6-BA和NAA；所述6-BA在不定芽诱导培养基中的浓度为0.05-0.2mg/L，所述NAA在不定芽诱导培养基中的浓度为0.05-0.5mg/L；所述诱导培养的条件如下：温度为26±3℃，湿度为50-80％，光照时间为14小时/天，光照强度为800-12001x。
进一步地，在继代增殖的步骤中，所述继代增殖培养基的配方为在所述改良MS培养基的基础上添加6-BA和NAA，其中6-BA在继代增殖培养基中的浓度为0.5-2mg/L，NAA在继代增殖培养基中的浓度为0.05-0.5mg/L；所述继代增殖培养的条件如下：温度为(26-28)±3℃，湿度为50-65％，光照时间为14小时/天，光照强度为800-12001x。
进一步地，在无菌生根的步骤中，所述无菌生根培养基的配方为在所述改良MS培养基的基础上添加IBA和NAA，其中IBA在无菌生根培养基中的浓度为0.1-1mg/L，NAA在无菌生根培养基中的浓度为0.5-5mg/L；所述生根培养条件如下：培养温度为28±3℃，湿度为70-85％，光照时间为14小时/天，光照强度为800-12001x。
进一步地，在炼苗与移栽的步骤中，所述基质中泥炭土与园土的用量比例为5：1。
进一步地，在组培苗移栽与子芋培养的步骤中，田间种植密度为2000-3000株/亩，每公顷施腐熟有机肥≥7.5吨；培土2-3次；6月至9月灌水降温。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明根据香芋的生长特性，利用植物组织培养技术和田间繁育技术进行香芋种苗的生产，能够在短期内大量提供香芋的组培苗，同时通过田间扩繁，能够生产大量种芋，保障期香芋产业对种苗的需求。香芋组培苗的生产是在MS培养基的基础上进行优化，配制出适合香芋不定芽诱导、继代增殖和生根的培养基。香芋的组培苗经过驯化，假植，在田间进行种植，收获子芋作为种芋用于生产。降低种苗的生产成本，同时也能促进香芋的标准化生产，提高种植和销售者的收入，促进香芋产业的发展。本发明将多种不同配方的培养基应用在香芋组培苗生产上，能有效提高繁殖系数，结合田间扩繁种技术能降低生产成本，生产周期短，香芋种植效益大大提高；能够有效缓解香芋严重供应不足的问题，也为种植者提供良好的经济效益。
附图说明
图1为本发明实施例1香芋外植体经不定芽诱导的照片；
图2为本发明实施例1香芋外植体经继代增殖的照片；
图3为本发明实施例1香芋组培苗瓶苗的照片；
图4为本发明实施例1香芋组培苗袋苗的照片；
图5为本发明实施例1香芋组培苗练苗的照片。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
一种香芋种苗的快速繁育方法，包括如下步骤：
外植体选取与消毒：选取生长健康的香芋幼嫩的球茎或顶芽作为外植体，并进行消毒处理；
改良MS培养基制备：在MS培养基中添加抗坏血酸，核黄素和柠檬酸钠，其他组分均无变化，得到改良MS培养基；
不定芽诱导：将消毒的外植体切割成(0.3-0.4)×(0.3-0.5)cm的单芽，然后接种于不定芽诱导培养基中，进行诱导培养18-22天，得到香芋不定芽；
继代增殖：将得到的香芋不定芽切割，接入继代增殖培养基中，进行继代增殖培养20-25天，得到香芋丛芽；
无菌生根：将获得的香芋丛芽进行切繁，并保持每株均有一个不定芽，接入无菌生根培养基中，进行生根培养15-25天，得到香芋幼苗；
组培苗炼苗与假植：香芋幼苗生长至根长0.3cm、苗高5cm后，将培养瓶瓶盖打开，室内炼苗培养5-7天，然后洗净根部培养基，移入64孔的穴盘或移入直径为3cm，高度为8cm的营养杯中，基质为泥炭土与园土的混合物；
组培苗移栽与子芋培养：香芋幼苗假植到苗高10cm以上后，进行大田种植，在12月-第二年3月份时开始收获子芋，存放在冷凉通风处。
作为进一步的实施方式，在外植体选取与消毒的步骤中，外植体用中性洗涤剂洗涤球茎，以去除表面的污垢，然后去除多余的叶片，干净纸巾吸干表面水分；在超净工作台上，将单芽切下，先用65-70％酒精浸泡10-30s，再用无菌水冲洗3-5次，每次3-5min；立即转入0.1-0.3％的升汞溶液中消毒8-12min，最后用无菌水洗涤3-5次，每次3-5min，得到消毒外植体。
作为进一步的实施方式，在改良MS培养基制备的步骤中，所述抗坏血酸在改良MS培养基中的浓度3-8mg/L；所述核黄素在改良MS培养基中的浓度为0.2-1mg/L；所述柠檬酸在改良MS培养基中的浓度为0.2-1mg/L。
作为进一步的实施方式，在不定芽诱导的步骤中，所述不定芽诱导培养基的配方为在所述改良MS培养基上添加6-BA和NAA；所述6-BA在不定芽诱导培养基中的浓度为0.05-0.2mg/L，所述NAA在不定芽诱导培养基中的浓度为0.05-0.5mg/L；所述诱导培养的条件如下：温度为26±3℃，湿度为50-80％，光照时间为14小时/天，光照强度为800-12001x。
作为进一步的实施方式，在继代增殖的步骤中，所述继代增殖培养基的配方为在所述改良MS培养基的基础上添加6-BA和NAA，其中6-BA在继代增殖培养基中的浓度为0.5-2mg/L，NAA在继代增殖培养基中的浓度为0.05-0.5mg/L；所述继代增殖培养的条件如下：温度为(26-28)±3℃，湿度为50-65％，光照时间为14小时/天，光照强度为800-12001x。
作为进一步的实施方式，在无菌生根的步骤中，所述无菌生根培养基的配方为在所述改良MS培养基的基础上添加IBA和NAA，其中IBA在无菌生根培养基中的浓度为0.1-1mg/L，NAA在无菌生根培养基中的浓度为0.5-5mg/L；所述生根培养条件如下：培养温度为28±3℃，湿度为70-85％，光照时间为14小时/天，光照强度为800-12001x。
作为进一步的实施方式，在炼苗与移栽的步骤中，所述基质中泥炭土与园土的用量比例为5：1。
作为进一步的实施方式，在组培苗移栽与子芋培养的步骤中，田间种植密度为2000-3000株/亩，每公顷施腐熟有机肥≥7.5吨；培土2-3次；6月至9月灌水降温。
以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中所采用的原材料、设备等除特殊限定外均可以通过购买方式获得。
实施例1：
如图1-5所示，一种香芋种苗的快速繁育方法，包括以下步骤：
(1)外植体选取与消毒：
①选取生长健康的香芋幼嫩的球茎作为外植体，
②用中性洗涤剂洗涤球茎，以去除表面的污垢，然后去除多余的叶片，干净纸巾吸干表面水分，
③在超净工作台上，先用70％酒精浸泡10-30s，再用无菌水冲洗3次，每次3-5min，
④立即转入0.1-0.3％的升汞溶液中消毒8-12min，最后用无菌水洗涤3-5次，每次3-5min，得到消毒外植体；
(2)改良MS培养基的制备：
改良MS培养基的配方为：在MS培养基中添加抗坏血酸，核黄素和柠檬酸钠，其他组分均无变化；其中坏血酸的浓度3mg/L，核黄素浓度为1mg/L，柠檬酸的浓度为1mg/L；
(3)不定芽诱导：
将步骤(1)得到的消毒外植体切割成0.4×0.5cm的单芽，然后接种于不定芽诱导培养基，进行诱导培养18-22天，得到香芋不定芽，如图1所示；诱导培养条件如下：温度为26±3℃，湿度为50-80％，光照时间为14小时/天，光照强度为800-12001x；所述不定芽诱导培养基的配方为：在所述改良MS培养基上添加6-BA和NAA；其中6-BA的浓度为1mg/L，NAA的浓度为0.2mg/L；
(4)继代增殖：
将步骤(3)得到的香芋不定芽接入用于继代增殖的培养基，进行继代培养20-25天，得到香芋丛芽，如图2所示；继代增殖培养条件如下：温度为26±3℃，湿度为50-65％，光照时间为14小时/天，光照强度为800-12001x；所述用于继代增殖的培养基的配方为：在所述改良MS培养基的基础上添加6-BA和NAA，其中6-BA的浓度为1mg/L，NAA的浓度为0.2mg/L；
(5)无菌生根：
将步骤(4)获得的香芋丛芽进行切繁，并保持每株均有一个不定芽，接入无菌生根培养基中进行生根培养15-20天，得到香芋幼苗；生根培养条件如下：培养温度为28±3℃，湿度为70-85％，光照时间为14小时/天，光照强度为800-12001x；所述无菌生根培养基的配方为：在所述改良MS培养基的基础上添加IBA和NAA，其中IBA的浓度为0.2mg/L，NAA的浓度为1mg/L；
(6)组培苗炼苗与假植
步骤(5)中香芋幼苗生长至根长0.3cm、苗高5cm后，将培养瓶瓶盖打开，室内炼苗培养5-7天，然后洗净根部培养基，移入采用64孔的穴盘，基质为泥炭土与园土，比例为5：1。
(7)组培苗移栽与子芋培养
步骤(6)中香芋幼苗假植到苗高10cm以上后进行大田种植。田间种植密度为2000-3000株/亩。每公顷施腐熟有机肥≥7.5吨；培土2-3次；6月至9月灌水降温。在12月-第二年3月份左右开始收获子芋，存放在冷凉通风处。
实施例2：
一种香芋种苗的快速繁育方法，包括以下步骤：
(1)外植体选取与消毒：
①选取生长健壮的香芋幼嫩的顶芽作为外植体，
②除多余的叶片，取含有顶芽约2-3cm长的顶端，用中性洗涤剂洗涤茎尖，以去除枝条表面的污垢，然后用干净纸巾吸干表面水分，
③在超净工作台上，先用65％酒精浸泡10-30s，再用无菌水冲洗3-5次，每次3-5min，
④立即转入0.1％的升汞溶液中消毒8-12min，最后用无菌水洗涤3-5次，每次3-5min，得到消毒外植体；
(2)改良MS培养基的制备：
改良MS培养基的配方为：在MS培养基中添加抗坏血酸，核黄素和柠檬酸钠，其他组分均无变化；其中抗坏血酸的浓度3mg/L，核黄素浓度为0.5mg/L，柠檬酸的浓度为0.5mg/L；
(3)不定芽诱导：
将步骤(1)得到的消毒外植体切割成0.3×0.3cm的单芽，然后接种于不定芽诱导培养基中，进行诱导培养18-22天，得到香芋不定芽；诱导培养条件如下：温度为26±3℃，湿度为50-80％，光照时间为14小时/天，光照强度为800-12001x；所述不定芽诱导培养基的配方为：在所述改良MS培养基上添加6-BA和NAA；其中6-BA的浓度为0.5mg/L，NAA的浓度为0.2mg/L；
(4)继代增殖：
将步骤(3)得到的香芋不定芽接入继代增殖的培养基中，进行继代培养20-25天，得到香芋丛芽；继代增殖培养条件如下：温度为28±3℃，湿度为50-65％，光照时间为14小时/天，光照强度为800-12001x；所述继代增殖培养基的配方为：在所述改良MS培养基的基础上添加6-BA和NAA，其中6-BA的浓度为2mg/L，NAA的浓度为0.1mg/L；
(5)无菌生根：
将步骤(4)获得的香芋丛芽进行切繁，并保持每株均有一个不定芽，接入无菌生根培养基中，进行生根培养15-20天，得到香芋幼苗；生根培养条件如下：培养温度为28±3℃，湿度为70-85％，光照时间为14小时/天，光照强度为800-12001x；所述无菌生根培养基的配方为：在所述改良MS培养基的基础上添加IBA和NAA，其中IBA的浓度为0.5mg/L，NAA的浓度为0.4mg/L；
(6)组培苗炼苗与假植
步骤(5)中香芋幼苗生长至根长0.3cm、苗高5cm后，将培养瓶瓶盖打开，室内炼苗培养5-7天，然后洗净根部培养基，移入采用64孔的穴盘，基质为泥炭土与园土，比例为5：1。
(7)组培苗移栽与子芋培养
步骤(6)中香芋幼苗假植到苗高10cm以上后进行大田种植，其中田间种植密度为2000-3000株/亩。每公顷施腐熟有机肥≥7.5吨；培土2-3次；6月至9月灌水降温。在12月-第二年3月份左右开始收获子芋，存放在冷凉通风处。
实施例3：
一种香芋种苗的快速繁育方法，包括以下步骤：
(1)外植体选取与消毒：
①选取生长健壮的香芋幼嫩的顶芽作为外植体，
②除多余的叶片，取含有顶芽约2-3cm长的顶端，用中性洗涤剂洗涤茎尖，以去除枝条表面的污垢，然后用干净纸巾吸干表面水分，
③在超净工作台上，先用65％酒精浸泡10-30s，再用无菌水冲洗3-5次，每次3-5min，
④立即转入0.1％的升汞溶液中消毒8-12min，最后用无菌水洗涤3-5次，每次3-5min，得到消毒外植体；
(2)改良MS培养基的制备：
改良MS培养基的配方为：在MS培养基中添加抗坏血酸，核黄素和柠檬酸钠，其他组分均无变化；其中抗坏血酸的浓度5mg/L，核黄素浓度为0.2mg/L，柠檬酸的浓度为0.2mg/L；
(3)不定芽诱导：
将步骤(1)得到的消毒外植体切割成0.3×0.3cm的单芽，然后在垂直纵切2刀，分为4份；接种于不定芽诱导培养基中，进行诱导培养18-22天，得到香芋不定芽；诱导培养条件如下：温度为26±3℃，湿度为50-80％，光照时间为14小时/天，光照强度为800-12001x；所述不定芽诱导培养基的配方为：在所述改良MS培养基上添加6-BA和NAA；其中6-BA的浓度为2mg/L，NAA的浓度为0.2mg/L；
(4)继代增殖：
将步骤(3)得到的香芋不定芽接入继代增殖培养基中，进行继代培养20-25天，得到香芋丛芽；继代增殖培养条件如下：温度为26±3℃，湿度为50-65％，光照时间为14小时/天，光照强度为800-12001x；所述继代增殖培养基的配方为：在所述改良MS培养基的基础上添加6-BA和NAA，其中6-BA的浓度为2mg/L，NAA的浓度为0.1mg/L；
(5)无菌生根：
将步骤(4)获得的香芋丛芽进行切繁，并保持每株均有一个不定芽，接入无菌生根培养基中进行生根培养15-20天，得到香芋幼苗；生根培养条件如下：培养温度为28±3℃，湿度为70-85％，光照时间为14小时/天，光照强度为800-12001x；所述无菌生根培养基的配方为：在所述改良MS培养基的基础上添加IBA和NAA，其中IBA的浓度为0.4mg/L，NAA的浓度为0.4mg/L；
(6)组培苗炼苗与假植
步骤(5)中香芋幼苗生长至根长0.3cm、苗高5cm后，将培养瓶瓶盖打开，室内炼苗培养5-7天，然后洗净根部培养基，移入采用直径为3cm，高度为8cm的营养杯中，基质为泥炭土与园土，比例为5：1。
(7)组培苗移栽与子芋培养
步骤(6)中香芋幼苗假植到苗高10cm以上后进行大田种植。田间种植密度为2000-3000株/亩。每公顷施腐熟有机肥≥7.5吨；培土2-3次；6月至9月灌水降温。在12月-第二年3月份左右开始收获子芋，存放在冷凉通风处。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种香芋种苗的快速繁育方法，其特征在于，包括如下步骤：
外植体选取与消毒：选取生长健康的香芋幼嫩的球茎或顶芽作为外植体，并进行消毒处理；
改良MS培养基制备：在MS培养基中添加抗坏血酸，核黄素和柠檬酸钠，其他组分均无变化，得到改良MS培养基；
不定芽诱导：将消毒的外植体切割成(0.3-0.4)×(0.3-0.5)cm的单芽，然后接种于不定芽诱导培养基中，进行诱导培养18-22天，得到香芋不定芽；
继代增殖：将得到的香芋不定芽切割，接入继代增殖培养基中，进行继代增殖培养20-25天，得到香芋丛芽；
无菌生根：将获得的香芋丛芽进行切繁，并保持每株均有一个不定芽，接入无菌生根培养基中，进行生根培养15-25天，得到香芋幼苗；
组培苗炼苗与假植：香芋幼苗生长至根长0.3cm、苗高5cm后，将培养瓶瓶盖打开，室内炼苗培养5-7天，然后洗净根部培养基，移入64孔的穴盘或移入直径为3cm，高度为8cm的营养杯中，基质为泥炭土与园土的混合物；
组培苗移栽与子芋培养：香芋幼苗假植到苗高10cm以上后，进行大田种植，在12月-第二年3月份时开始收获子芋，存放在冷凉通风处。
2.如权利要求1所述的快速繁育方法，其特征在于，在外植体选取与消毒的步骤中，外植体用中性洗涤剂洗涤球茎，以去除表面的污垢，然后去除多余的叶片，干净纸巾吸干表面水分；在超净工作台上，将单芽切下，先用65-70％酒精浸泡10-30s，再用无菌水冲洗3-5次，每次3-5min；立即转入0.1-0.3％的升汞溶液中消毒8-12min，最后用无菌水洗涤3-5次，每次3-5min，得到消毒外植体。
3.如权利要求1所述的快速繁育方法，其特征在于，在改良MS培养基制备的步骤中，所述抗坏血酸在改良MS培养基中的浓度3-8mg/L；所述核黄素在改良MS培养基中的浓度为0.2-1mg/L；所述柠檬酸在改良MS培养基中的浓度为0.2-1mg/L。
4.如权利要求1所述的快速繁育方法，其特征在于，在不定芽诱导的步骤中，所述不定芽诱导培养基的配方为在所述改良MS培养基上添加6-BA和NAA；所述6-BA在不定芽诱导培养基中的浓度为0.05-0.2mg/L，所述NAA在不定芽诱导培养基中的浓度为0.05-0.5mg/L；所述诱导培养的条件如下：温度为26±3℃，湿度为50-80％，光照时间为14小时/天，光照强度为800-12001x。
5.如权利要求1所述的快速繁育方法，其特征在于，在继代增殖的步骤中，所述继代增殖培养基的配方为在所述改良MS培养基的基础上添加6-BA和NAA，其中6-BA在继代增殖培养基中的浓度为0.5-2mg/L，NAA在继代增殖培养基中的浓度为0.05-0.5mg/L；所述继代增殖培养的条件如下：温度为(26-28)±3℃，湿度为50-65％，光照时间为14小时/天，光照强度为800-12001x。
6.如权利要求1所述的快速繁育方法，其特征在于，在无菌生根的步骤中，所述无菌生根培养基的配方为在所述改良MS培养基的基础上添加IBA和NAA，其中IBA在无菌生根培养基中的浓度为0.1-1mg/L，NAA在无菌生根培养基中的浓度为0.5-5mg/L；所述生根培养条件如下：培养温度为28±3℃，湿度为70-85％，光照时间为14小时/天，光照强度为800-12001x。
7.如权利要求1所述的快速繁育方法，其特征在于，在炼苗与移栽的步骤中，所述基质中泥炭土与园土的用量比例为5：1。
8.如权利要求1所述的快速繁育方法，其特征在于，在组培苗移栽与子芋培养的步骤中，田间种植密度为2000-3000株/亩，每公顷施腐熟有机肥≥7.5吨；培土2-3次；6月至9月灌水降温。
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