CN102090333B

CN102090333B - 一串红植株的再生方法

Info

Publication number: CN102090333B
Application number: CN 201010542734
Authority: CN
Inventors: 刘辉; 张国平; 沈国正; 傅巧娟; 陈一; 方献平
Original assignee: Zhejiang University ZJU; Hangzhou Institute of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang University ZJU; Hangzhou Institute of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-11-11
Filing date: 2010-11-11
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2030-11-11
Also published as: CN102090333A

Abstract

本发明公开了一串红植株的再生方法，依次包括以下步骤：1)一串红种子消毒；2)无菌培养；3)将无菌培养后所得的种子纵切成两半，然后去掉种皮后切面朝下接种于诱导愈伤培养基上培养；4)将步骤3)所得诱导后产物接种在诱导愈伤培养基上继代1～2次；5)选取步骤4)所得的生长良好的继代后愈伤组织转接到分化培养基上进行不定芽的分化；6)割取步骤5)所得的不定芽作为小苗转接到生根培养基上进行生根培养；直至小苗上长出至少3条且长度≥2cm的不定根；得到可出瓶移栽的种苗；上述步骤1)～步骤6)均在无菌环境中进行。采用该方法能获得大量的一串红再生植株。

Description

一串红植株的再生方法技术领域[0001] 本发明属于农业领域，特别涉及一串红通过愈伤组织获得再生植株的方法。背景技术[0002] 一串红（Salvia splendens Ker-Gawl)属于唇形科(Labiatae)，鼠尾草属（Salvia L)多年生草本植物，原产南美洲热带地区，现在中国各地普遍栽培，常作一年生栽培。一串红以其生长周期短、植株矮壮、适应性强、花色艳丽等特点，被广泛用来布置城市广场、花坛、花境、道路、庭院等，而且其花萼、花冠的红艳色泽为其他花草所不及，宜与浅色花卉配合布置，是中国节日里装点环境、烘托节日喜庆气氛的最为常用的红色草花（李凤兰等，东北农业大学学报,2008，39 (8) :131-135)。[0003] 当前生产上一串红颜色比较单一，只有红色系、白色系和紫色系，而且我国一串红主要应用在“五一”至“十一”期间，这期间我国南方的大部分省份温度远超过一串红的生长适温，由于受种质资源和其它条件的限制，目前我国还没有抗高温的专用一串红品种，因此如果要提高一串红的园林利用价值，就必须培育出新的花色和抗逆性好的一串红品种。利用遗传改良培育观赏植物新品种是减轻环境胁迫条件对花卉观赏品质不利影响的有效措施，也是改变观赏植物花色、提高观赏品质的一条捷径。目前常用的植物转基因方法较成熟的还是通过农杆菌介导，但通过农杆菌介导，植物必须建立起通过愈伤组织途径获得再生植株的再生体系。因此，建立稳定的一串红组织培养再生体系则是开展一串红遗传转化的基础，目前，通过茎段、叶片、根尖等外植体诱导愈伤组织及其分化这一途径获得再生植株的机率相当低，只是偶然性，有时甚至得不到分化苗（杨晓红等，2007，12，农业科技通迅），因此难以满足外源基因的遗传转化要求。发明内容[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种一串红通过愈伤组织途径获得再生植株的方法，采用该方法能获得大量的一串红再生植株，今后可用于一串红外源基因的遗传转化。[0005] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种一串红植株的再生方法，依次包括以下步骤：[0006] 1)、一串红种子消毒：[0007] 2)、无菌培养：[0008] 将消毒后的一串红种子接种在MS固体基本培养基上进行无菌培养22〜^h，培养条件：25士 1°C，暗培养；[0009] 3)、愈伤组织的诱导：[0010] 将无菌培养后所得的种子纵切成两半，然后去掉种皮后切面朝下接种于诱导愈伤培养基上培养15〜20天，培养条件：25 士 1°C，暗培养；[0011] 4)、愈伤组织继代1〜2次：[0012] 将步骤幻所得诱导后产物（包括愈伤组织和长大的子叶等）接种在另一份新的诱导愈伤培养基上继代1〜2次，毎次15〜20天（直至子叶边缘有较多愈伤组织出现为止），培养条件：25 士 1°C，弱光培养，光照强度为50〜IOOmol πΓ2つ—1 ；得继代后愈伤组织；

[0013] 5)、愈伤组织的分化

[0014] 选取步骤4)所得的生长良好的继代后愈伤组织（即选取较为膨松、且质地较硬无玻璃化的继代后愈伤组织）转接到分化培养基上进行不定芽的分化，直至长出3〜5cm的不定芽；培养条件：25士 1°C，需光培养，光照强度为200〜300mol m_2 ·い；

[0015] 6)、再生苗的生根培养：

[0016] 割取步骤幻所得的不定芽作为小苗转接到生根培养基上进行生根培养；直至小苗上长出至少3条且长度> 2cm的不定根；得到可出瓶移栽的种苗；培养条件：25士 1°C，需光培养，光照強度200-300mol m_2 · s—1 ；

[0017] 上述步骤1)〜步骤6)均在无菌环境中进行。

[0018] 作为本发明的一串红植株的再生方法的改进：

[0019] MS固体基本培养基为：MS基本培养基+琼脂6〜8g/L+蔗糖28〜32g/L ；pH值为 5. 7 〜5. 9 ；

[0020] 诱导愈伤培养基为：1/2MS基本培养基+琼脂6〜8g/L+蔗糖28〜32g/L+6_BA 0. 8 〜1. 2mg/L+2，4-D 1. 8 〜2. 2mg/L+水解酪蛋白 0. 4 〜0. 6g/L+脯氨酸 0. 4 〜0. 6g/L, PH值为5. 7〜5. 9;

[0021 ] 分化培养基为：1/2MS基本培养基+琼脂6〜8g/L+蔗糖28〜32g/L+TDZ 1. 8〜 2. 2mg/L+KT 0. 8 〜1. 2mg/L+ 水解酪蛋白 0. 4 〜0. 6g/L+ 脯氨酸 0. 4 〜0. 6g/L，pH 值为 5. 7 〜5. 9 ；

[0022] 生根培养基为：1/2MS固体培养基+琼脂6〜8g/L+蔗糖28〜32g/L+NAA 0. 4〜 0. 6mg/L, pH值为5. 7〜5. 9作为本发明的一串红植株的再生方法的改进：步骤1)的消毒为：在无菌操作台上，选取ー串红优质种子放置于带有过滤网的球状壳体内，先用质量浓度 75%酒精消毒lmin，然后用无菌蒸溜水洗3次，再用质量浓度0. 1% HgCl2溶液消毒8min，最后用无菌蒸溜水冲洗3次。

[0023] 在本发明中：

[0024] 6-BA ：6-苄氨基腺嘌呤，6_Benzylaminopurine ；

[0025] 2，4-D :2，4_ ニ氣苯氧乙酸，2，4-dichlorophenoxyacetic acid ；

[0026] TDZ ：噻苯隆，thidiazuron ；

[0027] KT :6-糠氨基ロ票呤，6-Furfurylamino purine ；；

[0028] NAA :1-萘乙酸。

[0029] 本发明采用成熟的一串红种子为外植体，通过诱导种子成熟胚产生愈伤组织井分化形成不定芽可以获得大量ー串红再生植株；本发明较好地解决了ー串红通过愈伤组织难以获得再生植株的技术难题。本发明的一串红植株的再生方法，能为通过转基因技术来进行一串红育种提供技术支持。

[0030] 采用本发明的方法，步骤5)的愈伤组织分化所需培养时间约为20〜25天，步骤 6)的再生苗生根培养所需培养时间约为10〜20天；因此一般仅需60〜80天即可得到可出瓶种植的种苗。

[0031] 本发明通过种子诱导愈伤组织及其分化这一途径获得再生植株的机率为70%以上，远远高于现有技术的偶然性。

[0032] 本发明的一串红植株的再生方法，是ー种不受季节等因素影响，能高效、快速提供大量ー串红再生苗的方法，该方法可为今后大规模エ厂化生产ー串红种苗和通过转基因等生物技术手段进行ー串红品种改良提供技术支持。

附图说明

[0033] 下面结合附图对本发明的具体实施方式作进ー步详细说明。

[0034] 图1为本发明的步骤1中所用的消毒灭菌用装置。

具体实施方式

[0035] 实施例1、一串红植株的再生方法，依次进行以下步骤：

[0036] 注：以下步骤中所用的培养瓶、培养基（配制完成后）、蒸馏水以及一串红种子的消毒灭菌用装置等要在使用前进行灭菌，灭菌条件：在1. 1个大气压、121°c条件下灭菌20 分钟。

[0037] 1)、一串种子的消毒：

[0038] 在超净工作台上，选取ー串红品种优质种子100〜150粒放置于如图1所示的消毒灭菌用装置内，该消毒灭菌用装置由2个半球状的壳体1组合而成，半球状的壳体1上设有过滤网2。该消毒灭菌用装置可通过市购方式获得。

[0039] 先用质量浓度75%酒精消毒Imin后用无菌蒸馏水洗3次，再用质量浓度0. 1% HgCl2溶液消毒8min，消毒完后再用无菌蒸溜水冲洗3次。

[0040] 由于ー串红种子在水中浸泡后会迅速在表面形成较粘的凝胶物质，这些凝胶物质严重影响ー串红种子的灭菌效果，因此选用上述装置可以使ー串红种子消毒充分且易于冲洗。

[0041] 2)、无菌培养：

[0042] 将消毒后的ー串红种子于MS固体基本培养基上进行无菌培养Mh，培养条件： 25 士 1°C，暗培养；

[0043] MS固体基本培养基为：MS基本培养基+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，pH值为5. 8 ；其制备方法如下：在IL MS基本培养基内加入琼脂7g和蔗糖30g，利用lmol/L的KOH或lmol/ L的HCl调节pH为5.8。

[0044] 3)、愈伤组织的诱导：

[0045] 将步骤2)无菌培养后所得的种子纵切成两半，去掉种皮后切面朝下接种于诱导愈伤培养基上培养18天；培养条件：25 士 1°C，暗培养；得诱导后产物（包括愈伤组织和长大的子叶等）；

[0046] 诱导愈伤培养基为：1/2MS基本培养基+琼脂7g/L+蔗糖30g/L+6_BA lmg/L+2, 4-D 2mg/L+水解酪蛋白0. 5g/L+脯氨酸0. 5g/L，pH值为5. 8 ；其制备方法如下：在IL的 1/2MS基本培养基（即大量元素减半，其他物质同MS基本培养基）内加入琼脂7g、蔗糖30g、 6-BA lmg、2，4-D 2mg、水解酪蛋白 0. 5g和脯氨酸0. 5g，利用 lmol/L 的KOH或 lmol/L 的HCl 调节PH为5. 8。

[0047] 4)、愈伤组织继代1次-2次：[0048] 将步骤幻所得的诱导后产物（包括愈伤组织和长大的子叶等)在新的诱导愈伤培养基上继代2次，毎次15天，此时子叶边缘有较多愈伤组织出现，培养条件：25士 1°C，弱光培养（光照強度50〜IOOmol m_2·。）；得继代后愈伤组织；该诱导愈伤培养基同步骤3) 中所用的诱导愈伤培养基。

[0049] 5)、愈伤组织的分化

[0050] 选取步骤4)所得的生长良好的继代后愈伤组织（即选取较为膨松、且质地较硬无玻璃化的继代后愈伤组织）转接到分化培养基上进行不定芽的分化，直至长出3〜5cm的不定芽（一般约为20〜25天）；培养条件：25 士 1°C，光照強度200〜300mol πΓ2 · s—1 ； [0051 ] 分化培养基为：1/2MS基本培养基+琼脂7g/L+蔗糖30g/L+TDZ 2mg/L+KT lmg/ L+0. 5g/L水解酪蛋白+脯氨酸0. 5g/L，pH值为5. 8 ；其制备方法如下：在IL的1/2MS基本培养基内加入琼脂7g、蔗糖30g、TDZ 2mg、KT lmg、水解酪蛋白0. 5g和脯氨酸0. 5g，利用 lmol/L 的 KOH 或 lmol/L 的 HCl 调节 pH 为 5. 8。

[0052] 6)、再生苗的生根培养：

[0053] 将步骤幻所得的不定芽作为小苗转接到生根培养基上进行生根培养；直至小苗上长出至少3条且长度さ2cm的不定根（一般需要15天左右）；得可出瓶种植的种苗。培养条件:25士 1°C，需光培养(光照強度200〜300mol m_2 · s-1)。

[0054] 生根培养基为：1/2MS固体培养基+琼脂7g/L+蔗糖30g/L+NAA 0. 5mg/L, pH值为 5. 8 ；其制备方法如下：在IL的1/2MS基本培养基内加入琼脂7g、蔗糖30g和NAA 0. 5mg，利用 lmol/L 的 KOH 或 lmol/L 的 HCl 调节 pH 为 5. 8。

[0055] 上述步骤1)〜步骤6)均在无菌环境中进行，整个过程一般需60〜80天。

[0056] 通过种子诱导愈伤组织及其分化这一途径获得再生植株（即可出瓶种植的种苗) 的机率为70%以上。

[0057] 实施例2、再生植株的驯化与移栽：

[0058] 将实施例1所得的再生植株（即可出瓶种植的种苗）连同培养瓶从培养室内取出放在温室内进行炼苗，此时不打开瓶盖，1周后敞开瓶ロ，并加入少量水（加水的量一般控制在培养基上有一层水即可）炼苗2〜3天后进行移栽，温室内的环境为：25士2°C，自然光照。

[0059] 在温室内对ー串红再生苗进行移栽，移栽时洗去根部的培养基，将苗移栽到营养鉢中（土质为营养土和珍珠岩重量比例为8 ： 1)。待小苗长到5cm以上高度吋，带基质移栽至6X IOcm的塑料花盆中，并放于単体棚中，単体棚的环境为：自然光照，温度25-30°C。移栽后要适当遮荫并定时浇水，成活率可达75%以上。

[0060] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1. 一串红植株的再生方法，其特征是依次包括以下步骤：1)、一串红种子消毒：在无菌操作台上，选取一串红优质种子放置于带有过滤网的球状壳体内，先用质量浓度75 %酒精消毒lmin，然后用无菌蒸溜水洗3次，再用质量浓度0. 1 % HgCl2溶液消毒 8min，最后用无菌蒸溜水冲洗3次；2)、无菌培养：将消毒后的一串红种子接种在MS固体基本培养基上进行无菌培养22〜培养条件：25士 10C，暗培养；所述MS固体基本培养基为：MS基本培养基+琼脂6〜8g/L+蔗糖 28 〜32g/L ；pH 值为 5. 7 〜5. 9 ；3)、愈伤组织的诱导：将无菌培养后所得的种子纵切成两半，然后去掉种皮后切面朝下接种于诱导愈伤培养基上培养15〜20天，培养条件：25 士 1°C，暗培养；4)、愈伤组织继代1〜2次：将步骤幻所得诱导后产物接种在诱导愈伤培养基上继代1〜2次，每次15〜20天，培养条件：25士 1°C，弱光培养，光照强度为50-100mol m_2 · s—1 ；得继代后愈伤组织；所述步骤3)和步骤4)中的诱导愈伤培养基均为：1/2MS基本培养基+琼脂6〜8g/L+ 蔗糖沘〜32g/L+6-BA 0. 8 〜1. 2mg/L+2，4_D 1. 8 〜2. 2mg/L+水解酪蛋白 0. 4 〜0. 6g/L+ 脯氨酸0. 4〜0. 6g/L，pH值为5. 7〜5. 9 ；5)、愈伤组织的分化选取步骤4)所得的生长良好的继代后愈伤组织转接到分化培养基上进行不定芽的分化，直至长出3〜5cm的不定芽；培养条件：25士 1°C，需光培养，光照强度为200〜300mol πΓ2 · s—1 ；所述分化培养基为：1/2MS基本培养基+琼脂6〜8g/L+蔗糖28〜32g/L+TDZ 1. 8 〜2. 2mg/L+KT 0. 8 〜1. 2mg/L+ 水解酪蛋白 0. 4 〜0. 6g/L+ 脯氨酸 0. 4 〜0. 6g/L, pH 值为5. 7〜5. 9 ；6)、再生苗的生根培养：割取步骤幻所得的不定芽作为小苗转接到生根培养基上进行生根培养；直至小苗上长出至少3条且长度> 2cm的不定根；得到可出瓶移栽的种苗；培养条件：25士 1°C，需光培养，光照强度200〜300mol m_2 -s"1 ；所述生根培养基为：1/2MS固体培养基+琼脂6〜Sg/ L+ 蔗糖沘〜32g/L+NAA 0. 4 〜0. 6mg/L, pH 值为 5. 7 〜5. 9 ；上述步骤1)〜步骤6)均在无菌环境中进行。