CN109479724B - 一种黑果枸杞花药培养获得紫色愈伤组织的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种获得紫色愈伤组织，尤其是涉及一种黑果枸杞花药培养获得紫色愈伤组织的方法，该方法为首先选取黑果枸杞花蕾，然后将花蕾消毒、消毒后的花蕾放置在愈伤组织诱导培养基中培养获取紫色愈伤组织、并对紫色愈伤组织进行继代培养、继代培养稳定后的愈伤组织进行多酚类物质的测定，采用HPLC‑MS分析方法鉴定所得愈伤组织中多酚类物质，最后选取花色苷含量高的愈伤组织，挑取表层略带里层的紫色愈伤组织作为接种材料，即可获得大量黑果枸杞紫色愈伤组织细胞培养物；本发明方法独特、具有安全无毒、成本低、周期短、繁殖快、操作简单、诱导率高的特点。

Description

一种黑果枸杞花药培养获得紫色愈伤组织的方法
技术领域
本发明涉及一种获得紫色愈伤组织，尤其是涉及一种黑果枸杞花药培养获得紫色愈伤组织的方法。
背景技术
植物细胞愈伤组织培养(Cell suspension culture)是植物细胞生长的微生物化，已成为植物生物技术中最有用的手段之一。植物中含有大量有用的次生代谢物质，可以为人类提供药品、色素、调味品、香料、兴奋剂、杀虫剂等。使用细胞大规模培养技术可以在可控的和可重复的条件下生产天然产物，而不会受到病虫害、地理、气候、季节等因素的影响，并且产物分离、提取操作相对简单。同时也将对保护人类的生存环境起到很好的作用。由于愈伤组织培养的优点，在植物次生代谢物大规模培养中得到了广泛的应用。利用植物细胞愈伤组织培养可以生产用于预防和治疗疾病的植物次生代谢产物。
黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)，系茄科(Solanceae)枸杞属(lycium L.)，果实成熟后紫黑色。黑果枸杞富含天然活性成分花色苷，其成熟浆果中富含花色苷等活性物质远高于其他有色果实，是近年来新发掘的多年生耐盐、抗旱野生枸杞资源。花色苷是一类广泛地存在于植物中的水溶性天然色素，结构上属于总酚中的类黄酮化合物。自然状态下花色苷常与各种单糖形成花色苷，由于具有吸旋光性而表现出红色、紫色和蓝色等色彩。大量研究表明，花色苷具有抗氧化、抗突变、抗增生预防心脑血管疾病、保护肝脏、抑制肿瘤细胞发生等多种生理功能，其抗氧化效果分别是维生素C、维生素E的20倍和 50倍，能清除氧自由基；有预防和治疗100多种疾病的作用。目前，花色苷已被广泛用作葡萄酒、饮料中的添加剂，并应用于保健品和医药品中。因此，花色苷在开发天然色素、保健食品和天然抗氧化剂中有一定研究价值。
因此培养黑果枸杞获得愈伤组织也成为目前利用、开发黑果枸杞产业的必然趋势，目前有中国专利CN104273034A、CN106561448A、CN107135950A、 CN107926711A、公开了获得黑果枸杞愈伤组织及再生植株的方法，这几种方法均是利用黑果枸杞的枝条、叶片、种子诱导愈伤组织获得再生植株。还没有黑果枸杞花药培养获得紫色愈伤组织的方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种方法独特、具有安全无毒、成本低、周期短、繁殖快、操作简单、诱导率高的一种黑果枸杞花药培养获得紫色愈伤组织的方法。
本发明通过如下方式实现：
一种黑果枸杞花药培养获得紫色愈伤组织的方法，其特征在于：该方法为首先选取黑果枸杞花蕾，然后将花蕾消毒、消毒后的花蕾放置在愈伤组织诱导培养基中培养获取紫色愈伤组织、并对紫色愈伤组织进行继代培养、继代培养稳定后的愈伤组织进行多酚类物质的测定，采用HPLC-MS分析方法鉴定所得愈伤组织中多酚类物质，最后选取花色苷含量高的愈伤组织，挑取表层略带里层的紫色愈伤组织作为接种材料，即可获得大量黑果枸杞紫色愈伤组织细胞培养物；
所述黑果枸杞花蕾是在5月份黑果枸杞植株开花期，早晨7点-9点采集H5、 H10、H古树的花蕾，用醋酸洋红压片法镜检鉴定花粉发育时期，选取处于单核中后期的花蕾；
所述花蕾消毒是在超净工作台上，先用75％乙醇溶液浸泡30s，再用0.1％氯化汞溶液消毒10min，最后用无菌水冲洗3-4次，将消毒花蕾放置在事先灭菌好的滤纸上；
所述紫色愈伤组织的获取是在无菌条件下，将花药从花蕾中完整剥离取出，接种到愈伤组织诱导培养基上，放置在室温25-28℃，光照强度2000LX的培养室中培养，光照时间12h· d-1 ，愈伤组织诱导率达到80％，花药接种7-15天后有绿色愈伤组织出现，接种30-35天后，绿色愈伤组织表面开始变为紫色愈伤组织，之后随着培养时间的延长，愈伤组织越来越紫，培养到40-50天时转接继代培养；
所述紫色愈伤组织诱导培养基配方为：MS+2.5mg/L2，4-D+4.0mg/L KT；
所述紫色愈伤组织继代培养是挑取表层略带里层的紫色愈伤组织作为接种材料，接种到继代培养基中，MS+2.5mg/L2，4-D+2.0mg/L KT+2.0mg/L ZT和 MS+2.5mg/L2，4-D+4.0mg/L KT交替继代培养，培养温度25-28℃，光照强度 2000LX，光照时间12h· d-1 ，继代培养30-35天；
所述继代培养基为：MS+2.5mg/L2，4-D+2.0mg/L KT+2.0mg/L ZT和 MS+2.5mg/L2，4-D+4.0mg/L KT；
所述多酚类物质的测定是选取长期继代培养过程中稳定显示紫色的黑果枸杞细胞系分析测定其多酚含量和花色苷含量分别为50mg/100g-70mg/100g和 20mg/100g-35mg/100g；
所述多酚类物质主要成分是采用HPLC-MS分析方法鉴定所得愈伤组织中多酚类物质，其主要成分与黑果枸杞果实中的相同，为矮牵牛素3-O-芸香糖即反式-香豆酰基-5-O-葡萄糖苷。
本发明具有如下效果：
1)操作简单：本发明提供的方法是利用组织培养技术获得紫色愈伤组织，为黑果枸杞花色苷的开发开辟了新的途径，该方法为首先选取黑果枸杞花蕾，然后将花蕾消毒、从消毒后的花蕾中获取紫色愈伤组织、并对紫色愈伤组织进行继代培养、继代培养后进行多酚类物质的测定，采用HPLC-MS分析方法鉴定所得愈伤组织中多酚类物质，最后选取花色苷含量高的愈伤组织，挑取表层略带里层的紫色愈伤组织作为接种材料，即可获得大量黑果枸杞紫色愈伤组织细胞培养物。
2)方法独特：本发明提供的方法中继代培养是挑取表层略带里层的紫色愈伤组织作为接种材料，接种到继代培养基中，MS+2.5mg/L2，4-D+2.0mg/L KT+2.0 mg/L ZT和MS+2.5mg/L2，4-D+4.0mg/L KT交替继代培养，培养温度25-28℃，光照强度2000LX，光照时间12h· d-1 ，继代培养30-35天；所述多酚类物质的测定是选取长期继代培养过程中稳定显示紫色的黑果枸杞细胞系分析测定其多酚含量和花色苷含量分别为50mg/100g-70mg/100g和20mg/100g-35mg/100g；所述多酚类物质主要成分是采用HPLC-MS分析方法鉴定所得愈伤组织中多酚类物质，其主要成分与黑果枸杞果实中的相同，为矮牵牛素3-O-芸香糖即反式-香豆酰基-5-O-葡萄糖苷。
3)取材方式独特：本发明提供取材的方法为：黑果枸杞花蕾是在5月份黑果枸杞植株开花期，早晨7点-9点采集H5、H10、H古树的花蕾，用醋酸洋红压片法镜检鉴定花粉发育时期，选取处于单核中后期的花蕾。
4)具有安全无毒、诱导率高：本发明提供接种的方法在无菌条件下，将花药从花蕾中完整剥离取出，接种到愈伤组织诱导培养基上，放置在室温 25-28℃，光照强度2000LX的培养室中培养，光照时间12h· d-1 ，愈伤组织诱导率达到80％，花药接种7-15天后有绿色愈伤组织出现，接种30-35天后，绿色愈伤组织表面开始变为紫色愈伤组织，之后随着培养时间的延长，愈伤组织越来越紫，培养到40-50天时转接继代培养。
5)成本低：本发明提供的方法通过细胞加代繁殖就可以扩大生产。
6)周期短：本发明提供的方法愈伤组织细胞每30-35天就可以繁殖一代，明显缩短周期。
7)繁殖快：本发明提供的方法通过愈伤组织途径快繁，接种1.5g愈伤组织，一个周期即30-35天就可以生长到10g以上，将近是它的8-10倍，一瓶愈伤组织一个周期可以繁殖30-50瓶，因此可用最快的繁殖速度获得大量的黑果枸杞花色苷。
具体实施方式
实施例一：一种黑果枸杞花药培养获得紫色愈伤组织的方法，该方法如下：
(1)取材：在5月份黑果枸杞植株开花期，早晨7点-9点采集H5、H10、 H古树的花蕾，用醋酸洋红压片法镜检鉴定花粉发育时期，选取处于单核中后期的花蕾；
(2)花蕾消毒：在超净工作台上，先用75％乙醇溶液浸泡30s，再用0.1％氯化汞溶液消毒10min，最后用无菌水冲洗3-4次，将消毒花蕾放置在事先灭菌好的滤纸上；
(3)紫色愈伤组织的获取：无菌条件下，将花药从花蕾中完整剥离取出，接种到愈伤组织诱导培养基上，放置在室温25-28℃，光照强度2000LX的培养室中培养，光照时间12h· d-1 。紫色愈伤组织诱导培养基配方为： MS+2.5mg/L2，4-D+4.0mg/L KT。愈伤组织诱导率达到80％。花药接种13天后有绿色愈伤组织出现，接种31天后，绿色愈伤组织表面开始变为紫色愈伤组织，之后随着培养时间的延长，愈伤组织越来越紫，培养到48天时转接继代培养。
(4)紫色愈伤组织继代培养：挑取表层略带里层的紫色愈伤组织作为接种材料，接种到继代培养基中。继代培养基为：MS+2.5mg/L2，4-D+2.0mg/L KT+2.0mg/L ZT和MS+2.5mg/L2，4-D+4.0mg/L KT交替继代培养，培养温度 25-28℃，光照强度2000LX，光照时间12h· d-1 ，继代培养34天。
(5)多酚类物质的测定：选取长期继代培养过程中稳定显示紫色的黑果枸杞细胞系分析测定其多酚含量和花色苷含量分别为50mg/100g-70mg/100g和 20mg/100g-35mg/100g。
(6)采用HPLC-MS分析方法鉴定所得愈伤组织中多酚类物质，其主要成分与黑果枸杞果实中的相同，为矮牵牛素3-O-芸香糖(反式-香豆酰基)-5-O- 葡萄糖苷。
(7)选取花色苷含量高的愈伤组织，挑取表层略带里层的紫色愈伤组织作为接种材料，即可获得大量黑果枸杞紫色愈伤组织细胞培养物。
实施例二：一种黑果枸杞花药培养获得紫色愈伤组织的方法，该方法如下：
(1)取材：在5月份黑果枸杞植株开花期，早晨7点-9点采集H5、H10、 H古树的花蕾，用醋酸洋红压片法镜检鉴定花粉发育时期，选取处于单核中后期的花蕾；
(2)花蕾消毒：在超净工作台上，先用75％乙醇溶液浸泡30s，再用0.1％氯化汞溶液消毒10min，最后用无菌水冲洗3-4次，将消毒花蕾放置在事先灭菌好的滤纸上；
(3)紫色愈伤组织的获取：无菌条件下，将花药从花蕾中完整剥离取出，接种到愈伤组织诱导培养基上，放置在室温25-28℃，光照强度2000LX的培养室中培养，光照时间12h· d-1 。紫色愈伤组织诱导培养基配方为： MS+2.5mg/L2，4-D+4.0mg/L KT。愈伤组织诱导率达到80％。花药接种7天后有绿色愈伤组织出现，接种30天后，绿色愈伤组织表面开始变为紫色愈伤组织，之后随着培养时间的延长，愈伤组织越来越紫，培养到40天时转接继代培养。
(4)紫色愈伤组织继代培养：挑取表层略带里层的紫色愈伤组织作为接种材料，接种到继代培养基中。继代培养基为：MS+2.5mg/L2，4-D+2.0mg/L KT+2.0mg/L ZT和MS+2.5mg/L2，4-D+4.0mg/L KT交替继代培养，培养温度 25-28℃，光照强度2000LX，光照时间12h· d-1 ，继代培养30天。
(5)多酚类物质的测定：选取长期继代培养过程中稳定显示紫色的黑果枸杞细胞系分析测定其多酚含量和花色苷含量分别为50mg/100g-70mg/100g和 20mg/100g-35mg/100g。
(6)采用HPLC-MS分析方法鉴定所得愈伤组织中多酚类物质，其主要成分与黑果枸杞果实中的相同，为矮牵牛素3-O-芸香糖(反式-香豆酰基)-5-O- 葡萄糖苷。
(7)选取花色苷含量高的愈伤组织，挑取表层略带里层的紫色愈伤组织作为接种材料，即可获得大量黑果枸杞紫色愈伤组织细胞培养物。
实施例三：一种黑果枸杞花药培养获得紫色愈伤组织的方法，该方法如下：
(1)取材：在5月份黑果枸杞植株开花期，早晨7点-9点采集H5、H10、 H古树的花蕾，用醋酸洋红压片法镜检鉴定花粉发育时期，选取处于单核中后期的花蕾；
(2)花蕾消毒：在超净工作台上，先用75％乙醇溶液浸泡30s，再用0.1％氯化汞溶液消毒10min，最后用无菌水冲洗3-4次，将消毒花蕾放置在事先灭菌好的滤纸上；
(3)紫色愈伤组织的获取：无菌条件下，将花药从花蕾中完整剥离取出，接种到愈伤组织诱导培养基上，放置在室温25-28℃，光照强度2000LX的培养室中培养，光照时间12h· d-1 。紫色愈伤组织诱导培养基配方为： MS+2.5mg/L2，4-D+4.0mg/L KT。愈伤组织诱导率达到80％。花药接种15天后有绿色愈伤组织出现，接种35天后，绿色愈伤组织表面开始变为紫色愈伤组织，之后随着培养时间的延长，愈伤组织越来越紫，培养到50天时转接继代培养。
(4)紫色愈伤组织继代培养：挑取表层略带里层的紫色愈伤组织作为接种材料，接种到继代培养基中。继代培养基为：MS+2.5mg/L2，4-D+2.0mg/L KT+2.0mg/L ZT和MS+2.5mg/L2，4-D+4.0mg/L KT交替继代培养，培养温度 25-28℃，光照强度2000LX，光照时间12h· d-1 ，继代培养35天。
(5)多酚类物质的测定：选取长期继代培养过程中稳定显示紫色的黑果枸杞细胞系分析测定其多酚含量和花色苷含量分别为50mg/100g-70mg/100g和 20mg/100g-35mg/100g。
(6)采用HPLC-MS分析方法鉴定所得愈伤组织中多酚类物质，其主要成分与黑果枸杞果实中的相同，为矮牵牛素3-O-芸香糖(反式-香豆酰基)-5-O- 葡萄糖苷。
(7)选取花色苷含量高的愈伤组织，挑取表层略带里层的紫色愈伤组织作为接种材料，即可获得大量黑果枸杞紫色愈伤组织细胞培养物。
实施例四：一种黑果枸杞花药培养获得紫色愈伤组织的方法，该方法如下：
(1)取材：在5月份黑果枸杞植株开花期，早晨7点-9点采集H5、H10、 H古树的花蕾，用醋酸洋红压片法镜检鉴定花粉发育时期，选取处于单核中后期的花蕾；
(2)花蕾消毒：在超净工作台上，先用75％乙醇溶液浸泡30s，再用0.1％氯化汞溶液消毒10min，最后用无菌水冲洗3-4次，将消毒花蕾放置在事先灭菌好的滤纸上；
(3)紫色愈伤组织的获取：无菌条件下，将花药从花蕾中完整剥离取出，接种到愈伤组织诱导培养基上，放置在室温25-28℃，光照强度2000LX的培养室中培养，光照时间12h· d-1 。紫色愈伤组织诱导培养基配方为： MS+2.5mg/L2，4-D+4.0mg/L KT。愈伤组织诱导率达到80％。花药接种10天后有绿色愈伤组织出现，接种32天后，绿色愈伤组织表面开始变为紫色愈伤组织，之后随着培养时间的延长，愈伤组织越来越紫，培养到45天时转接继代培养。
(4)紫色愈伤组织继代培养：挑取表层略带里层的紫色愈伤组织作为接种材料，接种到继代培养基中。继代培养基为：MS+2.5mg/L2，4-D+2.0mg/L KT+2.0mg/L ZT和MS+2.5mg/L2，4-D+4.0mg/L KT交替继代培养，培养温度 25-28℃，光照强度2000LX，光照时间12h· d-1 ，继代培养33天。
(5)多酚类物质的测定：选取长期继代培养过程中稳定显示紫色的黑果枸杞细胞系分析测定其多酚含量和花色苷含量分别为50mg/100g-70mg/100g和 20mg/100g-35mg/100g。
(6)采用HPLC-MS分析方法鉴定所得愈伤组织中多酚类物质，其主要成分与黑果枸杞果实中的相同，为矮牵牛素3-O-芸香糖(反式-香豆酰基)-5-O- 葡萄糖苷。
(7)选取花色苷含量高的愈伤组织，挑取表层略带里层的紫色愈伤组织作为接种材料，即可获得大量黑果枸杞紫色愈伤组织细胞培养物。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术进行等同替换。凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种黑果枸杞花药培养获得紫色愈伤组织的方法，其特征在于：该方法为首先选取黑果枸杞花蕾，然后将花蕾消毒、消毒后的花蕾放置在愈伤组织诱导培养基中培养获取紫色愈伤组织、并对紫色愈伤组织进行继代培养、继代培养稳定后的愈伤组织进行多酚类物质的测定，采用HPLC-MS分析方法鉴定所得愈伤组织中多酚类物质，最后选取花色苷含量高的愈伤组织，挑取表层略带里层的紫色愈伤组织作为接种材料，即可获得大量黑果枸杞紫色愈伤组织细胞培养物，所述紫色愈伤组织诱导培养基配方为：MS+2.5mg/L2，4-D+4.0mg/LKT，所述紫色愈伤组织继代培养是挑取表层略带里层的紫色愈伤组织作为接种材料，接种到继代培养基中交替继代培养，培养温度25-28℃，光照强度2000LX，光照时间12h· d-1，继代培养30-35天，所述继代培养基配方为：MS+2.5mg/L2，4-D+2.0mg/L KT+2.0mg/L ZT和MS+2.5mg/L2，4-D+4.0mg/L KT。
2.如权利要求1所述的一种黑果枸杞花药培养获得紫色愈伤组织的方法，其特征在于：所述花蕾消毒是在超净工作台上，先用75％乙醇溶液浸泡30s，再用0.1％氯化汞溶液消毒10min，最后用无菌水冲洗3-4次，将消毒花蕾放置在事先灭菌好的滤纸上。
3.如权利要求1所述的一种黑果枸杞花药培养获得紫色愈伤组织的方法，其特征在于：所述紫色愈伤组织的获取是在无菌条件下，将花药从花蕾中完整剥离取出，接种到愈伤组织诱导培养基上，放置在室温25-28℃，光照强度2000LX的培养室中培养，光照时间12h·d-1，愈伤组织诱导率达到80％，花药接种7-15天后有绿色愈伤组织出现，接种30-35天后，绿色愈伤组织表面开始变为紫色愈伤组织，之后随着培养时间的延长，愈伤组织越来越紫，培养到40-50天时转接继代培养。
4.如权利要求1所述的一种黑果枸杞花药培养获得紫色愈伤组织的方法，其特征在于：所述多酚类物质的测定是选取长期继代培养过程中稳定显示紫色的黑果枸杞细胞系分析测定其多酚含量和花色苷含量分别为50mg/100g-70mg/100g和20mg/100g-35mg/100g。
5.如权利要求4所述的一种黑果枸杞花药培养获得紫色愈伤组织的方法，其特征在于：所述多酚类物质主要成分是采用HPLC-MS分析方法鉴定所得愈伤组织中多酚类物质，其主要成分与黑果枸杞果实中的相同，为矮牵牛素3-O-芸香糖即反式-香豆酰基-5-O-葡萄糖苷。
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