CN113461649B - 一种可食用刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取纯化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种可食用刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取纯化的方法，首次以刺葡萄愈伤组织细胞为原料提取纯化可食用花色苷，依次通过刺葡萄愈伤组织细胞的获取、刺葡萄愈伤组织细胞的预处理、制备花色苷提取液、花色苷提取液过滤、花色苷提取液浓缩、花色苷浓缩液检测、花色苷纯化和洗脱、及纯化花色苷获取等步骤获取可食用花色苷。本发明具有对刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取效果好、纯度高的显著特征，提取剂采用食品级乙醇与食品级柠檬酸作为混合提取溶剂，溶剂使用量小，无有毒物质残留，具备作为安全性食用花色苷生产的条件，同时采用刺葡萄愈伤组织细胞作为天然花色苷提取材料，该材料具有周年、全天候生产的特性、产量稳定、人为可控性等特点。

Description

一种可食用刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取纯化的方法
【技术领域】
本发明属于植物天然生物活性物质提取纯化技术领域，具体涉及一种可食用刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取纯化的方法。
【背景技术】
花色苷是一种天然的食用色素，具有安全，无毒的特点。花色苷虽然广泛地存在于天然植物中，但依赖天然植物提取花青素具有局限性。目前葡萄花色苷物质提取主要来源于葡萄酒行业的葡萄皮渣，但葡萄皮渣含糖量高、蛋白质高、杂质多，具有无毒化分离成本高，耗时久等缺点，且葡萄皮渣的来源受到市场、气候等条件限制，发展空间有限。随着食品行业的发展，以及人们对食品安全性的重视，在食品加工和保健品等行业对花色苷的需求日益增加，原有的来源途径不足以满足市场需求。因此，在“低碳经济”的条件下，通过刺葡萄细胞培养获取天然次生物质具有较大的可行性和规模化生产的潜力。目前，花色苷提取纯化主要的报道集中在葡萄皮渣等，尚未见到刺葡萄细胞花色苷提取、分离和纯化的报道，本发明通过刺葡萄愈伤组织细胞纯化花色苷的分离，获得食品级纯化花色苷，为通过刺葡萄细胞培养进行规模化、工厂化花色苷提取提供技术支撑，在食品、药品、化妆品等领域具有广泛的应用前景。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题，在于提供一种可食用刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取纯化的方法，该方法对刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取效果好、纯度高、提取剂采用食品级乙醇与食品级柠檬酸作为混合提取溶剂，溶剂使用量小，无有毒物质残留，具备作为安全性食用花色苷生产的条件。
本发明是这样实现的：
一种可食用刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取纯化的方法，包含以下步骤：
(1)刺葡萄愈伤组织细胞的获取：利用植物组织培养技术，将紫红色刺葡萄愈伤组织细胞培养在固体培养集中培养30～35d，即可获得充分成熟的、富含花色苷的刺葡萄愈伤组织细胞；
(2)刺葡萄愈伤组织细胞的预处理：将步骤(1)获得的刺葡萄愈伤组织细胞从培养瓶中取出，去除培养基，收集刺葡萄愈伤组织细胞，用冷冻干燥法或低温真空干燥法进行干燥，获得刺葡萄愈伤组织细胞干品；短时间保存可以置于4℃冰箱中冷藏，长期保存可置于-40℃或-80℃冰箱中冻存；
(3)制备花色苷提取液：取步骤(2)获得的刺葡萄愈伤组织细胞干品，放入破壁匀浆机中，按提取液体体积与刺葡萄愈伤组织细胞干品重量的提取剂料比为18ml:1g的剂量，加入冷冻酸化70％～75％食品级乙醇，匀浆；匀浆后的提取混合液置于超声仪器中，于35℃～45℃、功率300W～400W、提取时间50min～60min，提取刺葡萄愈伤组织细胞中花色苷；超声结束后，于4℃、转速5000rpm～7000rpm，离心10min～15min，取上清；沉淀按上述操作再次加入适当减量的提取剂提取花色苷，重复2次；最后合并上清液，即得刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液；
(4)花色苷提取液过滤：将步骤(3)获得的刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液，通过0.22μm有机滤膜，进行真空抽滤，抽滤后，获得纯净的刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液；
(5)花色苷提取液浓缩：将步骤(4)获得的纯净刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液转入旋转蒸发瓶中，于35℃～45℃水浴中，避光，进行真空蒸发浓缩，将乙醇与花色苷提取液分离，得到刺葡萄愈伤组织细胞花色苷浓缩液；
(6)花色苷浓缩液检测：检测花色苷浓缩液的质量浓度；
(7)花色苷纯化和洗脱：根据步骤(6)检测的花色苷浓缩液质量浓度，用酸化纯净水将花色苷浓缩液的浓度稀释至0.8～1.0mg/mL，将稀释后的花色苷稀释液通过预处理的弱极性或非极性高分子多孔微球的吸附与洗脱，获得纯化后的含有刺葡萄愈伤组织细胞花色苷的洗脱液；
(8)纯化花色苷获取：将步骤(7)获得的纯化花色苷洗脱液，转入旋转蒸发瓶中，于35℃～45℃水浴中，避光，进行真空蒸发浓缩，至不能再蒸发出乙醇为止；获得的蒸发浓缩液预冷冻后，转入冷冻干燥机中，于-45℃～50℃下，真空度15Pa～25Pa，冷冻干燥48～60h，获得纯化花色苷。
进一步地，所述固体培养基为添加了1.0mg/mL2,4-D、30g/L糖、6g/L琼脂粉的MS固体培养基。
进一步地，所述步骤(2)中，所述刺葡萄愈伤组织细胞冷冻干燥具体步骤如下：将收集的刺葡萄愈伤组织细胞，用液氮迅速冷冻5～6min后，转入冷冻干燥机内，于-45℃-50℃、真空度15Pa～25Pa，冷冻干燥72～80h，取出后，获得刺葡萄愈伤组织细胞干品。
进一步地，所述步骤(2)中，所述刺葡萄愈伤组织细胞低温真空干燥具体步骤如下：收集刺葡萄愈伤组织细胞，采用低温真空干燥机进行干燥，温度设置为35℃、真空度20～35Pa，将刺葡萄愈伤组织细胞干燥至恒重，获得刺葡萄愈伤组织细胞干品。
进一步地，所述步骤(3)中，所述冷冻酸化70％～75％食品级乙醇的配制方法如下：首先按纯净水与食品级乙醇的体积比为2.5～3:7～7.5配制70％～75％食品级乙醇溶液；然后按质量体积分数比3～5:100(w/v)，配制含3％～5％柠檬酸的70％～75％食品级乙醇溶液，再将该溶液置于-20℃冰箱中冷冻，即为冷冻酸化食品级乙醇。
进一步地，所述步骤(3)中，花色苷三次提取过程中，提取剂料比如下：首次提取时，提取剂体积与刺葡萄愈伤组织细胞质量的比为18mL:1g；离心后的沉淀进行第二次提取，提取剂体积与刺葡萄愈伤组织细胞质量的比为14mL:1g；再次离心后的沉淀进行第三次提取，提取剂体积与刺葡萄愈伤组织细胞质量的比为10mL:1g。
进一步地，所述步骤(6)所述花色苷浓度检测方法如下：精确称取矢车菊-3-葡萄糖苷标准品50mg，溶解于1mL定溶剂中，得50mg/mL标准液；
将标准液稀释为50μg/mL，再做2倍稀释，得50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.125μg/mL、1.5625μg/mL6个浓度梯度。以定溶剂做空白调0，于酶标仪中测定波长530nm、620nm和650nm下的吸光值，用Greey公式ODλ＝(OD530-OD620)-0.1(OD650-OD620)，准确计算出各浓度花色苷标准品的吸光值，绘制标准曲线；
将刺葡萄愈伤组织细胞花色苷浓缩液稀释至一定倍数，按照花色苷标曲建立的测定步骤测定花色苷提取液吸光值；通过矢车菊-3-葡萄糖苷标准曲线，计算出样品中花色苷的质量浓度；
花色苷含量计算公式：(μg/gDW)＝C×V/W×稀释倍数；其中，C：根据标曲获得花色苷的质量浓度(μg/mL)；V：总反应液体积(mL)；W：细胞干重(g)。
进一步地，所述步骤(7)中，所述酸化纯净水配制过程如下：取纯净水，用适量的柠檬酸调整纯净水的酸碱度，使纯净水的pH为2.0～3.0。
进一步地，所述步骤(7)中，所述预处理的弱极性或非极性高分子多孔微球的方法如下：将弱极性或非极性高分子多孔微球置于无水乙醇中浸泡24～36h，充分溶胀后湿法装柱，用纯净水冲洗，洗至无醇味；接着用0.05～0.1mol/L盐酸洗至流出液呈酸性后浸泡2～4h，再用超纯水洗至中性；最后用1.0～1.5mol/L氢氧化钠溶液洗至流出液呈碱性后浸泡2～4h，最后用纯净水洗至中性。
进一步地，所述步骤(7)中，所述吸附与洗脱步骤如下：将刺葡萄愈伤组织花色苷提取液的稀释液，采用恒流泵泵入处理填充好的弱极性或非极性高分子多孔微球中，流速设置为每分钟3～4mL；待稀释液吸附至柱体30％～40％处停止泵入，静置30～40min，使其充分吸附后，用酸化纯净水冲洗3～4个柱体积，充分去除糖等杂质，再用含3％～5％柠檬酸的75％～80％酸化食品级乙醇解吸附，解吸流速设为每分钟5～6mL；当流出液带有红色时，开始收集洗脱液直至颜色消失。
本发明具有如下优点：
本发明所采用的紫红色刺葡萄愈伤组织细胞稳定性好、生长旺盛，花色苷产量高；本法对刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取效率高、纯度高，提取剂采用食品级乙醇与食品级柠檬酸作为混合提取溶剂，溶剂使用量小，无有毒物质残留，具备作为安全性食用花色苷生产的条件，在食品、医药、化妆品等工业具有广泛应用前景。
本发明有别于传统通过刺葡萄皮进行花色苷提取纯化，其优点在于糖、蛋白质等杂质较果皮少，花色苷物质易分离、纯度高；本发明快速便捷，提取时间短，纯化得率较高，提取设备简易，成本低；获得的花色苷纯化提取物，抗氧化能力强；提取剂采用食品级乙醇与食品级柠檬酸作为混合提取溶剂，溶剂使用量小，无有毒物质残留，具备作为安全性食用花色苷生产的条件，在食品、医药、化妆品等工业具有广泛应用前景。
【具体实施方式】
下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：
1.刺葡萄愈伤组织细胞的培养与获取
利用植物组织培养技术，将紫红色刺葡萄愈伤组织细胞培养在添加了1.0mg/mL2,4-D、30g/L糖、6g/L琼脂粉的MS固体培养基中，培养30～35d，即可获得充分成熟的、富含花色苷的刺葡萄愈伤组织细胞。刺葡萄愈伤组织细胞含水量很高，需要制成干品，才便于于花色苷的提取。
2.刺葡萄愈伤组织细胞的预处理
将获得的刺葡萄愈伤组织细胞从培养瓶中取出，去除培养基，收集获得刺葡萄愈伤组织细胞鲜样。将收集刺葡萄愈伤组织细胞，用液氮迅速冷冻5～6min后，转入冷冻干燥机内，于-45℃-50℃、真空度15Pa，冷冻干燥72h，取出后，获得刺葡萄愈伤组织细胞干品。短时间保存可以置于4℃冰箱中冷藏，长期保存可置于-40℃或-80℃冰箱中冻存。
3.冷冻酸化乙醇制备
首先配制70％～75％食品级乙醇溶液(纯净水与乙醇的体积比为2.5～3:7～7.5)，然后按质量体积分数比3:100，配制含3％～5％柠檬酸的70％～75％食品级乙醇溶液，再将该溶液置于-20℃冰箱中冷冻，即为冷冻酸化食品级乙醇。所用乙醇和柠檬酸均为食品级产品，下同。
4.花色苷提取液的制备
取刺葡萄愈伤组织细胞干品，放入破壁匀浆机中，按提取剂料比为18:1(提取液体积(mL)：刺葡萄愈伤组织细胞干品重量(g))加入冷冻酸化70％～75％食品级乙醇，匀浆；匀浆后的提取混合液置于超声仪器中，于35℃、功率400W、提取时间50min，提取刺葡萄愈伤组织细胞中花色苷；超声结束后，于4℃、转速7000rpm，离心12min，取上清；沉淀按上述操作再次加入适当减量的提取剂提取花色苷，重复2次，具体操作为：离心后的沉淀进行第二次提取，提取剂体积与刺葡萄愈伤组织细胞质量的比为14:1；再次离心后的沉淀进行第三次提取，提取剂体积与刺葡萄愈伤组织细胞质量的比为10:1。最后合并上清液，即得刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液。此法不仅可以充分提取刺葡萄愈伤组织细胞中的花色苷，而且可以极大的节省提取成本。
5.花色苷提取液的过滤
将刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液，通过0.22μm有机滤膜，进行真空抽滤，以去除细胞破碎残渣和大分子蛋白等物质，减少对后期纯化的影响，同时增加纯化后花色苷的纯度。抽滤后，获得纯净的刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液。
6.花色苷提取液的浓缩
将步骤(4)获得的纯净刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液转入旋转蒸发瓶中，于35℃水浴中，避光，进行真空蒸发浓缩，将乙醇与花色苷提取液分离，得到刺葡萄愈伤组织细胞花色苷浓缩液。
7.花色苷浓缩液中花色苷含量检测
(1)花色苷标准曲线绘制
精确称取矢车菊-3-葡萄糖苷标准品50mg，溶解于1mL定溶剂中，得50mg/mL标准液。将标准液稀释为50μg/mL，再做2倍稀释，得50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.125μg/mL、1.5625μg/mL6个浓度梯度。以定溶剂做空白调0，于酶标仪中测定波长530nm、620nm和650nm下的吸光值，用Greey公式ODλ＝(OD530-OD620)-0.1(OD650-OD620)，准确计算出各浓度花色苷标准品的吸光值，绘制标准曲线。
(2)花色苷含量检测
将刺葡萄愈伤组织细胞花色苷浓缩液稀释至一定倍数，按照花色苷标曲建立的测定步骤测定花色苷提取液吸光值。通过矢车菊-3-葡萄糖苷标准曲线，计算出样品中花色苷的质量浓度。花色苷含量计算公式(μg/gDW)＝C×V/W×稀释倍数。C：根据标曲获得花色苷的质量浓度(μg/mL)；V：总反应液体积(mL)；W：细胞干重(g)。
8.花色苷纯化和洗脱
(1)酸化纯净水配制
取纯净水，用适量的柠檬酸调整纯净水的酸碱度，使纯净水的pH为2.0～3.0。
(2)弱极性或非极性高分子多孔微球的预处理
将弱极性或非极性高分子多孔微球置于无水乙醇中浸泡24～36h，充分溶胀后湿法装柱，用纯净水冲洗，洗至无醇味。接着用0.05～0.1mol/L盐酸洗至流出液呈酸性后浸泡2～4h，再用超纯水洗至中性；最后用1.0～1.5mol/L氢氧化钠溶液洗至流出液呈碱性后浸泡2～4h，最后用纯净水洗至中性。
(2)纯化和洗脱
根据花色苷浓缩液质量浓度，用酸化纯净水将花色苷浓缩液的浓度稀释至0.8～1.0mg/mL。将刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液的稀释液，采用恒流泵泵入处理填充好的弱极性或非极性高分子多孔微球中，流速设置为每分钟3～4mL；待稀释液吸附至柱体30％～40％处停止泵入，静置30～40min，使其充分吸附后，用酸化纯净水冲洗3～4个柱体积，充分去除糖等杂质。再用75％～80％酸化食品级乙醇(含3％～5％柠檬酸)解吸附，解吸流速设为每分钟5～6mL。当流出液带有红色时，开始收集洗脱液直至颜色消失。
9.纯化花色苷干品的获取
将获得的纯化花色苷洗脱液，转入旋转蒸发瓶中，于35℃水浴中，避光，进行真空蒸发浓缩，至不能再蒸发出乙醇为止；获得的蒸发浓缩液预冷冻后，转入冷冻干燥机中，于-45℃下，真空度15PaPa，冷冻干燥48h，获得纯化花色苷。刺葡萄愈伤组织细胞纯化花色苷提取率为1.8％，纯度为95.4％。
10.纯化花色苷干品的抗氧化能力
该方法制备的刺葡萄花色苷抗氧化能力强，达到176.89U/g，远高于同类产品，是Vc抗氧化能力的15～20倍。
实施例2：
1.刺葡萄愈伤组织细胞的培养与获取
利用植物组织培养技术，将紫红色刺葡萄愈伤组织细胞培养在附加1.0mg/mL2,4-D、30g/L糖、6g/L琼脂粉的MS固体培养基中，培养30～35d，即可获得充分成熟的、富含花色苷的刺葡萄愈伤组织细胞。刺葡萄愈伤组织细胞含水量很高，需要制成干品，才便于于花色苷的提取。
2.刺葡萄愈伤组织细胞的预处理
将获得的刺葡萄愈伤组织细胞从培养瓶中取出，去除培养基，收集获得刺葡萄愈伤组织细胞鲜样。收集刺葡萄愈伤组织细胞，采用低温真空干燥机进行干燥，温度设置为45℃、真空度35Pa，将刺葡萄愈伤组织细胞干燥至恒重，获得刺葡萄愈伤组织细胞干品。短时间保存可以置于4℃冰箱中冷藏，长期保存可置于-40℃或-80℃冰箱中冻存。
3.冷冻酸化乙醇制备
首先配制70％～75％食品级乙醇溶液(纯净水与乙醇的体积比为2.5～3:7～7.5)，然后按质量体积分数比5:100，配制含5％柠檬酸的70％～75％食品级乙醇溶液，再将该溶液置于-20℃冰箱中冷冻，即为冷冻酸化食品级乙醇。所用乙醇和柠檬酸均为食品级产品，下同。
4.花色苷提取液的制备
取刺葡萄愈伤组织细胞干品，放入破壁匀浆机中，按提取剂料比为18:1(提取液体积(mL)：刺葡萄愈伤组织细胞干品重量(g))加入冷冻酸化70％～75％食品级乙醇，匀浆；匀浆后的提取混合液置于超声仪器中，于45℃、功率300W、提取时间60min，提取刺葡萄愈伤组织细胞中花色苷；超声结束后，于4℃、转速5000rpm，离心10min，取上清；沉淀按上述操作再次加入适当减量的提取剂提取花色苷，重复2次，具体操作为：离心后的沉淀进行第二次提取，提取剂体积与刺葡萄愈伤组织细胞质量的比为14:1；再次离心后的沉淀进行第三次提取，提取剂体积与刺葡萄愈伤组织细胞质量的比为10:1。最后合并上清液，即得刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液。此法不仅可以充分提取刺葡萄愈伤组织细胞中的花色苷，而且可以极大的节省提取成本。
5.花色苷提取液的过滤
将刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液，通过0.22μm有机滤膜，进行真空抽滤，以去除细胞破碎残渣和大分子蛋白等物质，减少对后期纯化的影响，同时增加纯化后花色苷的纯度。抽滤后，获得纯净的刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液。
6.花色苷提取液的浓缩
将步骤(4)获得的纯净刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液转入旋转蒸发瓶中，于45℃水浴中，避光，进行真空蒸发浓缩，将乙醇与花色苷提取液分离，得到刺葡萄愈伤组织细胞花色苷浓缩液。
7.花色苷浓缩液中花色苷含量检测
(1)花色苷标准曲线绘制
精确称取矢车菊-3-葡萄糖苷标准品50mg，溶解于1mL定溶剂中，得50mg/mL标准液。将标准液稀释为50μg/mL，再做2倍稀释，得50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.125μg/mL、1.5625μg/mL6个浓度梯度。以定溶剂做空白调0，于酶标仪中测定波长530nm、620nm和650nm下的吸光值，用Greey公式ODλ＝(OD530-OD620)-0.1(OD650-OD620)，准确计算出各浓度花色苷标准品的吸光值，绘制标准曲线。
(2)花色苷含量检测
将刺葡萄愈伤组织细胞花色苷浓缩液稀释至一定倍数，按照花色苷标曲建立的测定步骤测定花色苷提取液吸光值。通过矢车菊-3-葡萄糖苷标准曲线，计算出样品中花色苷的质量浓度。花色苷含量计算公式(μg/gDW)＝C×V/W×稀释倍数。C：根据标曲获得花色苷的质量浓度(μg/mL)；V：总反应液体积(mL)；W：细胞干重(g)。
8.花色苷纯化和洗脱
(1)酸化纯净水配制
取纯净水，用适量的柠檬酸调整纯净水的酸碱度，使纯净水的pH为2.0～3.0。
(2)弱极性或非极性高分子多孔微球的预处理
将弱极性或非极性高分子多孔微球置于无水乙醇中浸泡24～36h，充分溶胀后湿法装柱，用纯净水冲洗，洗至无醇味。接着用0.05～0.1mol/L盐酸洗至流出液呈酸性后浸泡2～4h，再用超纯水洗至中性；最后用1.0～1.5mol/L氢氧化钠溶液洗至流出液呈碱性后浸泡2～4h，最后用纯净水洗至中性。
(2)纯化和洗脱
根据花色苷浓缩液质量浓度，用酸化纯净水将花色苷浓缩液的浓度稀释至0.8～1.0mg/mL。将刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液的稀释液，采用恒流泵泵入处理填充好的弱极性或非极性高分子多孔微球中，流速设置为每分钟3～4mL；待稀释液吸附至柱体30％～40％处停止泵入，静置30～40min，使其充分吸附后，用酸化纯净水冲洗3～4个柱体积，充分去除糖等杂质。再用75％～80％酸化食品级乙醇(含3％～5％柠檬酸)解吸附，解吸流速设为每分钟5～6mL。当流出液带有红色时，开始收集洗脱液直至颜色消失。
9.纯化花色苷干品的获取
将获得的纯化花色苷洗脱液，转入旋转蒸发瓶中，于45℃水浴中，避光，进行真空蒸发浓缩，至不能再蒸发出乙醇为止；获得的蒸发浓缩液预冷冻后，转入冷冻干燥机中，于-45℃～50℃下，真空度15Pa～25Pa，冷冻干燥48～60h，获得纯化花色苷。刺葡萄愈伤组织细胞纯化花色苷提取率为1.2％，纯度为93.8％。
10.纯化花色苷干品的抗氧化能力
该方法制备的刺葡萄花色苷抗氧化能力强，达到150.55U/g，远高于同类产品，是Vc抗氧化能力的15～20倍。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

Claims (6)

1.一种可食用刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取纯化的方法，其特征在于：包含以下步骤：
(1)刺葡萄愈伤组织细胞的获取：利用植物组织培养技术，将紫红色刺葡萄愈伤组织细胞培养在固体培养集中培养30～35d，即可获得充分成熟的、富含花色苷的刺葡萄愈伤组织细胞；所述固体培养基为添加了1.0mg/mL2,4-D、30g/L糖、6g/L琼脂粉的MS固体培养基；
(2)刺葡萄愈伤组织细胞的预处理：将步骤(1)获得的刺葡萄愈伤组织细胞从培养瓶中取出，去除培养基，收集刺葡萄愈伤组织细胞，用冷冻干燥法或低温真空干燥法进行干燥，获得刺葡萄愈伤组织细胞干品；短时间保存可以置于4℃冰箱中冷藏，长期保存可置于-40℃或-80℃冰箱中冻存；
(3)制备花色苷提取液：取步骤(2)获得的刺葡萄愈伤组织细胞干品，放入破壁匀浆机中，按提取液体体积与刺葡萄愈伤组织细胞干品重量的提取剂料比为18ml:1g的剂量，加入冷冻酸化70％～75％食品级乙醇，匀浆；匀浆后的提取混合液置于超声仪器中，于35℃～45℃、功率300W～400W、提取时间50min～60min，提取刺葡萄愈伤组织细胞中花色苷；超声结束后，于4℃、转速5000rpm～7000rpm，离心10min～15min，取上清；沉淀按上述操作再次加入适当减量的提取剂提取花色苷，重复2次；最后合并上清液，即得刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液；
(4)花色苷提取液过滤：将步骤(3)获得的刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液，通过0.22μm有机滤膜，进行真空抽滤，抽滤后，获得纯净的刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液；
(5)花色苷提取液浓缩：将步骤(4)获得的纯净刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液转入旋转蒸发瓶中，于35℃～45℃水浴中，避光，进行真空蒸发浓缩，将乙醇与花色苷提取液分离，得到刺葡萄愈伤组织细胞花色苷浓缩液；
(6)花色苷浓缩液检测：检测花色苷浓缩液的质量浓度；
(7)花色苷纯化和洗脱：根据步骤(6)检测的花色苷浓缩液质量浓度，用酸化纯净水将花色苷浓缩液的浓度稀释至0.8～1.0mg/mL，将稀释后的花色苷稀释液通过预处理的弱极性或非极性高分子多孔微球的吸附与洗脱，获得纯化后的含有刺葡萄愈伤组织细胞花色苷的洗脱液；
所述酸化纯净水配制过程如下：取纯净水，用适量的柠檬酸调整纯净水的酸碱度，使纯净水的pH为2.0～3.0；
所述预处理的弱极性或非极性高分子多孔微球的方法如下：将弱极性或非极性高分子多孔微球置于无水乙醇中浸泡24～36h，充分溶胀后湿法装柱，用纯净水冲洗，洗至无醇味；接着用0.05～0.1mol/L盐酸洗至流出液呈酸性后浸泡2～4h，再用超纯水洗至中性；最后用1.0～1.5mol/L氢氧化钠溶液洗至流出液呈碱性后浸泡2～4h，最后用纯净水洗至中性；
所述吸附与洗脱步骤如下：将刺葡萄愈伤组织花色苷提取液的稀释液，采用恒流泵泵入处理填充好的弱极性或非极性高分子多孔微球中，流速设置为每分钟3～4mL；待稀释液吸附至柱体30％～40％处停止泵入，静置30～40min，使其充分吸附后，用酸化纯净水冲洗3～4个柱体积，充分去除糖等杂质，再用含3％～5％柠檬酸的75％～80％酸化食品级乙醇解吸附，解吸流速设为每分钟5～6mL；当流出液带有红色时，开始收集洗脱液直至颜色消失；
(8)纯化花色苷获取：将步骤(7)获得的纯化花色苷洗脱液，转入旋转蒸发瓶中，于35℃～45℃水浴中，避光，进行真空蒸发浓缩，至不能再蒸发出乙醇为止；获得的蒸发浓缩液预冷冻后，转入冷冻干燥机中，于-45℃～50℃下，真空度15Pa～25Pa，冷冻干燥48～60h，获得纯化花色苷。
2.根据权利要求1所述的一种可食用刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取纯化的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述刺葡萄愈伤组织细胞冷冻干燥具体步骤如下：将收集的刺葡萄愈伤组织细胞，用液氮迅速冷冻5～6min后，转入冷冻干燥机内，于-45℃-50℃、真空度15Pa～25Pa，冷冻干燥72～80h，取出后，获得刺葡萄愈伤组织细胞干品。
3.根据权利要求1所述的一种可食用刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取纯化的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述刺葡萄愈伤组织细胞低温真空干燥具体步骤如下：收集刺葡萄愈伤组织细胞，采用低温真空干燥机进行干燥，温度设置为35℃、真空度20～35Pa，将刺葡萄愈伤组织细胞干燥至恒重，获得刺葡萄愈伤组织细胞干品。
4.根据权利要求1所述的一种可食用刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取纯化的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述冷冻酸化70％～75％食品级乙醇的配制方法如下：首先按纯净水与食品级乙醇的体积比为2.5～3:7～7.5配制70％～75％食品级乙醇溶液；然后按质量体积(w/v)分数比3～5:100，配制含3％～5％柠檬酸的70％～75％食品级乙醇溶液，再将该溶液置于-20℃冰箱中冷冻，即为冷冻酸化食品级乙醇。
5.根据权利要求1所述的一种可食用刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取纯化的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，花色苷三次提取过程中，提取剂料比如下：首次提取时，提取剂体积与刺葡萄愈伤组织细胞质量的比为18mL:1g；离心后的沉淀进行第二次提取，提取剂体积与刺葡萄愈伤组织细胞质量的比为14mL:1g；再次离心后的沉淀进行第三次提取，提取剂体积与刺葡萄愈伤组织细胞质量的比为10mL:1g。
6.根据权利要求1所述的一种可食用刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取纯化的方法，其特征在于：所述步骤(6)所述花色苷浓度检测方法如下：精确称取矢车菊-3-葡萄糖苷标准品50mg，溶解于1mL定溶剂中，得50mg/mL标准液；
将标准液稀释为50μg/mL，再做2倍稀释，得50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.125μg/mL、1.5625μg/mL 6个浓度梯度，以定溶剂做空白调0，于酶标仪中测定波长530nm、620nm和650nm下的吸光值，用Greey公式ODλ＝(OD530-OD620)-0.1(OD650-OD620)，准确计算出各浓度花色苷标准品的吸光值，绘制标准曲线；
将刺葡萄愈伤组织细胞花色苷浓缩液稀释至一定倍数，按照花色苷标曲建立的测定步骤测定花色苷提取液吸光值；通过矢车菊-3-葡萄糖苷标准曲线，计算出样品中花色苷的质量浓度；
花色苷含量计算公式：μg/g DW＝C×V/W×稀释倍数；其中，C：根据标曲获得花色苷的质量浓度μg/mL；V：总反应液体积mL；W：细胞干重g。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102763593A (zh) * 2012-07-16 2012-11-07 福建省农业科学院农业工程技术研究所 快速获得葡萄松散型愈伤组织及其长期继代保持的方法
CN104804467A (zh) * 2015-05-15 2015-07-29 湖南农业大学 一种刺葡萄色素制备方法
CN106305424A (zh) * 2016-08-25 2017-01-11 文山苗乡三七科技有限公司 一种三七紫色素愈伤组织的继代培养方法
CN109479724A (zh) * 2019-01-14 2019-03-19 宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所 一种黑果枸杞花药培养获得紫色愈伤组织的方法
CN111825730A (zh) * 2019-04-16 2020-10-27 中国农业大学 一种从葡萄皮渣或鲜果果皮中提取分离14种花色苷单体的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102763593A (zh) * 2012-07-16 2012-11-07 福建省农业科学院农业工程技术研究所 快速获得葡萄松散型愈伤组织及其长期继代保持的方法
CN104804467A (zh) * 2015-05-15 2015-07-29 湖南农业大学 一种刺葡萄色素制备方法
CN106305424A (zh) * 2016-08-25 2017-01-11 文山苗乡三七科技有限公司 一种三七紫色素愈伤组织的继代培养方法
CN109479724A (zh) * 2019-01-14 2019-03-19 宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所 一种黑果枸杞花药培养获得紫色愈伤组织的方法
CN111825730A (zh) * 2019-04-16 2020-10-27 中国农业大学 一种从葡萄皮渣或鲜果果皮中提取分离14种花色苷单体的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"ALA 对刺葡萄愈伤组织生长及主要抗氧化物质积累的影响";张静等;《热带作物学报》;20210205;第42卷(第8期);第2305-2312页 *
刺葡萄皮中花色苷的分离纯化与结构鉴定;王维茜等;《农业工程学报》;20160223;第32卷(第04期);第296-301页 *
唐朝晖.生命科学综合设计实验指南.华中科技大学出版社,2018,90-95. *
葡萄花色苷研究进展;邓洁红等;《包装与食品机械》;20061225;第24卷(第06期);第22-28页 *

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